全 文 ：我国云南食用牛肝菌的 DNA条形码研究*
李艳春, 吴摇 刚, 杨祝良**
(中国科学院昆明植物研究所生物多样性与生物地理学重点实验室, 云南 昆明摇 650201)
摘要: iFlora是结合传统分类学与 DNA测序和信息技术, 通过系列关键技术进行集成, 构建便捷、 准确识
别物种和掌握相关数字化信息的新一代智能植物志。 iFlora研发中首要和迫切的任务之一就是寻找适合于
大多数植物和经济蘑菇的标准 DNA条形码序列。 为筛选适合大型经济蘑菇的 DNA条形码, 本研究以云南
食用牛肝菌为例, 选取野生食用菌市场上常见的、 被当地人认为的 4 “种冶 牛肝菌为研究对象, 利用核糖
体大亚基 (nrLSU)、 翻译延长因子 1鄄琢 ( tef1鄄琢)、 RNA聚合酶 II大亚基 ( rpb1) 和 RNA 聚合酶 II 的第二
个大亚基 ( rpb2) 四个 DNA 序列, 使用真核生物通用引物进行扩增、 测序和测试。 研究发现这 4 “种冶
样品实际上代表了 12 个独立的物种, 进一步研究表明 4 个候选片段的扩增和测序成功率均为 100% , 且不
存在种间和种内变异的重叠。 4 个片段的物种分辨率均较高, 但与 nrLSU 相比, rpb1、 tef1鄄琢 和 rpb2 具有
更为明显的条形码间隔。 鉴于 rpb1 比 tef1鄄琢 和 rpb2 具有更高的种间变异和较低的种内变异, 建议将 rpb1
作为牛肝菌属的核心条形码, tef1鄄琢和 rpb2 可作为该属的辅助条形码。
关键词: iFlora; DNA条形码; 牛肝菌; 物种识别; 食用蘑菇
中图分类号: Q 781, Q 948. 2摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2013)06-725-08
DNA Barcoding of Edible Boletes (Boletaceae) from Yunnan, China*
LI Yan鄄Chun, WU Gang, YANG Zhu鄄Liang**
(Key Laboratory of Biodiversity and Biogeography, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy
of Sciences, Kunming 650201, China)
Abstract: iFlora is designed to integrate traditional taxonomy knowledge with DNA sequencing and biological infor鄄
mation. Through a series of key technological innovations and integrations, the main objective of iFlora is to con鄄
struct the next鄄generation Flora or intelligent Flora, which should fulfill the function of accurately and rapidly identif鄄
ying species and acquiring related digital information. The most important and urgent task for iFlora development is
to search for the standard DNA barcode to distinguish most of the plants and economically important mushrooms. To
establish a standard DNA barcode for the edible boletes in Yunnan, samples of common boletes in the free markets
regarded as four “species冶 by local mushroom hunters were collected and studied. Our date indicated that these four
“ species冶 in fact represent 12 distinct species. Furthermore, four candidate markers, the large subunit nuclear ribo鄄
somal RNA (nrLSU), the translation elongation factor 1鄄alpha ( tef1鄄琢), the RNA polymerase II largest subunit
( rpb1) and the RNA polymerase II second largest subunit ( rpb2) were tested using the eukaryotic general primers
for their feasibility as barcodes of the species of Boletus. This study indicates that the four candidate markers are of
very high PCR amplification and sequencing success rate (100% and 100% respectively), and there are no over鄄
lapping between intra鄄 and inter鄄 specific variation. All four candidate markers showed high species resolution. Com鄄
pared with nrLSU, rpb1, tef1鄄琢 and rpb2 had much more clearly defined barcoding gaps. This study showed that
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2013, 35 (6): 725 ~ 732
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 7677 / ynzwyj201313201
*
**
基金项目: 中国科学院昆明植物研究所 “一三五规划冶 iFlora项目; 中国科学院大科学装置开放研究项目 (2009鄄LSFGBOWS鄄01)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: fungi@ mail. kib. ac. cn
收稿日期: 2013-10-03, 2013-10-16 接受发表
作者简介: 李艳春 (1980-) 女, 博士, 主要从事真菌的系统与进化研究。 E鄄mail: liyanch@ mail. kib. ac. cn
rpb1 can be used as a primary barcode marker considering that rpb1 showed high sequence variation among species
and low variation within species, while tef1鄄琢 and rpb2 can be proposed as supplementary barcodes for the boletes.
Key words: iFlora; DNA barcoding; Boletes; Species recognition; Edible mushrooms
摇 随着科学技术的快速发展和知识的大量积
累, 快速准确的物种鉴定和相关数据信息的方便
快捷获取, 成为未来植物志发展的必然趋势。 在
此背景下, 以植物系统分类、 生态学、 环境科学
为基础, 将现代植物学、 生物信息学、 分子遗传
学、 数字化图像技术、 GIS /遥感系统等与计算机
信息相关技术相结合, 通过系列关键技术的集成
和攻关, 构建便捷、 准确识别植物和掌握相关数
字化信息的新一代植物志 ( iFlora) 是摆在我们
面前的重要任务 (李德铢等, 2012)。 当前, 构
建 iFlora的首要和迫切的任务之一就是寻找适合
于大多数植物的标准 DNA 条形码。 DNA 条形码
是一种基于 DNA序列进行生物物种鉴定的技术,
即利用标准化的一个或几个 DNA 片段进行序列
分析, 根据核苷酸序列差异, 实现快速和准确地
鉴定物种 (Hebert 等, 2003, 2004; Hollingsworth,
2011; Kress和 Erickson, 2007; Liu等, 2011; Ne鄄
wmaster等, 2008; Schoch等, 2012)。
DNA条形码筛选的三个主要标准包括: 引
物通用性高, 片段在 300 ~ 800 bp 之间 (Kress
等, 2005), 便于一个反应完成测序工作, 而且
便于 DNA提取和 PCR扩增; 在种间有明显的遗
传变异和分化, 同时种内变异足够小; 物种分辨
率高 ( CBOL Plant Working Group, 2009; Kress
等, 2005)。
在国外, 大型经济真菌的 DNA 条形码研究
刚起步不久 (Mouhamadou 等, 2008; Xu, 2010;
Dentinger等, 2011; Du 等, 2012)。 在国内, 真
菌 DNA 条形码的研究才刚刚开始 ( Zhao 等,
2011; Zeng等, 2012; 蔡箐等, 2012)。 广义牛肝
菌属 (Boletus s. l. ) 全球已描述且被承认的有近
400 种 ( http: / / www. indexfungorum. org / names /
Names. asp), 我国有 110 余个分类单元, 其中具
有重要食用和经济价值的牛肝菌约 40 种 (李泰
辉和宋斌, 2002a, b, 2003; 臧穆, 2006)。 目前
市场上有大量的食用牛肝菌出售, 但许多种类在
形态上差异并不显著, 常常被作为同一个种处
理。 通过对市场上常见的牛肝菌种类开展 DNA
条形码研究, 对于认识食用牛肝菌的物种多样性
和对食用牛肝菌的快速准确鉴定等具有重要的科
学意义和应用价值。
本研究对我国云南野生菌市场上常见的 4
“种冶 牛肝菌, 即 “红葱冶 (图 1: A ~ C)、 “白
葱冶 (图 1: D ~ E)、 “见手青冶 (图 1: F ~ G) 和
“黑牛肝冶 (图 1: H ~ L) 等进行了采样和研究,
以期筛选有效的 DNA条形码片段。
1摇 材料和方法
1. 1摇 研究材料
本研究共选取了云南自由市场上常见的、 被当地人
普遍认同的 4 “种冶 牛肝菌共计 46 份样品为对象进行研
究。 凭证标本存放于中国科学院昆明植物研究所隐花植
物标本馆 (HKAS)。 标本鉴定主要依据 Binder和 Hibbett
(2006)、 Chiu (1948)、 Feng 等 (2012)、 Li 等 (2013)、
Pegler和 Young ( 1981 )、 Singer ( 1945, 1947 )、 Smith
和 Thiers (1968, 1971)、 Snell 和 Dick (1970)、 Watling
和 Gregory (1989)、 Watling 和 Li (1999) 及臧穆 (2006)。
具体研究材料的采集号在分子树上各物种的名称后面
标出。
1. 2摇 样品 DNA的提取、 PCR扩增和测序
总 DNA的提取采用改良的 CTAB法 (Doyle 和 Doyle,
1987)。 nrLSU、 tef1鄄琢、 rpb1 和 rpb2 的扩增引物分别为
LROR和 LR5 (Vilgalys和 Hester, 1990)、 983F和 1567R
(Rehner, 2001 )、 RPB1鄄Af 和 fRPB1鄄Cr、 bRPB2鄄6F 和
bRPB2鄄7. 1R (Matheny等, 2005)。 PCR反应体系和扩增
程序参考前期的研究 (蔡箐等, 2012; Zeng等, 2012; Li
等, 2011)。 PCR产物经纯化后直接送出测序, 测序仪为
ABI3730, 所用引物与扩增引物相同。
1. 3摇 数据分析
利用多基因谱系一致性系统发育物种界定法 (Tay鄄
lor等, 2000), 研究样品代表的物种数。 利用 MEGA
(version 4. 0) 软件, 采用Kimura2鄄parameter distance (K2P)
模型计算各物种的种内、 种间遗传距离。 再利用 Mi鄄
crosoft Office Excel构建能体现种间、 种内遗传距离的分
布柱形图, 并通过 Wilcoxon秩和检验来检验各片段序列
之间的变异性差异, 检验条形码间隔 ( barcoding gap)
是否存在 (Meyer和 Paulay, 2005)。 另外, 利用最大似
然法 (Maximum Likelihood, ML) 构建系统树, 衡量候
选片段对物种的准确鉴定率, 即物种分辨率。
627摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
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图 2摇 基于 nrLSU、 tef1鄄琢、 rpb1 和 rpb2 片段 DNA核苷酸序列联合分析构建的最大似然树, 分枝上的数值为靴带值。
分子树上的 12 个物种曾被当地人作为 4 个 “种冶 (4 种颜色表示) 处理
Fig. 2摇 Phylogenetic tree generated from the combined nrLSU, tef1鄄琢, rpb1 and rpb2 dataset using maximum likelihood method. Bootstrap support
values are indicated above the branches. Taxa marked in the same colour were regarded as a single “species冶 by local mushroom hunters
2. 3摇 条形码间隔的评估及种间和种内遗传差异
的统计学检验
条形码间隔是评价 DNA 条形码的重要标准
之一, 理想的条形码其种内的遗传变异应该小于
种间的遗传变异。 在本研究中, 从四个片段种内
和种间遗传变异的分布图可以看出 (图 3, 表
1), 四个片段均表现出一定的条形码间隔, 而
tef1鄄琢、 rpb1 和 rpb2 较 nrLSU 存在更为明显的条
形码间隔。 利用 Wilcoxon 秩和检验对不同序列
种内和种间的变异进行统计分析, 结果表明四个
片段中只有 nrLSU的种内变异最小, 其余三个片
段的种内变异率无明显差别 (表 2)。 种间变异
率则表现出一定的差异, 以 rpb1 的种间变异最
大, 而 nrLSU的种间变异最小, 即 rpb1>tef1鄄琢抑
rpb2垌nrLSU (表3)。 依据以上分析结果, 建议将
rpb1 作为牛肝菌属的核心条形码, tef1鄄琢和 rpb2
表 1摇 候选条形码片段的种内和种间变异分析
Table 1摇 Intra鄄 and inter鄄 specific variation of DNA barcoding candidate segments
分项 Item
候选片段 Candidate segments
nrLSU tef1鄄琢 rpb1 rpb2
种内变异 Intra鄄specific variation 0. 001依0. 0014 0. 0047依0. 0021 0. 003依0. 0028 0. 0049依0. 0026
种间变异 Inter鄄specific variation 0. 0337依0. 0106 0. 0764依0. 0176 0. 0836依0. 0271 0. 0768依0. 0175
种内最小变异 Maximum intra鄄specific variation 0. 014 0. 007 0. 009 0. 009
种间最小变异 Maximum inter鄄specific variation 0. 006 0. 037 0. 024 0. 035
827摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
图 3摇 四个候选条形码片段的种内和种间遗传变异分布频率比较
Fig. 3摇 Comparisons of frequency distribution of intra鄄 and inter鄄 specific pairwise distances among four barcoding candidate segments
表 2摇 种内遗传变异的Wilcoxon 检验
Table 2摇 Wilcoxon test of pairwise intra鄄 specific variations
W+ W鄄 N value P value 摇 摇 Result
摇 nrLSU VS tef1鄄琢 0 55 10 0. 0027 摇 摇 nrLSU
摇 tef1鄄琢 VS rpb2 25. 5 29. 5 10 0. 3897 摇 摇 tef1鄄琢抑rpb2
摇 rpb1 VS rpb2 12 54 11 0. 0392 摇 摇 rpb1抑rpb2
表 3摇 种间遗传变异的Wilcoxon 检验
Table 3摇 Wilcoxon test of pairwise inter鄄 specific variation
W+ W鄄 N value P value 摇 摇 Result
摇 nrLSU VS tef1鄄琢 0 2211 66 <0. 0001 摇 摇 nrLSU
摇 rpb1 VS rpb2 1520. 5 624. 5 65 0. 0018 摇 摇 rpb1>rpb2
可作为该属的辅助条形码。
2. 4摇 物种分辨率
研究表明, 四个候选片段中的任何一个片段
均能成功区分牛肝菌属的 12 种物种, 各片段具
有较高的物种分辨率 (图 4, 5)。 因此, 本文选
用的四个候选片段均可作为牛肝菌属物种鉴定的
DNA候选条形码。
3摇 讨论
本文选取的样品被当地人作为 4个 “种冶 处理
(图 1)。 然而, 通过多基因谱系一致性系统发育物
种界定法 (GCPSR) 的分析发现 (Taylor等, 2000),
这 4 “种冶 牛肝菌的 46 份样品实际上代表了 12
个系统发育种。 研究表明, 这 12 个系统发育种
之间存在外观形态特征和内部显微特征的差异,
9276 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 李艳春等: 我国云南食用牛肝菌的 DNA条形码研究摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 4摇 基于 nrLSU和 tef1鄄琢片段构建的最大似然树, 分枝上的数值为靴带值。 分子树上的 12 个物种
曾被当地人作为 4 个 “种冶 (4 种颜色表示) 处理
Fig. 4摇 Maximum Likelihood trees based on nrLSU and tef1鄄琢 sequence data respectively. Bootstrap support values are indicated
above the branches. Taxa marked in the same colour were regarded as a single “species冶 by local mushroom hunters
图 5摇 基于 rpb1 和 rpb2 片段构建的最大似然树, 分枝上的数值为靴带值。 分子树上的 12 个物种
曾被当地人作为 4 个 “种冶 (4 种颜色表示) 处理
Fig. 5摇 Maximum Likelihood trees based on rpb1 and rpb2 sequence data respectively. Bootstrap support values are indicated
above the branches. Taxa marked in the same colour were regarded as a single “species冶 by local mushroom hunters
037摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
可以相互区分, 应该作为不同的物种对待。 其中的
4个种, 即粉黄牛肝菌B. roseoflavus Hai B. Li & Hai
L. Wei、 小美牛肝菌 B. cf. speciosus Frost、 双色牛
肝菌 B. cf. bicolor Peck和茶褐牛肝菌 B. brunneissi鄄
mus W. F. Chiu, 是在我国已被描述或报道过的
种类; 其余 8 种中, 有些种可能代表尚未被描述
的新种, 有些种则可能代表我国的新记录种, 对
于这些种的鉴定、 命名还有待进一步深入研究。
虽然 ITS序列被广泛应用于植物和真菌的系
统发育研究中, 并被提议作为植物 (Li, 2011)
和真菌 (Rossman, 2007; Schoch等, 2012) 的核
心条形码。 但也有学者提出 ITS 作为真菌的核心
条形码存在一定的局限性, 因为真菌存在 ITS 多
拷贝现象, 很多物种的 ITS 序列无法通过 PCR
产物的直接测序获得序列, 而且在一些真菌中同
种的不同拷贝之间 DNA 序列的变异率大于种间
(Kiss, 2012; Senda等, 2009)。 另外, 我们前期
的研究表明, 在广义牛肝菌属 (Boletus s. l. ) 中,
ITS存在多拷贝现象或 “poly 结构冶, 其 PCR 产
物直接测序的成功率往往不到 50% , 而且有些
种不同拷贝之间 DNA 序列的变异率大于其近缘
种间的变异率。 因此, 我们暂不建议将 ITS 作为
牛肝菌属的条形码。
本研究选取的四个条形码候选片段 nrLSU、
rpb1、 tef1鄄琢 和 rpb2 的扩增和测序成功率均为
100% , 引物通用性好, 序列长度适中。 四个片
段均不存在种间和种内变异的重叠, 四个片段的
物种分辨率均较高, 满足了 DNA 条形码的基本
需要。 但与 nrLSU 相比, rpb1、 tef1鄄琢 和 rpb2 具
有更为明显的条形码间隔。 鉴于 rpb1 比 tef1鄄琢和
rpb2 具有较高的种间变异和较低的种内变异, 故
建议将 rpb1 作为牛肝菌属的核心条形码, tef1鄄琢
和 rpb2 作为该属的辅助条形码。
4摇 结束语
我国牛肝菌属的分类研究过去主要依据其外
部形态和内部解剖特征, 对物种进行鉴定、 描述
和命名。 然而, 该属很多种类其外部形态和部分
内部解剖特征受个体发育阶段、 环境等因素的影
响, 常导致不同的种可能具有相似的形态特征,
同一种会出现不同的形态特征, 进而产生很多异
物同名或同物异名, 这显然不能反映出我国牛肝
菌属物种多样性的实情。 我们对云南野生食用菌
市场上常见的、 被当地人认为的 4 “种冶 牛肝菌
进行了研究, 发现它们实际上代表了 12 个独立
的物种。 本研究在一定程度上证实了传统的、 基
于形态特征的物种分类处理, 但同时也发现利用
比较形态学特征和分子系统发育证据相结合的方
法来界定物种是重要的, 也是必要的, 只有这样
才能逐步实现物种在形态、 遗传信息等综合性状
的融合统一, 这也是 iFlora研发过程中追求的目
标之一 (方伟和刘恩德, 2012; 陆露等, 2012)。
致谢摇 中国科学院昆明植物研究所王红研究员对本文提
出的宝贵意见。
也参摇 考摇 文摇 献页
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