全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 1 期 2016 年 1 月

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王不留行毛状根培养体系建立及其黄酮苷的测定
包京姗 1，张海弢 2，徐大卫 3，杨世海 1*
1. 吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118
2. 江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001
3. 中国药材集团公司，北京 100195
摘 要：目的 建立王不留行毛状根培养体系。方法 分别用发根农杆菌 R15834、R1601、R1000、A4 感染王不留行叶片产生毛状
根，考察不同理化因子对其生长的影响，并利用HPLC 测定王不留行中黄酮苷的量。结果 发根农杆菌 R1601 转化王不留行叶片的
诱导率最高，pH 值为 6.0，蔗糖浓度为 3%的MS 培养基培养毛状根增殖速度最快，王不留行毛状根中王不留行黄酮苷量略高于种子
中的量。结论 王不留行成功诱导毛状根，为进一步筛选适宜的王不留行发根培养体系并调控次生代谢产物的研究奠定了基础。
关键词：王不留行；毛状根；发根农杆菌；HPLC；黄酮苷
中图分类号：R282.21 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)01 - 0138 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.01.021
Establishment of culture system of Vaccaria segetalis hairy roots and determination of
vaccarin
BAO Jing-shan1, ZHANG Hai-tao2, XU Da-wei3, YANG Shi-hai1
1. College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd, Lianyungang, Lianyungang, 222001, China
3. China National Group Company of Traditional & Herbal Medicine, Beijing 100195, China
Abstract: Objective To establish the culture system of Vaccaria segetalis hairy roots. Methods Agrobacterium rhizogenes R15834,
R1601, R1000, and A4 were used to infect V. segetalis leaves to induce hairy roots and the influences of different physicochemical factors on
its growth were investigated. The content of vaccarin was determined by HPLC. Results A. rhizogenes R1601 had the highest induction
rate by converted into V. segetalis leaves, The best growth cycle of cell suspension culture was defined when cultured in liquid MS medium
with pH value of 6 and sucrose concentration of 3%, vaccarin in V. segetalis hairy roots was slightly higher than that in the seed. Conclusion
V. segetalis could successfully induce hairy roots, the foundation has been established for further oplimizing the proper cultural system for V.
segetalis hairy roots and regulating the secondary metabolites.
Key words: Vaccaria segetalis (Neck.) Garcke; hairy roots; Agrobacterium rhizogenes; HPLC; vaccarin

王不留行为石竹科植物麦蓝菜 Vaccaria
segetalis (Neck.) Garcke 的干燥成熟种子[1]，主产于
我国的河北、山东、辽宁等地，以河北产量最大[2]。
现代研究表明王不留行的成分主含黄酮苷类、三萜
皂苷类化合物。它的种子具有活血通经、下乳消肿、
利尿通淋的功能[3]。近年来在临床上王不留行一直
作为妇科中成药的配方原料，而且有抗癌作用；王
不留行的催乳作用使它成为母畜饲料的添加剂。所
以，王不留行具有良好的开发利用前景，是一种很
有研究价值的药用植物[4]。目前，王不留行的开发
利用突飞猛进，但是王不留行常用种子繁殖，生长
很慢，生物量较小，给临床使用和质量控制带来诸
多困扰。
利用发根农杆菌 Agrobacterium rhizogenes 可对
药用植物进行诱导生根，诱导得到的毛状根能够合
成原植物所含的次生代谢产物，甚至得到次生代谢
产物的量高于原植物。由于发根系统具有生长迅速、
合成次生代谢产物能力强和遗传性状稳定等特点[5]。

收稿日期：2015-04-13
作者简介：包京姗，博士研究生，主要从事药用植物生物技术研究。E-mail: baojingshan@163.com
*通信作者 杨世海 Tel: (0431)84533086 E-mail: jlyangs@163.com
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据不完全统计，很多药用植物都已培育成功毛状
根培养体系[6]，如蒙古黄芪[7]、曼陀罗[8]、人参[9]、
西洋参[10]、颠茄[11]、莨菪[12]、决明[13]、丹参[14-15]、
云南萝芙木[16]、长春花[17]等毛状根已经在小规模
范围内培养成功，并获得了可喜的成果。目前，
国内外学者对王不留行的研究主要集中于化学成
分及药理活性，而对王不留行毛状根培养的研究
尚未见报道。本实验利用发根农杆菌侵染王不留
行诱导得到毛状根，并利用 HPLC 对种子和发根
中黄酮苷的量进行测定和比较，为进一步筛选适
宜的王不留行毛状根培养系统并调控次生代谢产
物的研究奠定基础。
1 材料与仪器
1.1 材料
王不留行 Vaccaria segetalis (Neck.) Garcke 种
子，采自吉林农业大学药用植物科技示范园，经吉
林农业大学中药材学院刘霞教授鉴定。发根农杆菌
菌株 Agrobacterium rhizogenes R15834、R1000、
R1601、A4，由中国农业微生物研究所菌种保藏中
心 提 供 。 对 照 品 王 不 留 行 黄 酮 苷 （ 批 号
111853-201102）购于中国食品药品检定研究院。
1.2 仪器与试剂
VS-840-1单人单面垂直净化工作台，SD-YX
（F）3200立式双层智能精密型摇床。Waters 1525
HPLC系统（美国Waters公司），包括Waters 2487
Dual Absorbance Detector，Waters In-Line Degasser
AF型在线脱气机，Waters 1525 Binary HPLC型二元
泵，Waters 717型自动进样器，恒温柱箱，Breeze 色
谱工作站。
2 方法
2.1 无菌苗的培养
挑选当年采收色泽鲜亮干燥成熟的王不留行种
子，在生物洁净工作台内，用无菌水清洗 3 次，75%
乙醇浸泡 30 s，取出后无菌水再清洗 3 遍，每次清
洗 30 s；最后用 0.1% HgCl2 浸泡 8 min，无菌水清
洗 5～6 次，每次清洗 2～3 min，用无菌滤纸将种
子表面的水吸干，将种子接种到 MS 固体培养基中。
每天置于光照强度 2 000 lx，光照/黑暗 12 h/12 h，
温度 24～25 ℃的条件下培养。待叶片完全张开后，
作为遗传转化用的外植体。
2.2 发根农杆菌的活化
在无菌条件下，用接菌针挑出，接种于固体发
根农杆菌培养基（YEB）平皿上划线培养，28 ℃恒
温暗培养，1～2 d 就可以长出单克隆菌斑，挑取单
菌落，活化 3 次，之后接种于加有 20 mL 卡那霉素
（50 mg/L）液体 YEB 培养基中，28 ℃，180 r/min
震荡培养，24 h 后观察，YEB 液体培养基由透明的
红棕色渐渐变淡，YEB 液体培养基呈现出云雾状浑
浊，此时说明这 4 种菌株已经成功复苏。但是还需
对菌液进行再次活化，将成功复苏的菌液用移液枪
取出 1 mL 加入装有 50 mL 液体 YEB 培养基的三角
瓶中，于相同的条件下再次培养 12 h，这时培养基
中活化的菌液达到了对数生长期，可以对外植体进
行侵染，结果见图 1。
2.3 毛状根的诱导
在无菌环境下，将预培养的外植体（茎段、
叶片）转移至已灭菌的锥形瓶中，然后将达到对
数生长期的菌液倒入其中，对其进行侵染 10 min。
期间，轻轻地摇晃锥形瓶，让外植体和菌液充分
接触，之后用无菌滤纸把外植体表面菌液完全吸
干，再把吸干后的外植体接种到 MS 固体培养基
上，于 24 ℃，黑暗条件下共培养 48 h，之后转
接到含有环磷酰胺（CTX）（500 mg/L）的 MS 固
体培养基上暗培养，同时以未被菌液感染的外植
体作为对照（对照组其余操作均相同）。每周转接
1 次，多次继代直至达到完全除菌后再去掉抗生
素继续培养，转至液体培养基中建立发根培养体
系，见图 1。液体培养基每瓶（100 mL 三角瓶）
装培养液 50 mL，每瓶发根的接种量约为 0.5 g 鲜
质量，培养温度为（25±2）℃，pH 为 6.0 左右。

毛状根 R1601 侵染 A4 侵染 R1000 侵染 R15834 侵染
图 1 毛状根的诱导和培养
Fig. 1 Induction and culture of hairy roots
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在摇床上培养，每处理重复 3 次，21 d 后称取发
根鲜质量，计算发根的增殖倍数。然后将发根置
于 40 ℃烘干至恒定质量，并保存备用。
2.4 PCR 分子鉴定
虽然可以根据毛状根形态学上的特点对其进行
判断，然而这种判断可信度不高，所以采用 PCR 对
成功诱导出来的王不留行叶片转化根进行验证，来
确定转化是否成功。分析 R1601 菌株中质粒 DNA
片段是否已整合进入叶片转化根的基因组中，本实
验对诱导出的毛状根和自然根进行 PCR 分子检测、
比较。利用 rol B 基因引物（购于北京三博远志生
物技术有限责任公司）进行 PCR 扩增。PCR 扩增
rol B 序列为上游：CTCCTGACATCAAACTCGTC；
下游：TGCTTCGAGTTATGGGTACA。PCR 反应条
件：95 ℃预变性 1 min，94 ℃变性 30 s，50 ℃退
火 30 s，72 ℃延伸 1 min，最后 72 ℃延伸 10 min，
共 35 个循环，4 ℃保存。
2.5 王不留行毛状根培养条件优化
在无菌条件下，选取 0.5 g 生长迅速、根系发达、
分支较多、除菌完全的王不留行毛状根，分别在无
激素的 MS、1/2 MS、R2、LS、B5、N6、改良 White
7 种不同液体培养基，pH 为 3.0、5.0、6.0、7.0、8.0、
9.0 的 MS 液体培养基、碳源质量分数为 1%、3%、
5%、7%、9%及种类为葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麦
芽糖的 MS 液体培养基进行悬浮培养。
2.6 王不留行毛状根中黄酮苷的分析
2.6.1 对照品溶液的制备 精密称取王不留行黄酮
苷对照品 4.60 mg，置于 10 mL 量瓶中，先加少量
甲醇溶解，然后加甲醇至刻度，振摇使混合均匀，
即得对照品储备液。
2.6.2 供试品溶液的制备 取王不留行种子及干燥
毛状根粉碎，过四号筛，称取约 1.00 g，放入到具
塞三角瓶中，精密加入甲醇 25 mL，超声处理 30
min，放置至室温后，将上层液体滤过到 25 mL 容
量瓶中，加甲醇补至刻度，摇匀，用 0.22 μm 微孔
滤膜滤过，即得。
参照《中国药典》2010 年版方法[1]，测定王不
留行种子及毛状根中王不留行黄酮苷，其中，体积
流量 1.0 mL/min，柱温 30 ℃。
3 结果与分析
3.1 PCR 检测结果
R15834、R1601、R1000、A4 4 种发根农杆菌
所诱导的王不留行毛状根中，R1601 菌株较另外 3
种菌株，不仅诱导率高，而且生长迅速、根系发达、
分支较多。在超净工作台内将上述毛状根剪下，转
接到含有 500 mg/L CTX 的固体培养基上，于 24
℃，黑暗条件下培养，每周转接 1 次到固体 MS 培
养基上进行除菌，直到完全除菌。最后挑选根系发
达、分支较多、生长迅速的毛状根，转入 MS 液体
培养基中进行悬浮培养，得到王不留行毛状根株系，
保存备用，对其进行 PCR 分子检测，拍照（125 V
电压，20 min），结果见图 2。

M-Marker 1-R1601 质粒 DNA 2-自然根 3-叶片转化根
M-Marker 1-R1601 plasmid DNA 2-natural roots 3-conversion blade roots
图 2 毛状根 PCR 检测结果
Fig. 2 PCR results of hairy roots
从 PCR 检测结果看出在叶片转化根条带（423
bp）出现了与基因引物相同的条带，自然状态生长
的根（未转化）则没有出现与基因引物相同的条带，
证明 R1601 菌株中质粒 DNA 片段已整合进转化根
的基因组中。
3.2 王不留行液体培养基筛选
液体培养基种类不同，毛状根的生长状态也不
同，增殖倍数也有较大的差别。21 d 后观察统计，
MS 液体培养基中培养的毛状根生长迅速，转化根
较粗，颜色白色，根系发达，具很多细小的分枝，
而且鲜质量增殖倍数最高，达到 43.5 倍，其他依次
为 R2＞LS＞1/2 MS＞B5＞N6＞改良 White。由此
可见 MS 液体培养基较其他 6 种培养基更适合王不
留行毛状根的培养。从图 3 中可以看出液体培养基
培养王不留行毛状根，它的生长量都随培养时间的
推移而逐渐增加，毛状根的生长趋势呈缓慢上升式
的“S”型曲线。在 1/2 MS、R2、LS、B5、N6、
改良 White 培养基中培养 1～13 d，毛状根的生长比
较缓慢，迟滞期较长；14～21 d 内毛状根进入对数
生长期，生长加快，根系非常发达；22 d 后毛状根
的生长速度变慢，开始进入稳定期，也就是生长的
平台期，生长状态及质量几乎没什么变化。
M 1 2 3
423 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
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图 3 培养基种类对王不留行毛状根生长的影响
Fig. 3 Effects of media on growth of hairy roots of V.
segetalis
3.3 不同 pH 值对毛状根的影响
培养基的 pH 值对发根和次生代谢产物的诱导与
产生均有影响，一般认为 pH 值为酸性对某些农杆菌
Vir 区基因有激活的作用，pH 值一般在 5.0～6.0
时，有利于农杆菌的转化。由表 1 可以看出，王不留
行毛状根在不同 pH 值的培养基中培养，生长状况存
在差异，随着 pH 值的升高毛状根的鲜质量随之增加；
当 pH 值增加到 6.0 左右时，毛状根的鲜质量达到最
大，而且生长旺盛；当 pH 值大于 6.0 时，毛状根的
鲜质量开始降低，当 pH 值达到 9.0 左右时，毛状根
停止生长。可能是因为在活化发根农杆菌时，当 pH
为 6.0 左右，有利于 Vir 区基因的激活，使毛状根快
表 1 不同 pH 值对王不留行毛状根的影响
Table 1 Effects of different pH values on V. segetalis hairy roots
pH 值 接种量/g 鲜质量/g 干质量/g 生长状况
3.0 0.498±0.015 1.934±0.084 0.288±0.026 白色，生长慢
5.0 0.510±0.029 2.684±0.110 0.392±0.015 白色，生长较快
6.0 0.508±0.035 4.324±0.402 0.516±0.021 白色，生长旺盛
7.0 0.502±0.015 2.412±0.077 0.369±0.026 白色，生长较快
8.0 0.526±0.035 2.270±0.058 0.302±0.013 黄白色，生长慢
9.0 0.494±0.023 停止生长 停止生长 停止生长

速增殖。过酸或过碱性均不适合王不留行毛状根的
生长。培养王不留行毛状根的最适合培养基的 pH
值为 6.0。
3.4 不同碳源及碳源质量分数对毛状根的影响
如图 4 所示，当以葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麦
芽糖这 4 种糖为碳源进行培养，毛状根的增殖倍数
均随着培养基中碳源浓度的增加而增加，当这 4
种碳源的质量分数为 3%，毛状根的增殖倍数均
达到最大，都高于本碳源的其他质量分数；当碳
源浓度超过 3%时，随着培养基碳源浓度继续增
加，毛状根增殖倍数反而降低，说明毛状根的生
长受到抑制。培养基中碳源质量分数太高会抑制
毛状根的生长，然而浓度低又满足不了发根对碳
源的吸收需求，所以培养基中碳源质量分数既不
能过高也不能过低，碳源质量分数过高过低均不
利于毛状根的生长。本实验筛选出了最佳碳源为
蔗糖，增殖效果最佳，增殖倍数最高，而且生长
旺盛，颜色白色，其他依次为麦芽糖＞D-果糖＞
葡萄糖，而且当蔗糖质量分数达到 3%时，最适
合王不留行毛状根的生长，此时毛状根的生长最
旺盛，21 d 后增殖倍数最高达到 41 倍。

图 4 不同碳源及浓度对毛状根的影响
Fig. 4 Effects of different carbon sources on V. segetalis
hairy roots
3.5 王不留行毛状根中黄酮苷的分析
分别对王不留行种子和诱导成功的王不留行毛
状根的黄酮苷进行测定，对照品及样品的 HPLC 图
见图 5。
其中王不留行种子中王不留行黄酮苷质量分数
为 0.599%，王不留行叶片诱导的毛状根中王不留行
黄酮苷质量分数为 0.621%，质量分数略高于种子中
的黄酮苷。测定结果符合《中国药典》2010 年版规
定的含王不留行黄酮苷应不少于 0.40%。
蔗糖
麦芽糖
D-果糖
葡萄糖
0 2 4 6 8 10
50
40
30
20
10
0
增
殖
倍
数

质量分数/%

MS
R2
LS
1/2MS
B5
N6
改良 White
0 5 10 15 20 25 30
t/d
50
40
30
20
10
0
增
殖
倍
数

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图 5 王不留行黄酮苷对照品及样品 HPLC 色谱图
Fig. 5 HPLC of vaccarin reference substances and samples
4 讨论
为了建立毛状根的培养体系，对各种影响因素
进行试验及考察，比如发根农杆菌菌株的种类，培
养基的种类，外源激素的种类及其他理化因子。
可是每种植物都有其自身的特点，每种植物毛状根
最佳培养条件也是不同的，这需要进行大量的实验
来验证。
有关王不留行的遗传转化目前还没有报道。
该研究利用 4 种不同发根农杆菌转化王不留行叶
片，确定发根农杆菌 R1601 转化王不留行叶片的
诱导率高，而且生长迅速、根系发达。通过对不
同培养基、不同 pH 值、不同碳源及碳源质量分
数的筛选，确定 pH 值为 6.0，蔗糖质量分数为 3%
的 MS 培养基培养毛状根增殖速度最快，并扩大
培养获得了快速生长、多分支、多根毛的毛状根
株系。用 PCR 对成功诱导出来的王不留行叶片转
化根进行验证，叶片转化根在紫外透射仪下显示
出特异性 DNA 片段，而未转化的王不留行自然根
则没有出现同样的条带，证明 R1601 菌株中质粒
DNA 片段已整合进叶片转化根的基因组中，以提
供分子生物学证据。
利用 HPLC 对王不留行毛状根中黄酮苷的量
进行分析，其中王不留行种子中王不留行黄酮苷
质量分数为 0.599%，王不留行叶片诱导的毛状根
中王不留行黄酮苷质量分数为 0.621%，其量略高
于种子中的黄酮苷。测定结果符合《中国药典》
2010 年版规定的王不留行黄酮苷应不少于
0.40%。本实验建立王不留行毛状根培养体系，并
初步测定了毛状根中的黄酮苷量，为今后筛选适
宜的王不留行发根培养体系及次生代谢产物活性
成分分析研究奠定了基础。
参考文献
[1] 中国药典 [S]. 一部. 2010.
[2] Jia Z H, Koike K, Sahu N P, et al. Triterpenoid saponins
from Caryophyllaceae family [J]. Studies Nat Prod, 2002,
26: 3-61.
[3] 贲爱玲, 蔡小宁, 任源浩, 等. 中药王不留行的组织培
养技术初探 [J]. 南京晓庄学院学报, 2006(6): 54-56.
[4] 李 帆, 梁敬钰. 王不留行的研究进展 [J]. 海峡药学,
2007, 19(3): 1-5.
[5] 邱德有, 宋经元, 马小军, 等. 丹参毛状根生物反应器大
规模培养的研究 [J]. 分子植物育种, 2004, 2(5): 699-703.
[6] 陈伟莉, 牟旭鹏, 刘冬影. 毛状根在植物次生代谢产物
生产方面应用的研究进展 [J]. 黑河学院学报, 2010,
1(4): 122-126.
[7] 李雅丽, 张 凯. 用农杆菌 Ri 诱导蒙古黄芪发根培养
的研究 [J]. 云南植物研究, 2005, 27(2): 204-210.
[8] 彭春秀, 张 梅, 刘庆丰, 等. 曼陀罗毛状根的诱导及
其悬浮培养合成天麻素初探 [J]. 云南农业大学学报,
2008, 23(4): 492-497.
[9] 刘 峻, 丁家宜, 徐 红, 等. Ri 质粒人参转化系统的
建立及鉴定 [J]. 中国中药杂志, 2001, 26(2): 95-99.
[10] 王冲之, 丁家宜. 不同培养基及外源激素对西洋参毛
状根的生长和皂苷含量的影响 [J]. 植物资源与环境学
报, 2001, 10(4): l-4.
[11] Bonhomme V, Laurain-Mattar D, Lacoux J, et al. Tropane
alkaloid production by hairy roots of Atropa belladonna
obtained after transformation with Agrobacterium
rhizogenes 15834 and Agrobacterium tumefaciens
containing rol A, B, C genes only [J]. J Biotechnol, 2000,
81(2/3): 151-158.
[12] 孟 超, 左 旭, 王 莉, 等. 唐古特山莨菪毛状根中
东莨菪碱产生的研究 [J]. 天然产物研究与开发, 2002,
14(1): 21-24.
[13] 杨世海, 刘晓峰, 果德安, 等. 决明毛状根诱导及激素
与诱导子对毛状根生长和蒽醌类化合物合成的影响
[J]. 中草药, 2005, 36(5): 752-756.
[14] 冯 珂. 丹参毛状根培养体系建立及诱导子的作用研
究 [D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2010.
[15] 盛东峰, 陈 龙. 聚乙二醇-6000 胁迫对丹参毛状根中
丹 参 酮 积 累 的 影 响 [J]. 中 草 药 , 2013, 44(9):
1181-1185.
[16] 王 泓, 廖志华, 田桂香, 等. 发根农杆菌介导云南萝
芙木的遗传转化 [J]. 西南师范大学学报: 自然科学版,
2006, 31(2): 137-141.
[17] 孙 敏, 汪 洪, 王 颖. 长春花转化毛状根诱导及培
养条件的优化 [J]. 西南师范大学学报: 自然科学版,
2002, 27(4): 549-552.
0 5.79 11.59 17.36 23.18 28.79 34.77
t/min
对照品
种子
毛状根