全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 2期 2016年 1月

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• 药理与临床 •
基于高内涵技术的 20种中药提取物对 β 淀粉样蛋白致 SH-SY5Y细胞损伤
保护作用研究
王俨如 1, 2，陶晓倩 1, 2，胡玉梅 1, 2，李 娜 1, 2，曹 亮 1, 2，刘文君 1, 2，丁 岗 1, 2，王振中 1, 2，萧 伟 1, 2*
1. 江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001
2. 中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港 222001
摘 要：目的 应用高内涵（HCS）技术快速筛选对 β 淀粉样蛋白（Aβ25-35）致 SH-SY5Y细胞损伤模型有保护作用的中药提取物。
方法 选取 20种中药饮片，每种药材分别进行 20%、40%和 95%乙醇提取，以 Aβ25-35损伤的 SH-SY5Y细胞为模型，采用Hoechst
33342 和 PI 双染，并利用 HCS 技术观察 60 个提取物对模型细胞的保护作用；在此基础上进一步观察活性提取物对模型细胞
Caspase-3/7活性的影响，快速筛选对阿尔茨海默病（AD）有潜在治疗作用的中药提取物。结果 HCS筛选发现，在 60个提取物
中，有 17个提取物对模型细胞具有较好的保护作用；进一步研究显示，其中有 8个提取物对模型细胞 Caspase-3/7活性有较好的
抑制作用。并且以刘寄奴 40%乙醇部位及丹参 20%、40%乙醇部位效果最优。结论 以荧光标记为基础的HCS技术是有效、快速
筛选对 Aβ25-35致 SH-SY5Y细胞损伤模型有保护作用中药提取物的分析方法，筛选出的中药提取物具有潜在的抗AD活性。
关键词：高内涵筛选；中药提取物；阿尔茨海默病；β 淀粉样蛋白；SH-SY5Y细胞；凋亡
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)02 - 0267 - 08
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.02.015
Protection of 20 Chinese materia medica extracts to Aβ25-35-induced SH-SY5Y
cell injury using high content screening
WANG Yan-ru1, 2, TAO Xiao-qian1, 2, HU Yu-mei1, 2, LI Na1, 2, CAO Liang1, 2, LIU Wen-jun1, 2, DING Gang1, 2,
WANG Zhen-zhong1, 2, XIAO Wei1, 2
1. Jiangsu Kanion Parmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China
2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China
Abstract: Objective To identify neuroprotective extracts with the protective effects on Aβ25-35-induced SH-SY5Y cell injury via high
content screening (HCS). Methods Hoechst 33342/PI double staining method was used to screen neuroprotective extracts from 60 Chinese
materia medica (CMM) extracts. Further more, the effects of neuroprotective extracts on Aβ25-35-induced changes in the levels of Caspase-3/7
were detected. Results The results showed that 17 extracts had obviously neuroprotective effects. Among the 17 extracts, 8 of them inhibited
Aβ25-35-induced up-regulation of Caspase-3/7. Conclusion HCS is an efficient method to screen neuroprotective extracts with the protective
effects of Aβ25-35-induced SH-SY5Y cell injury. The neuroprotective extracts have potential medicinal value in Alzheimer’s disease.
Key words: high content screening; Chinese materia medica extracts; Alzheimer’s disease; Aβ25-35; SH-SY5Y cell; apoptosis

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是常
见的中枢神经系统退行性疾病，基本特征为记忆减
退、认知障碍、生活能力进行性减退，发病率随着
年龄的增长而增加，已成为发达国家老年人四大死
因之一。此病病程漫长且不可逆，精神上和经济上
给家庭和社会带来严重的危害。随着我国人口逐渐
老龄化，AD的发病率不断上升，因此，建立有效、
快速筛选抗 AD药物的分析方法、提高抗 AD药物
开发速度，具有重要意义。
高内涵筛选（high content screening，HCS）

收稿日期：2015-04-11
基金项目：国家科技部重大新药创制项目（2013ZX09402203）
作者简介：王俨如（1987—），女，硕士，主要从事药物筛选与药效评价研究。E-mail: yanru719@126.com
*通信作者 萧 伟（1959—），男，研究员级高级工程师，博士，研究方向为中药新药的研究与开发。E-mail: kanionlunwen@163.com
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是基于荧光成像的高效筛选评价技术，近几年在新
药研发领域发挥了重要作用[1]。此项技术不仅能保
持待测细胞结构和功能的完整，还能从单一实验中
获得多种信息，多方面考察待测样品的活性。目前，
HCS 技术已应用到新药研发的各个阶段[2-3]，包括
药物活性筛选、毒性评估和早期的 ADME（吸收、
分布、代谢、排泄）研究等。
中药多成分、多靶点的特点在治疗复杂疾病方
面具有显著优势。根据前期文献报道，本研究选取
了 20种中药，制备了 60个提取物，采用 β 淀粉样
蛋白（Aβ25-35）诱导神经细胞损伤的 AD 体外细胞
模型，结合 HCS技术对中药提取物的细胞保护作用
进行筛选。Aβ 是 AD的主要病理特征之一，在胞外
沉积形成老年斑，这可能是 AD发病原因之一。神
经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞是一种分化程度较低的
神经肿瘤细胞，其形态、生理生化功能类似于正常
神经细胞。研究表明 Aβ25-35诱导 SH-SY5Y 细胞凋
亡和坏死[4]。小檗碱是黄连的重要成分之一，有清
热解毒和抗菌的功效，研究发现，小檗碱还可抑制
Aβ 产生、Tau蛋白过度磷酸化以及参与 AD发病过
程中的关键酶[5-6]，抑制 Aβ 诱导的 SH-SY5Y 细胞
乳酸脱氢酶（LDH）的漏出和肿瘤坏死因子 -α
（TNF-α）水平的上调，对该模型发挥明显的细胞保
护作用[7]。故本研究以小檗碱为阳性药，制备 Aβ25-35
诱导的 SH-SY5Y 细胞损伤模型，采用 Hoechst
33342、碘化丙啶（PI）双染法检测细胞晚期凋亡和
坏死水平，Calcein Blue、Caspase-3/7双染检测凋亡
相关蛋白 Caspase-3/7水平，建立以荧光标记为基础
的、有效、快速抗 Aβ25-35致 SH-SY5Y 细胞损伤模
型药物的分析方法，为治疗 AD药物的研发提供理
论依据。
1 材料
1.1 细胞
神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞购自南京凯基生
物科技发展有限公司，用含 10%胎牛血清的 RPMI
1640完全培养基于 37 ℃、5% CO2孵箱中培养。每
3天按 1∶5传代 1次，取对数生长期细胞进行实验。
1.2 药材及主要试剂
益母草 Leonurus ja ponicus Houtt.、木香
Aucklandia lappa Decne.、乌药 Lindera aggregate
(Sims) Kosterm.、刘寄奴 Siphonostegia chinensis
Benth.、肉苁蓉 Cistanche deserticola Y. C. Ma、当归
Angelica sinensis (Oliv.) Diels 、 丹 皮 Paeonia
suffruticosa Andr.、续断 Dipsacus asper Wall. ex
Henry、杜仲 Eucommia ulmoides Oliv.、防己
Stephania tetrandra S. Moore、泽兰 Lycopus lucidus
Turcz. var. hirtus Regel、丹参 Salvia miltiorrhiza
Bge.、牛膝 Achyranthes bidentata Bl.、淫羊藿
Epimedium brevicornu Maxim.、地锦草 Euphorbia
humifusa Willd.、分心木 Juglans regia L.、赤芍
Paeonia lactiflora Pall.、元胡 Corydalis yanhusuo W.
T. Wang、女贞子 Ligustrum lucidum Ait.、旱墨莲
Eclipta prostrala L. 20种中药材饮片，购自连云港康
济大药房，经江苏康缘药业股份有限公司王振中研
究员鉴定均为正品；RPMI 1640培养基，南京凯基
生物科技发展有限公司；胎牛血清，杭州天杭生物
科技有限公司；胰蛋白酶，购自 Gibco公司；Aβ25-35、
Hoechst 33342、PI，购自 Sigma公司；Calcein Blue、
Cell Event Caspase-3/7 Green Detection Reagent，购
自 Molecular Probes 公司；其他试剂均为分析纯。
小檗碱购自中国食品药品检定研究院（批号
110713-201212，质量分数 86.7%），二甲基亚砜
（DMSO）购自 Sigma公司。
1.3 仪器
SW-CJ-2F型超净工作台（上海博迅实业有限公
司）；Thermo 3111型CO2培养箱（美国Thermo Fisher
Scientific）；XDS-1 型倒置显微镜（重庆光学仪器
厂）；LDZ5-2型离心机（北京京力离心机有限公司）；
countess型细胞自动计数仪（美国 Invitrogen公司）；
ImageXpress Micro型高内涵细胞分析仪（美国MD
公司）；调温电热套（通州市申通电热器厂）；R502
旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；FD-1B-55
冷冻干燥机（北京博医康实验有限公司）；HH-4数
显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；MP15KC 计
数天平（上海恒平科学仪器有限公司）。
2 方法
2.1 中药提取物的制备
称取各单味药材饮片 300 g置于 5 L烧瓶中，
加入 10倍量水浸泡 1 h后，回流 2 h，绢布滤过，
再加入 8倍量水回流 1 h，绢布滤过，合并 2次提取
液，静置；取上清液上柱体积（BV）为 500 mL的
大孔树脂，4 BV纯化水去杂后，不同体积分数乙醇
梯度洗脱，体积流量 2 BV/h，依次得到 20%、40%、
95%乙醇洗脱部位，旋转蒸发仪 70 ℃浓缩至小体
积，水浴蒸干，冷冻干燥后分别得到各药材 20%、
40%、95%乙醇洗脱部位样品。样品用 DMSO溶解，
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配成 200 mg/mL母液，−20 ℃保存。
2.2 试剂的配制
Aβ25-35溶液：1 mg Aβ25-35溶于 943 μL 无菌超纯
水中，配成 1 mmol/L的母液，放于 37 ℃培养箱中
老化 7 d；Hoechst 33342溶液：100 mg Hoechst 33342
溶于 10 mL磷酸缓冲液（PBS）中，配成 10 mg/mL
母液；PI溶液：250 mg PI溶于 12.5 mL DMSO中，
配成 20 mg/mL母液；Calcein Blue溶液：1 mg Calcein
Blue溶于 42.97 μL DMSO中，配成 50 mmol/L母液，
分装。以上试剂配制完成后均−20 ℃保存备用。实
验前用 RPMI 1640培养基稀释成实验所需浓度。
2.3 分组及给药
将细胞分为对照组、模型组、阳性药（小檗碱）
组和给药组。取对数生长期细胞，调整密度为
6×104/mL，每孔 100 μL 接种于 96孔板，37 ℃、
5% CO2孵箱中培养 18～20 h。20 h后吸弃旧培养
基，对照组和模型组加入 100 μL 含 0.1% DMSO的
空白培养基，阳性药组加入 100 μL 含 25 μg/mL小
檗碱的培养基，给药组加入 100 μL 含 10 μg/mL中
药提取物的培养基，各组 DMSO 体积分数不高于
0.1%，每组设 3个复孔。药物作用 4 h后，对照组加
入 100 μL 的空白培养基，模型组、阳性药组和给药
组加入 100 μL 含 20 μmol/L Aβ25-35的培养基（Aβ25-35
终浓度为 10 μmol/L）；孔内总体积为 200 μL。放于
培养箱继续孵育 48 h后进行各项指标测定。
2.4 Hoechst 33342和 PI双染
各组细胞 96孔板孵育 48 h后，1 500 r/min离
心 5 min，每孔小心吸除 150 μL 培养基，加入 50 μL
的 Hoechst 33342、PI染液（RPMI 1640培养基稀释，
Hoechst 33342、PI 终质量浓度分别为 10、15
μg/mL），避光，放入细胞培养箱中孵育 10 min后，
立即用高内涵细胞分析仪进行细胞成像。
2.5 Calcein Blue和 Caspase-3/7双染
各组细胞 96孔板孵育 48 h后，1 500 r/min离
心 5 min，弃去板中液体，各孔加入 100 μL Calcein
Blue染液（RPMI 1640培养基稀释，终浓度为 50
μmol/L），避光，放入培养箱中孵育 30 min 后，
用预热的 RPMI 1640培养基洗板 3次，各孔加入
100 μL的 Caspase-3/7染液（RPMI 1640培养基稀
释，终浓度 5 μmol/L），避光，放入细胞培养箱中
孵育 30 min后，立即用高内涵细胞分析仪进行细
胞成像。
2.6 细胞成像与分析
Hoechst 33342和 PI双染成像条件如下：10倍
物镜，每孔取 4 个视野。Hoechst 33342 激发波长
377 nm，发射波长 447 nm；PI激发波长 543 nm，
发射波长 593 nm。以 4个视野中的 Hoechst 33342
染色细胞数（蓝色）记为总细胞数，PI染色细胞数
（红色）记为晚期凋亡和坏死细胞数，阳性率＝PI
染色细胞数/Hoechst 33342 染色细胞数，保护率＝
(模型组阳性率－给药组阳性率)/(模型组阳性率－
对照组阳性率)。
Calcein Blue和Caspase-3/7双染成像条件如下：
10倍物镜，每孔取 4个视野。Calcein Blue激发波
长 377 nm，发射波长 447 nm；Caspase-3/7激发波
长 482 nm，发射波长 536 nm。以 Calcein Blue染色
细胞数（蓝色）作为总细胞数，以 Caspase-3/7染色
细胞数（绿色）作为阳性细胞数，阳性率＝
Caspase-3/7染色细胞数/Calcein Blue染色细胞数，
抑制率＝(模型组阳性率－给药组阳性率)/(模型组
阳性率－对照组阳性率)。
3 结果
3.1 模型评价
Aβ25-35导致 SH-SY5Y细胞 PI和Caspase-3/7阳
性细胞数增加，引起细胞发生凋亡、坏死以及激活
Caspase-3/7，阳性药小檗碱对细胞的凋亡和坏死、
Caspase-3/7的激活均有明显的抑制作用（P＜0.01），
该模型可用于药物筛选。结果见表 1。
表 1 双染法检测小檗碱的神经保护作用 ( x±s, n = 3)
Table 1 Neuroprotective effects of berberine on Aβ25-35-induced SH-SY5Y cell injury by double staining ( x±s, n = 3)
组别 ρ/(μg∙mL−1)
Hoechst 33342/PI Calcein Blue/(Caspase-3/7)
阳性率/% 保护率/% 阳性率/% 抑制率/%
对照 — 1.09±0.34 — 9.23± 7.79 —
模型 — 25.68±6.10** — 59.79±10.40** —
小檗碱 25 1.21±0.05## 99.53 18.17± 3.12## 82.32
与对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：##P＜0.01
**P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs model group
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3.2 60 个中药提取物对 Aβ25-35诱导的神经细胞损
伤的保护作用
应用模型对 60 个提取物进行筛选，保护率在
80%～90%的提取物有8个，90%以上的提取物有9个，
结果见表 2。其中刘寄奴 40%乙醇部位及丹参 20%、
40%乙醇部位保护效果最优，结果见表 2和图 1。
3.3 保护作用较强的 17个中药提取物对 Aβ25-35损
伤神经细胞中 Caspase-3/7活性的影响
挑选Hoechst 33342/PI模型保护率在 80%以上
的 17 个 中 药 提 取 物 ， 采 用 Calcein Blue/
(Caspase-3/7)双染法观察 17 个中药提取物对模型
细胞 Caspase-3/7 活性的影响，抑制率在 80%～
90%的中药提取物有 5个，结果见表 3。其中刘寄
奴 40%乙醇部位及丹参 20%、40%乙醇部位提取
物抑制率最优，均在 90%以上，能够较好地抑制
Aβ25-35诱导的神经细胞中 Caspase-3/7活性增加，
见图 2。结果提示应用 HCS技术能够筛选出具有
神经细胞保护活性的中药提取物。
表 2 Hoechst 33342和 PI双染法检测 60个中药提取物的神经保护作用 ( x±s, n = 3)
Table 2 Neuroprotective effects of 60 CMM extracts on Aβ25-35-induced SH-SY5Y cell injury by Hoechst 33342/PI double
staining ( x±s, n = 3)
药材 提取部位 PI阳性率/% 保护率/% 药材 提取部位 PI阳性率/% 保护率/%
益母草 20%乙醇部位 7.09±1.51 75.59 泽兰 20%乙醇部位 1.25±0.28 97.07
40%乙醇部位 4.31±0.68 86.91 40%乙醇部位 2.35±0.40 91.58
95%乙醇部位 12.98±2.43 51.66 95%乙醇部位 20.57±2.85 1.08
木香 20%乙醇部位 8.36±1.65 70.44 丹参 20%乙醇部位 0.81±0.10 99.26
40%乙醇部位 4.51±0.40 86.09 40%乙醇部位 2.42±0.67 99.89
95%乙醇部位 46.22±5.03 −83.56 95%乙醇部位 7.28±0.77 71.95
乌药 20%乙醇部位 4.99±1.34 84.15 牛膝 20%乙醇部位 20.11±2.00 −1.77
40%乙醇部位 2.78±0.29 93.12 40%乙醇部位 26.69±1.99 −39.62
95%乙醇部位 6.28±1.62 78.89 95%乙醇部位 28.29±2.26 −48.82
刘寄奴 20%乙醇部位 1.69±0.27 97.55 淫羊藿 20%乙醇部位 8.16±4.03 66.91
40%乙醇部位 1.64±0.50 97.76 40%乙醇部位 13.90±1.03 33.92
95%乙醇部位 3.12±0.17 91.74 95%乙醇部位 21.68±2.60 −10.83
肉苁蓉 20%乙醇部位 9.39±2.29 66.26 地锦草 20%乙醇部位 3.21±0.72 95.35
40%乙醇部位 3.88±1.22 88.64 40%乙醇部位 4.62±0.59 87.23
95%乙醇部位 5.92±1.70 80.38 95%乙醇部位 5.70±1.26 81.04
当归 20%乙醇部位 9.88±0.71 64.23 分心木 20%乙醇部位 7.89±1.16 68.46
40%乙醇部位 15.77±2.54 40.28 40%乙醇部位 21.24±3.24 −8.30
95%乙醇部位 13.57±2.16 35.85 95%乙醇部位 9.75±0.68 57.77
丹皮 20%乙醇部位 5.09±0.79 77.97 赤芍 20%乙醇部位 10.91±3.59 51.09
40%乙醇部位 5.82±2.49 74.38 40%乙醇部位 12.10±1.52 44.24
95%乙醇部位 9.78±0.44 54.68 95%乙醇部位 14.55±5.00 30.14
续断 20%乙醇部位 3.58±0.16 85.48 元胡 20%乙醇部位 24.01±1.91 −29.02
40%乙醇部位 13.13±0.71 38.01 40%乙醇部位 23.93±3.26 −28.56
95%乙醇部位 23.79±0.11 −14.94 95%乙醇部位 13.10±5.52 38.81
杜仲 20%乙醇部位 9.03±2.06 58.42 女贞子 20%乙醇部位 14.92±0.92 27.45
40%乙醇部位 13.10±4.01 38.20 40%乙醇部位 13.36±0.75 37.20
95%乙醇部位 21.58±3.90 −3.96 95%乙醇部位 12.21±2.19 44.34
防己 20%乙醇部位 19.22±3.66 7.79 旱墨莲 20%乙醇部位 11.99±1.53 45.69
40%乙醇部位 17.36±2.58 16.99 40%乙醇部位 10.43±2.89 55.40
95%乙醇部位 96.39±1.33 −375.73 95%乙醇部位 21.34±5.12 −12.43
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Hoechst 33342 PI 组合
图 1 刘寄奴 40%乙醇部位及丹参 20%、40%乙醇部位对Aβ25-35致 SH-SY5Y细胞损伤模型的保护作用
Fig. 1 Protective effects of three CMM extracts on Aβ25-35-induced SH-SY5Y cell injury
表 3 Calcein Blue和 Caspase-3/7双染法检测 17个中药提取物对模型细胞 Caspase-3/7活性的影响 ( x±s, n = 3)
Table 3 Effects of 17 CMM extracts on cell model of Caspase-3/7 by Calcein Blue and Caspase-3/7 double staining ( x±s, n = 3)
药材 提取部位 Caspase-3/7阳性率/% 抑制率/% 药材 提取部位 Caspase-3/7阳性率/% 抑制率/%
益母草 40%乙醇部位 39.67± 8.98 39.80 续断 20%乙醇部位 52.01±5.27 15.39
木香 40%乙醇部位 49.97± 3.86 19.42 泽兰 20%乙醇部位 14.80±3.15 88.98
乌药 20%乙醇部位 37.56±11.84 43.98 40%乙醇部位 31.21±5.60 56.53
40%乙醇部位 34.05± 2.79 50.90 丹参 20%乙醇部位 11.42±3.33 95.67
刘寄奴 20%乙醇部位 18.68± 1.41 81.29 40%乙醇部位 11.16±1.31 96.18
40%乙醇部位 13.97± 1.97 90.61 地锦草 20%乙醇部位 14.51±2.55 89.55
95%乙醇部位 30.19± 7.61 58.54 40%乙醇部位 18.35±1.40 81.96
肉苁蓉 40%乙醇部位 35.26± 4.33 48.53 95%乙醇部位 17.53±4.36 83.58
95%乙醇部位 50.96± 8.79 17.46
对照



模型




小檗碱



刘寄奴
40%乙醇部位



丹参
20%乙醇部位


丹参
40%乙醇部位
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Calcein Blue Caspase-3/7 组合
图 2 刘寄奴 40%乙醇部位及丹参 20%、40%乙醇部位对 Aβ25-35致 SH-SY5Y细胞损伤模型 Caspase-3/7活性的影响
Fig. 2 Effects of three CMM extracts on Caspase-3/7 activity in SH-SY5Y cell injuried by Aβ25-35
4 讨论
AD 是最常见的神经退行性疾病，此病病理特
征是神经元胞外形成老年斑（senile plaque，SP）、
神经元胞内形成神经原纤维缠结（neurofibrillary
tangles，NFTs）以及神经元的丢失。此病发病机制
至今不明，病因有多种学说，例如 β-淀粉样蛋白
（Aβ）沉积学说、基因突变学说、胆碱能受损学说、
铝中毒假说等。目前认为，Aβ 是各种原因诱导 AD
的共同通路，是 AD发生过程中的重要环节[8]。Aβ
是淀粉样前体蛋白（APP）的一个 39～43个氨基酸
残基组成的肽段，是 SP 的主要成分。研究认为痴
呆的发生是由于 Aβ 在脑内广泛沉积，最终引起神
对照




模型





小檗碱




刘寄奴
40%乙醇部位



丹参
20%乙醇部位




丹参
40%乙醇部位
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 2期 2016年 1月

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经元退化和凋亡[9]。聚集态的 Aβ 不仅能够直接对
神经元产生损伤作用，同时也能增强神经元对兴奋
性氨基酸、神经毒素等损伤因子的敏感性，诱导神
经元出现坏死和凋亡[10-12]。Aβ 损伤神经元初期，细
胞膜完整，细胞逐渐皱缩，同时发生核固缩等现象，
最终形成凋亡小体[13]。Aβ 损伤神经元后 24 h，提
取神经元 DNA，DNA ladder 检测结果也证实凋亡
的发生[14]。目前普遍认为细胞凋亡是半胱氨酸蛋白
酶 Caspase级联反应的结果，Caspase-3、6、7处于
级联反应下游，是凋亡的执行者。研究发现，Aβ25-35
可引起小脑颗粒细胞和皮质神经元发生凋亡，模型
细胞中 Caspase-3活性增加，Caspase-3特异性抑制
剂可抑制 Aβ25-35造成的损伤[15]。向大鼠脑室内注射
Aβ 可以活化 Caspase-3 和 Caspase-7[16]，也有研究
认为，Aβ 活化凋亡通路上游的启动蛋白酶，经级联
放大反应激活下游的效应蛋白酶[17]。Caspase-3在凋
亡中起重要作用，以酶原形式存在的 Caspase-3 被
激活后，活化的 Caspase-3 切割多种蛋白质底物，
例如细胞骨架蛋白、抗凋亡蛋白和修复 DNA 的酶
等，最终导致细胞死亡[18]。
本研究利用 Aβ25-35损伤 SH-SY5Y 细胞建立体
外AD模型，小檗碱为阳性对照，采用Hoechst 33342
和 PI双染法，利用 HCS技术观察 60个中药提取物
对模型细胞的保护作用，Hoechst33342、PI 均可与
DNA结合，Hoechst 33342为膜通透性染料，而 PI
不能通过正常的细胞膜，只有在细胞处于晚期凋亡
或坏死时，PI 可与核结合。并用 Calcein Blue 和
Caspase-3/7 双染法观察活性提取物对模型细胞
Caspase-3/7活性的影响。Caspase-3/7均为下游效应
蛋白酶，直接作用于底物蛋白，引起凋亡。
Caspase-3/7的激活被认为是凋亡发生的关键事件，
以 caspase-3/7的活化水平反应细胞的凋亡水平[19]。
该染料被凋亡细胞中的 Caspase-3/7切割后，切割产
物可与 DNA结合，发出绿色荧光；Calcein Blue被
活细胞摄取后，切割 AM基团，切割产物无法自由
出入细胞，在胞内呈蓝色荧光。研究发现，刘寄奴
40%乙醇部位及丹参 20%、40%乙醇部位对 Aβ25-35
引起的细胞损伤有较好的保护作用。
虽然刘寄奴对 AD的治疗活性未见报道，但北
京大学的研究人员从刘寄奴中分离得到 11 个黄酮
类化合物和 2个黄酮木脂素类化合物，其中包括柚
皮素和槲皮素[20]。有报道指出，柚皮素可减少链脲
佐菌素诱导的 AD模型大鼠 Tau蛋白磷酸化水平和
Aβ 的水平，改善模型大鼠的认知能力和学习记忆能
力[21]。槲皮素能够降低喹啉酸诱导的 AD模型大鼠
海马组织钙水平和血清自由基水平，改善模型大鼠
学习记忆能力[22-23]。有研究指出，丹参能够缓解
AlCl3致 AD模型小鼠学习记忆能力的减退，降低模
型小鼠脑内及血清中胆碱酯酶活性[24]。丹参提取物
隐丹参酮能够剂量依赖的减少跳台实验和水迷宫实
验的错误次数，改善模型小鼠的学习记忆能力[25]。
槲皮素、柚皮素和隐丹参酮可能是这 3种中药提取
物中的活性成分。它们对 Aβ25-35致 SH-SY5Y 细胞
损伤模型保护作用可能与抗凋亡作用有关，本研究
为开发治疗 AD药物提供了实验依据。
综上所述，本研究应用 HCS技术观察 60个中
药提取物对 Aβ25-35致 SH-SY5Y 细胞损伤模型的保
护作用，筛选所得提取物对 Aβ25-35致 SH-SY5Y 细
胞损伤模型有较好的保护作用，可能是通过抑制
Caspase-3/7的活性、抑制凋亡通路而发挥作用的。
此方法与传统的荧光显微镜相比，具有通量高、效
率高的优点，能够快速、客观地把图片结果转换为
数值结果；与流式细胞术相比，无需消化细胞，细
胞成团对实验无太大影响，需要的细胞量少；与
Western Blotting相比，减少了细胞蛋白提取、定量、
电泳分离等一系列步骤，大大缩短了检测时间。应
用 HCS 技术快速发现具有潜在活性的药物对新药
研发具有重要意义。
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