全 文 ：银杏细胞固定化培养及银杏内酯的产生!
于荣敏!，高 越，宋丽艳!，张德志#，叶文才!，姚新生!，
（! 暨南大学药学院，广东 广州 $!%&#； 沈阳药科大学，辽宁 沈阳 !!%%!&；
# 广东药学院，广东 广州 $!%’）
摘要：探讨利用银杏（!#$%& ’(&’) ()）细胞固定化培养方法，大规模生产药用成分银杏内
酯类化合物的可能性。考察了植物生长调节剂对银杏固定化培养细胞生长及发酵液中银杏内
酯类成分产生的影响。结果显示，最优培养基生长调节剂配比为 ，’*+ ,-% ./0( 1 23 %-%’
./0( 1 455 %-’ ./0(。优化培养后，固定化细胞最高生物量出现在第 ! 6，为 %-’ / +70瓶。
发酵液中银杏内酯含量：825在 6时最高（%%!/0(），829在 !, 6时最高（!!/0(），
82:在 !, 6时最高（$%;!/0(）。
关键词：银杏；固定化细胞培养；银杏内酯；<=(:
中图分类号：> ;’$ 文献标识码：5 文章编号：%$# ? @%%（%%’）%# ? %##, ? %@
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40&+.5/(&3 &1 6(378&)(+#-
AB CDE/*FGE!，85H AIJ，KH48 (G*ALE!，M<548 +J*MNG#，
AO 7JE*:LG!，A5H PGE*KNJE/!，
（! *&((+%+ &, -.)/0)12， 3#)# 4#5+/672，8ILE/QNDI $!%&#，:NGEL； 8.+#2)#% -.)/0)1+971)( 4#5+/672，
KNJERLE/ !!%%!&，:NGEL；# !9)#%:&#% *&((+%+ &, -.)/0)12，8ILE/QNDI $!%’，:NGEL）
9’-/025/：:ISTIUJV DW G..DXGSGQJ6 YJSSV DW !#$%& ’(&’) (，LV ZJSS LV TNJ [UD6IYTGDE DW TNJGU VJYDE6LUR
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TNLT TNJ D[TG.GQJ6 YD.XGELTGDE DW /UDZTN UJ/ISLTDUV GV ，’*+ ,-% ./0( 1 23 %-%’ ./0( 1 455 %-’ ./0()
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银杏（!#$%& ’(&’) ()）是古老的中生代孑遗植物，现仅存一科一属一种，故有“活
云 南 植 物 研 究 %%’，=>（#）：##, ^ #’’
95/2 ?&/23(52 @.3323(52
! 基金项目：辽宁省自然科学基金资助项目（项目编号：;@%$;）
收稿日期：%%# ? %; ? ,，%%# ? ! ? %!接受发表
作者简介：于荣敏（!;$$ ?），男，教授，博士，研究方向：利用生物技术方法生产天然产物活性物质；创新药
物的研制开发。 O ? .LGS：UDE/.GERI;;_NDT.LGS- YD.
化石”之称，为我国特产。银杏的种子（中药称白果）作为药用已有 !多年的历史。#
世纪 $年代人们发现银杏叶提取物 %&’（%()*+,) -. !#$%& ’(&’)）对心脑血管疾病有效，
/年代又发现银杏叶中银杏内酯为强血小板活化因子拮抗剂（0-1.-*2 等，34//）。近年
来，%&’的保健、美容、抗衰老作用得到越来越多的实验证明，已有大量保健品、化妆品
上市，经济效益可观（高昱等，344$；林协，#5）。
作者在前期工作（67等，3444；于荣敏等，3444）的基础上，对银杏固定化细胞培
养进行了较为系统的研究，本文报道银杏固定化细胞培养及植物生长调节剂对细胞生长和
培养液中银杏内酯产生的影响。
! 材料与方法
!! 糖的测定
用铁氰化钾法测定培养基中残糖含量（元英进和胡宗定，3448）。
!# 银杏固定化细胞发酵液中银杏内酯类成分的含量测定（9+*:;;<等，3443）
3=#=3 材料来源 培养细胞：选取本课题组诱导并不断继代选育得到的 >?+细胞系（67等，3444）。固
定化材料：采用市售聚氨酯泡沫塑料，将其制成一定边长的立方体，灭菌前加入已分装培养液的瓶中。
3=#=# 仪器 高压液相色谱仪（日本 @ABC+2D7 EFG3H?），IJ?G!H示差检测器，K&EG3!:高速台式离心机
（上海安亭科学仪器厂）。
3=#=5 试剂 银杏内酯 H、:、F（LBM
限公司禹城化工厂），聚酰胺（5 P !目，柱层析用，上海化学试剂站分装），Q?@（! P #!C，瑞士
FR FA;CB; R;)B<-M H&）。
3=#=8 内标物溶液的配制 在室温条件下（约 #S），取苯甲醇（分析纯，2 T 3=8U）#= CN置于 3 CN
的容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀制成 3 CN含 #=4 CL的苯甲醇溶液，作为内标液，脱气，过滤后备用。
3=#=U 样品液的制备 取银杏细胞固定化发酵液，过滤，滤液浓缩后得浓缩液。将浓缩液调 V0值至
8=$U，进行聚酰胺柱层析，蒸馏水洗脱。洗脱液过 Q?@柱，先以己烷洗脱，然后再以甲醇洗脱，洗脱液
浓缩至干，甲醇溶解，过滤，加内标液 #!N，甲醇定容，即得样品液。
3=#=! 色谱条件 色谱柱（?B+C-M1BN（KW）F3/，# X 8=! CC，U!C）；流动相：甲醇 Y水 T 55 Y !$；流速：
3= CNZCBM；柱温：5S。
3=#=$ 计算方法：
>内（CL） T内标液体积（=# CN） X内标液密度（#=4 CLZCN） （8 [ !）
浓度（!LZE） T
峰面积（银杏内酯）
峰面积（内标） X
>内
> X .银杏内酯 X 3
! （8 [ $）
.银杏内酯为银杏内酯 &OH、&O:、&OF与内标物苯甲醇的相对重量校正因子，其值分别为 3=#$、3=5#、
3=85；>内 为内标液重量；>为样品量（CN）。
&OH、&O:和 &OF拮抗 \H]的活性比为 UY ## Y 3（67等，3444），按活性比折算为 &O:含量作为 &O
总含量，公式如下：
&OT &OHX UZ## ^ &O: ^ &OF X 3Z## （!LZE） （8 [ /）
!$ 固定化细胞培养基中植物生长调节剂的均匀设计
3=5=3 指标 以细胞干重、培养液中残糖含量、培养液中银杏内酯含量为均匀设计的考察指标。
3=5=# 实验设计 据报道，被固定的细胞在适合的条件下能保持一个较长的生长期，初级代谢物被积累
或被用于次级代谢（%M2*;11，3448）。我们以前的研究结果显示，提高 #，8G?（#，8G2B,AN-*-VA;M-(_+,;)B,
4555期 于荣敏等：银杏细胞固定化培养及银杏内酯的产生
!#$）的浓度对 %&’的产生及银杏细胞相对生长率有明显的提高，())（!*+!,-.-!/0+0!0.# !#$）123 4567
时相对生长率最高，()) 823 4567最有利于 %&)和 %&’的合成。对愈伤组织生长来说，最适 9，1*:浓
度为 ; 4567，当 9，1*:浓度为 < 4567时，%&’的含量达最大值。加入 &=（>#+0.#+）后细胞生长明显改
善，尤以 &=浓度为 ?4567时最大，但此时不利于 %&’的合成。&=为 328 4567时，%&’含量最高（于荣
敏等，8@@@）。
实验选用 A种生长调节剂（9，1*:，&=，())），在提高银杏内酯含量的前提下兼顾细胞的生长速
度。利用均匀设计安排实验，以求得效果最好的生长调节剂配比，并设 ()) 823 4567 B &= 328 4567及无
生长调节剂两组对照。各生长调节剂水平安排见表 8，各实验组安排见表 9。
表 ! 植物生长调节剂水平安排（曾昭钧，8@@1）
=!C/0 8 70D0/E FG H+#GFI4 $0E#5+ FG ,/!+. 5IFJ.- I05H/!.FIE
（K0+5，8@@1）
/0D0/ 9，1*:（4567） &=（4567） ())（4567）
8 3 3 3
9 ?2?3 3231 3213
A ;233 323< 32;3
1 ;2?3 3283 32<3
? L233 3293 8233
; L2?3 ?233 8293
L <233 3 3
< <2?3 3231 3213
@ @233 323< 32;3
83 @2?3 3283 32<3
88 83233 3293 8233
89 832?3 ?233 8293
表 均匀设计实验安排（曾昭钧，8@@1）
=!C/0 9 MN,0I#40+.E FG H+#GFI4 $0E#5+（K0+5，8@@1）
5IFH, 8 A ?9，1*:（4567） &=（4567） ())（4567）
8 3 323< 32<3
9 ?2?3 ?233 3213
A ;233 323< 8293
1 ;2?3 ?233 32;3
? L233 3231 3
; L2?3 3293 8233
L <233 3231 3213
< <2?3 3293 8293
@ @233 3 32<3
83 @2?3 3283 3
88 83233 3 8233
89 832?3 3283 32;3
8A 3 3 3
81 3 3283 8233
82A21 方法 O:!细胞系，接种 92; 56瓶，聚胺酯泡沫载体 P9@，82? Q 82? Q 82? 4A，32L9 56瓶，培养液
;? 4/6瓶，8< $收获，过滤，得细胞和发酵液。细胞用蒸馏水冲洗 A遍，<3R干燥 91 -，称重。取发酵液
A 4/测残糖，其余浓缩处理后，用高压液相仪测定其银杏内酯含量。
!#$ 继代培养发酵液中银杏内酯的含量
含有固定化细胞的聚胺酯泡沫，8< $为一个周期，移入相应的培养液中，在每个培养周期结束时，
取样检测，指标及方法同前。
图 8 银杏内酯 )、’、S标准品及内标 TP7S图谱
U#528 TP7S FG 5#+>5F/#$0 )（%&)），5#+>5F/#$0 ’（%&’），
5#+>5F/#$0 S（%&S）!+$ VW（C0+XY/ !/-F/ EF/H.#F+）
!#% 最优化结果的细胞生长曲线和银杏内酯累积曲线
根据优化条件，本文进行了如下考察：8）最佳
载体条件；9）高接种量；A）两阶段培养；1）最优
代谢培养基及最优细胞生长培养基（于荣敏等，
8@@@）。
82?28 方法 O:!细胞系，83 $龄细胞，接种量 8A 5
UO（GI0E- J0#5-.）6瓶，培养基 ZW B 9，1*: < 4567 B
()) 321 4567 B &= 3231 4567（优化组）及 ZW B ())
823 4567 B &= 328 4567（对照组），培养基装量为 ;? 4/6
瓶。载体体积为 32? Q 32? Q 32? 4A，装量为 32L9 56瓶。
摇床培养（<3 I64#+），1 $后将聚胺酯泡沫从培养液中
移出至相应培养液中，;? 4/6瓶，继续摇床培养，定时
取样，进行细胞生物量和培养液中银杏内酯含量测定。
31A 云 南 植 物 研 究 9;卷
! 结果与讨论
!# 细胞发酵液中银杏内酯类成分的含量测定结果
银杏细胞固定化培养液的 !#$测定结果如图 %，图 &，图 ’所示。
图 & 培养液 !#$图谱
()*+ & !#$ ,- ./0 123.240 5,32.),6
图 ’ 培养液中加入 789，78:，78$后的 !#$图谱
()*+ ’ !#$ ,- ./0 123.240 5,32.),6 .,*0./04 ;)./
789，78: <6= 78$
通过与标准品的 !#$保留时间对比及样品 !#$的加样实验可知，银杏固定化细胞
可将银杏内酯成分 789，78:和 78$分泌到培养液中。
!! 均匀设计实验结果
植物生长调节剂的均匀设计试验结果如表 ’所示。
!$ 继代培养发酵液中银杏内酯的 !#$测定
继代培养发酵液中银杏内酯的含量测定结果见表 >。
由表 &、表 ’和表 >可知，最优生长调节剂组合为实验组 ?，即 &，>@A BCD E*F# G 8H
DCD> E*F# G I99 DC> E*F#。主要表现为：%）从第一次培养周期结束时的总残糖含量分析，
其数值为 %>C’J E*FE3，消耗碳源水平较高，仅比 ’号实验组的消耗水平低；&）在每个周
期末的干重都较高，表明此生长调节剂配比适合于细胞生长；’）在此生长调节剂组合下，
固定化比例为 ?&CKL，高于其他生长调节剂组合；>）在此生长调节剂条件下，银杏内酯
的含量远远超过其它配比，最高 789为 BDC>>!*F#；78:为 JDC’M!*F#；78$为 &?JC>!*F
#；M）在第 ’个培养周期末其细胞密度达到 DC?& *F瓶，可见，此时细胞仍保持很高活力。
这将非常有利于长期流化床培养。
此外，从葡萄糖及果糖的测定结果可知，银杏培养细胞可将蔗糖分解成葡萄糖和果糖
并加以利用。且细胞对于此两种单糖的利用并不平衡，果糖消耗的多，葡萄糖消耗的少。
%>’’期 于荣敏等：银杏细胞固定化培养及银杏内酯的产生
表 ! 生长调节剂均匀设计实验结果
!#$% & ’%()$* +, -+./+0% )01,+./ 2%(130
3.+)4
’5
/36/$
7$)
/36/$
8.)
/36/$
9:
3;<6#+**$%
3;<6#+**$%
9’
（=）
7>?
!36@
7>A
!36@
7>:
!36@
!7>
!36@
B BCDEC CDFG &DE& FDBH FDBC ICDF F F H&DJJ BDFC
H BCDCF JDJC &D&G FDFG FDFK GCDJ F F F F
& B&DKG IDII JDIB FDFK FDBJ JJDG F F BGD&C FDIJ
G BID&E JDH& &DFK FDFJ FDBH GHDF F F F F
J BIDCG KDFB JD&I FDBF FDHF JFDG BFDFH HCDKE KEDIE HFDEI
I BCDCF EDHK GDHG FDHG FD&G IEDK F F F F
C BGD&I EDGI JDJB FDBE FDHJ C&DH EFDGG IFD&J HCIDG BFIDC
E BEDFG EDCK JDJJ FDHF FDHC C&DK F F BGIDK IDIE
K BIDGI KDEI IDHB FDFK FDHF GJDC HCDFC HKDIE BBID& GFDGF
BF BEDFG IDIK GDCI FDFE FDBG JEDH F F BHDFE FDJJ
BB BCDGH IDCH GDF& FDBJ FDHG IBDJ HKD&& &&DHG JCFDI IHDEH
BH BJDEB CDFE IDGH FDBF FDBE JEDG F F F F
B& BKDIB CDC& GDIJ FDFK FDBK GIDE F F F F
BG BJDJF CDBH IDJG FDFE FDBC GJDE F F HFDFJ FDKB
’5：.%(12)$ ()3.；7$)：3$)L+(%；8.)：,.)L*+(%；9:：1//+#1$1M%2 L%$$(；;<：2.N O%13-*；/+#1$1M%2 .*%；!7>：*+*$ 310Q3+$12%(
表 继代培养结果
!#$% G ’%()$* +, ()#L)$*).%
3.+)4
5%L+02.N ()#L)$*).%
’5（/36/$） 3;<6#+**$% !7>（!36@）
!-1.2$N ()#L)$*).%
’5（/36/$） 3;<6#+**$% !7>（!36@）
B BCDB FDFCKKI F HKDJG FDFCK&I F
H BIDKH FDFJCGG HD& &FDIJ FDFJKCB F
& BIDBJ FDBEJIH FDKI IDH& FDKFIKE HBDIJ
G BIDBC FDFJKIJ F HCDKE FDFJEJI F
J BKDGJ FDFGJKE ED&H HCDBG FDFGHHJ F
I B&DKC FDFEJIC &IDHJ HIDJG FDFKBJE F
C BJDBB FDH&JGB EGD&C KDHJ FDCHEIH &IDHG
E BGDJG FDFKJJG BDFG HGDCI FDBHGIE F
K BJDHK FDFKEJI J&DEK B&DJK FDJHFBC KDGE
BF BID& FDHBH&& F HGDKG FDB&EFJ F
BB B&DEH FDFEHIK GHDJC HED&H FDFEIK& F
BH BHDJK FDBBEJJ F &FDKI FDF&FB& F
B& BBD&H FDBJHJG F CDHG FDEFGFH JDII
’5：.%(12)$ ()3.；!7>：*+*$ 310Q3+$12%(
#$ 最优化结果的细胞生长曲线和银杏内酯累积曲线
根据优化条件所得到的细胞生长曲线和银杏内酯累积曲线见图 G和图 J。
由图 G和图 J 可知：B）优化培养后，最高固定化细胞密度为 BH 2 时，FDG 3;<6瓶；
银杏内酯含量：7>?在 HH 2时最高（HFF!36@）；7>A在 BE 2时最高（BHH!36@）；7>:在
BE 2时最高（JFK!36@）；H）由于接种量大，细胞密度始终很高，代谢消耗很快，第 BH 2
进入衰减期。但总银杏内酯的量仍在上升；&）对照组细胞密度低，内酯含量也略低，银
杏内酯最高含量分别为 7>?为 &E!36@，7>A为 HG!36@和 7>:为 HGI!36@，且从第 BH 2起
HG& 云 南 植 物 研 究 HI卷
便开始减少。
由图 !可知，#$在 %& ’时的含量为 %((!)*+，本研究组前期研究证明，悬浮培养细
胞中 #$的含量为 ,-.. / %,0 1（)*)）（于荣敏，%...）。故本研究结果说明，银杏固定化细
胞中的主要活性成分 #$等银杏内酯类成分可分泌到培养液中，且其含量较高，这将极
有利于利用植物细胞工程工业化生产银杏内酯类活性成分。
图 1 固定化细胞培养生长曲线（2 3 !）
45)6 1 789:; <=7>? 8@ 5AA8B5C5DE:582 图 ! 固定化培养液中银杏内酯的含量变化曲线
G6 优化组；$6 对照组
45)6 ! H5A? <8=7F? 8@ 52I)8C5’?F E<<=A=CE:582 52 :;? A?’5=A 8@ 5AA8B5C5DE:582 <=C:=7?
G6 8J:5A5D?’ )78=J；$6 <82:78C )78=J
由上可知，以聚胺酯泡沫为固定化材料进行银杏细胞固定化培养具有方法先进、纯化
工艺简单、银杏内酯含量高等优点，可尝试用于生物技术方法进行银杏内酯类成分的中试
生产。
K1KK期 于荣敏等：银杏细胞固定化培养及银杏内酯的产生
〔参 考 文 献〕
!#$%&& ’，())*+ ,-./ 0%-- 123/%45-367［8］+ 1%$-2，9%2#%-:%$6：;<$26%$=>%$-.6
?.3 @（高昱），A36 B@（宗武英），936 CD（洪大庆），())E + !FF%4/ 3F !?: 3 2GGH3-3624 FH4/23 2 .6%# G3H&%［I］+
!#$%#&’()*&#+ ,*-)’&.-+-/0（药物生物技术）+ !（*）：JKL—JK)
93&F3$# C，8%42.=9H%$/. I%. 8，,.6% 0， ’) #+，()MM+ N./H$.- ./.632&/& 3F <-./%-%/=.4/2O./23 F.4/3$［I］+ !0)-)’$ 1’2，
（(）：(
P2 Q（林协），JRRK + 8.$S%/ <%$&<%4/2O% .# <$3#H4/ #%O%-3<26 3F 3*.4/- 5*+-5#［I］+ 6&*’.)*7*& #.8 9’&.-+-/*& :’;’+-<*./ -7 =-$>
’2)（林业科技开发），#$（*）：(K—(T
O.1%%S UV，;45%%$% 9V，’./23 U， ’) #+，())(+ C%/%$G2./23 3F 62S63-2#%& .# :2-3:.-2#% 2 3*.4/- 5*+-5# -%.O%& .# <57/3=
<5.$G.4%$/24.-&［I］+ ?-($.#+ -7 @$-%#)-/$#<，%!&（J）：KET—KME
@H ’8，A5.3 9P，A5%6 @?， ’) #+，()))+ ;/H#2%& 3 /5% 4.--H& 0H-/H$%& 3F 3*.4/- 5*+-5# .# 2/& G%/.:3-2/%&=62S63-2#%&［I］+
@*.’2’ ?-($.#+ -7 ,*-)’&.-+-/0（!6-2&5 !#2/23），#%（(）：T(—TM
@H ’8（于荣敏），A5.3 9P（赵红莲），A5.6 9（张辉）， ’) #+，()))+ ;/H#2%& 3 /5% 4%-- &H&<%&23 4H-/H$% 3F 3*.4/- 5*+-5#
.# 2/& G%/.:3-2/%&=62S63-2#%&［I］+ @*.’2’ ?-($.#+ -7 ,*-)’&.-+-/0（生物工程学报），#%（J）：JRE—J(R
@H. @I（元英进），9H AC（胡宗定），())*+ ;/H#7 3 .-S.-32# <$3#H4/23 3F 2GG3:2-2W%# @#)#$#.)(2 $-2’(2 4%--& 2 <3-7H$%/5.%
F3.G&［I］+ @’%*&#+ 1’#&)*-. A./*/’’$*./ #.8 9’&.-+-/0（化学反应工程与工艺），#’（J）：()T—())
A%6 AI（曾昭钧），())* + X2F3$G C%&26 .# Y/& V<<-24./23［8］+ ;5%67.6：U5% ,%3<-%’& ,$%&& 3F P2.326
**K 云 南 植 物 研 究 JL卷