全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 12 期 2014 年 6 月

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热毒宁注射液抗病毒活性成分研究（I）
李海波 1, 2, 3，于 洋 3，王振中 1, 2，萧 伟 1, 2*，姚新生 3*
1. 江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001
2. 中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港 222001
3. 暨南大学中药及天然药物研究所，广东 广州 510632
摘 要：目的 对中药复方热毒宁注射液抗病毒活性成分进行研究。方法 采用流感病毒致应激负荷小鼠模型进行热毒宁注
射液抗病毒活性部位的筛选，综合应用各种现代色谱技术对活性部位进行分离和纯化，根据化合物的光谱数据和理化性质进
行结构鉴定。采用检测流感病毒神经氨酸酶活性的方法，对分离得到的黄酮类化合物进行了体外抗甲型流感病毒（A/PR/8/34
H1N1）的活性测试。结果 热毒宁注射液经大孔吸附树脂 95%乙醇洗脱部位为抗病毒活性部位，从中分离鉴定了 20 个化合
物，分别鉴定为丁香酸（1）、阿魏酸（2）、苯甲酸（3）、咖啡酸（4）、对羟基苯甲醛（5）、香草醛（6）、4-羟基-3-甲氧基苯
丙酸（7）、反式对羟基桂皮酸（8）、反式邻羟基桂皮酸（9）、反式桂皮酸（10）、7-羟基-6-甲氧基-香豆素（11）、7-羟基-6, 8-
二甲氧基-香豆素（12）、香豆素（13）、3-羟基-1, 2-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1-丙酮（14）、异鼠李素（15）、槲皮素（16）、
木犀草素（17）、芦丁（18）、金丝桃苷（19）、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（20）；其中木犀草素对流感病毒的 EC50值
小于 50 μmol/L，选择指数（SI）值大于 10，具有较强的抗甲型流感病毒活性。结论 化合物 1～20 均为首次从热毒宁注射
液中分离得到，木犀草素为热毒宁注射液抗病毒活性成分之一。
关键词：热毒宁注射液；丁香酸；咖啡酸；香草醛；异鼠李素；槲皮素；木犀草素；抗病毒活性
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)12 - 1682 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.12.005
Research on antiviral constituents in Re-Du-Ning Injection (I)
LI Hai-bo1, 2, 3, YU Yang3, WANG Zhen-zhong1, 2, XIAO Wei1, 2, YAO Xin-sheng3
1. Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China
2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China
3. Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Products, College of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou 510632, China
Abstract: Objective To study the antiviral constituents from the active fraction of Re-Du-Ning (RDN) Injection. Methods In this
study, the active fraction of RDN Injection was screened by the mice model loaded with restraint stress infected with influenza virus.
The investigation on this fraction led to the isolation and identification of compounds through various chromatographic techniques and
spectroscopic methods. In addition, the in vitro activity on influenza virus A (A/PR/8/34 H1N1) of the flavonoids was evaluated in
vitro by the method for the detection of anti-influenza virus neuraminidase activity. Results Through the macroporous adsorption
resin, 95% ethanol eluate of RDN Injection was proved to be the antivirus active fraction of RDN Injection. Twenty compounds were
obtained and characterized as syringic acid (1), ferulic acid (2), benzoic acid (3), caffeic acid (4), p-hydroxy benzaldehyde (5), vanillin
(6), 4-hydroxy-3-methoxy styrene acrylic acid (7), trans-p-hydroxy cinnamic acid (8), trans-o-hydroxy cinnamic acid (9),
trans-cinnamic acid (10), 7-hydroxy-6-methoxy coumarin (11), 7-hydroxy-6, 8-dimethoxy coumarin (12), coumarin (13), 3-hydroxy-1,
2-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1-propanone (14), isorhamnetin (15), quercetin (16), luteolin (17), rutin (18), hyperoside (19), and
luteolin-7-O-β-D-glucoside (20). Among them, luteolin exhibited the antivirus activity against Flu A virus. Conclusion All the
isolated compounds are reported from RDN Injection for the first time, and luteolin exhibits the most potential activity against H1N1.
Key words: Re-Du-Ning Injection; syringic acid; caffeic acid; vanillin; isorhamnetin; quercetin; luteolin; antivirus activity

收稿日期：2014-03-01
基金项目：国家重点基础研究发展计划（“973”计划）新药研制过程化学机制：中药制药过程控制技术模式和方式研究（2010CB735604）
作者简介：李海波（1985—），女，福建省宁德市人，博士，研究方向为中药及天然药物的活性成分研究。E-mail: lihaibo1985124@sina.com
*通信作者 萧 伟，教授，博士生导师，研究方向为中药新剂型的研究与开发。Tel: (0518)85521956 E-mail: xw_kanion@163.com
姚新生，中国工程院院士，博士生导师，研究方向为中药及天然药物活性成分研究。Tel: (020)85225849 E-mail: tyaoxs@jnu.edu.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 12 期 2014 年 6 月

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热毒宁注射液由金银花、栀子和青蒿 3 味常用
中药组合而成，主要用于外感风热所致流感、高热
不退、咳嗽、上呼吸道感染等症，临床上退热作用
迅速、抗病毒效果显著[1]。本课题组采用流感病毒
致应激负荷小鼠模型[2]对热毒宁注射液及其分离部
位进行了活性评价，确定大孔吸附树脂 95%乙醇洗
脱部位为热毒宁注射液抗病毒活性部位。本研究在
此基础上对活性部位进行了系统地化学成分研究，
从中分离得到了 20 个化合物，分别鉴定为丁香酸
（syringic acid，1）、阿魏酸（ferulic acid，2）、苯甲
酸（benzoic acid，3）、咖啡酸（caffeic acid，4）、
对羟基苯甲醛（p-hydroxy benzaldehyde，5）、香草
醛（vanillin，6）、4-羟基-3-甲氧基苯丙酸（4-hydroxy-
3-methoxy styrene acrylic acid，7）、反式对羟基桂皮
酸（trans-p-hydroxy cinnamic acid，8）、反式邻羟基
桂皮酸（trans-o-hydroxy cinnamic acid，9）、反式桂
皮酸（trans-cinnamic acid，10）、7-羟基-6-甲氧基-
香豆素（7-hydroxy-6-methoxy coumarin，11）、7-羟
基-6, 8-二甲氧基-香豆素（7-hydroxy-6, 8-dimethoxy
coumarin，12）、香豆素（coumarin，13）、3-羟基-1,
2-双 (4-羟基-3-甲氧基苯基)-1-丙酮 [3-hydroxy-1,
2-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1-propanone，14]、
异鼠李素（isorhamnetin，15）、槲皮素（quercetin，
16）、木犀草素（luteolin，17）、芦丁（rutin，18）、
金丝桃苷（hyperoside，19）、木犀草素-7-O-β-D-吡
喃葡萄糖苷（luteolin-7-O-β-D-glucoside，20）。所
有化合物均为首次从热毒宁注射液中分离得到，对
分离得到的黄酮类化合物进行体外抗甲型流感病毒
（A/PR/8/34 H1N1）作用研究，结果显示木犀草素对
流感病毒的 EC50 值小于 50 μmol/L，选择指数（SI）
值大于 10，具有较强的体外抗甲型流感病毒的活性。
1 仪器与材料
Brucker AVANCE400 型核磁共振仪（瑞士
Brucker 公司），Finnigan LCQ Advantage MAX 质谱
仪（美国 Thermo Fisher Scientific 公司），Waters
Snapt G2 mass spectrometer 高分辨质谱仪（美国
Waters 公司），Shimadzu 分析高效液相色谱（日本
Shimadzu 公司，Shimadzu LC-6AD 泵，紫外检测
器），Shimadzu 制备型高效液相色谱（日本 Shimadzu
公司）。分析高效液相色谱柱为 C18 柱（250 mm×
4.6 mm，5 μm，Nacalai Tesque Inc.，日本），制备
高效液相色谱柱为 C18 柱（250 mm×20 mm，5 μm，
Nacalai Tesque Inc.，日本）。薄层硅胶 GF254 和柱色
谱硅胶（青岛海洋化工厂），HP-20 大孔树脂
（Mitsubishi-Chemical，日本），反相 ODS 填料（Merck
公司），Sephadex LH-20 填料（Amersham Biosciences
公司），Toyo-pearl HW-40 填料（Toyo Soda MFG）。
热毒宁注射液（江苏康缘药业股份有限公司生产，
批号 100906）。
2 提取与分离
热毒宁注射液成品浓缩液 840 g，用适量水溶解
后经 HP-20 大孔吸附柱色谱，乙醇-水梯度洗脱，得
到水洗脱部位 RDN-1（410 g），30%乙醇洗脱部位
RDN-2（318 g），95%乙醇洗脱部位 RDN-3（84 g）。
取 95%乙醇洗脱部位 RDN-3（65 g）进行硅胶柱色
谱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱得到 Fr. 1～9 共 9 个流
分。Fr. 1 经过 ODS 中低压柱色谱分离，甲醇-水梯
度洗脱，70%甲醇-水洗脱部分经 Sephadex LH-20
（氯仿-甲醇 1∶1）柱色谱分离，再经过 HPLC 制备
（65%甲醇），得到化合物 3（17.4 mg）、5（8.9 mg）、
6（7.5 mg）、10（7.8 mg）和 14（4.3 mg），50%甲
醇-水洗脱部分经 Sephadex LH-20 柱色谱分离（氯
仿-甲醇，1∶1）再经过 HPLC 制备（30%乙腈），
得到化合物 1（15.8 mg）、2（8.9 mg）、7（6.7 mg）、
11（8.9 mg）、12（9.3 mg）和 13（2.5 mg）。Fr. 2 经
过 ODS 中低压柱色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，40%
甲醇-水洗脱部分经 Sephadex LH-20（甲醇-水 1∶1）
柱色谱分离，HPLC 制备（20%乙腈）得到化合物 8
（9.5 mg）和 9（8.8 mg）。Fr. 4 经过 ODS 中低压柱
色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，70%甲醇-水洗脱部分
经 HPLC 制备（45%甲醇水），得到化合物 15（3.7
mg）、16（5.1 mg）和 17（25.4 mg），40%甲醇-水
洗脱部位经 Sephadex LH-20 柱色谱分离，50%甲
醇水等度洗脱得到 3 个流分 Fr. a～c，Fr. a 重结晶
得到化合物 20（70 mg），Fr. b 洗脱部分经 HPLC
制备（45%甲醇-水），得到化合物 18（4.7 mg）
和 19（5.3 mg）。Fr. 6 经过 ODS 中低压柱色谱，
甲醇-水梯度洗脱，50%甲醇-水洗脱部分经 HPLC
制备（45%甲醇-水），得到化合物 4（10.7 mg）。
3 结构鉴定
化合物 1：白色针状结晶（甲醇），ESI-MS m/z:
199 [M＋H]+, 221 [M＋Na]+, 197 [M－H]−，相对分
子质量为 198。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.32
(2H, s, H-2, 6), 3.87 (6H, s, H-3, 5-OCH3)；13C-NMR
(100 MHz, CD3OD) δ: 170.0 (COOH), 148.8 (C-3, 5),
141.7 (C-4), 121.9 (C-1), 108.3 (C-2, 6), 56.7 (C-3,
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5-OCH3)。以上数据与文献报道一致[3]，故鉴定化合
物 1 为丁香酸。
化合物 2：白色粉末，ESI-MS m/z: 217 [M＋
Na]+, 193 [M－H]−，相对分子质量为 194。结合
1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为 C10H10O4，
不饱和度为 6。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.58
(1H, d, J = 15.9 Hz, H-7), 7.16 (1H, d, J = 1.9 Hz,
H-2), 7.08 (1H, dd, J = 1.9, 8.2 Hz, H-6), 6.80 (1H, d,
J = 8.2 Hz, H-5), 6.30 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-8), 3.88
(3H, s, 3-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ:
171.1 (C-9-COOH), 146.8 (C-7), 150.5 (C-4), 149.4
(C-3), 127.8 (C-1), 124.0 (C-8), 116.5 (C-6), 116.1
(C-5), 111.7 (C-2), 56.4 (C-3-OCH3)。以上数据与文
献报道一致[4]，故鉴定化合物 2 为阿魏酸。
化合物 3：无色针状结晶（甲醇），ESI-MS m/z: 121
[M－H]−，相对分子质量为 122。1H-NMR (400 MHz,
CD3OD) δ: 8.00 (2H, m, H-3, 5), 7.57 (1H, tt, J = 1.4,
8.7 Hz, H-4), 7.48 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-2, 6)；
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 170.1 (-COOH),
132.0 (C-1), 134.0 (C-4), 130.7 (C-2, 6), 129.4 (C-3,
5)。以上数据与文献报道一致[5]，故鉴定化合物 3
为苯甲酸。
化合物 4：淡黄色结晶（甲醇），ESI-MS m/z: 203
[M＋Na]+, 179 [M－H]−，相对分子质量为 180。结
合 1H-NMR和 13C-NMR数据确定分子式为C9H8O4，
不饱和度为 6。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.53
(1H, d, J = 15.9 Hz, H-7), 7.03 (1H, d, J = 1.8 Hz,
H-2), 6.93 (1H, dd, J = 1.8, 8.5 Hz, H-6), 6.78 (1H, d,
J = 8.2 Hz, H-5), 6.22 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-8)；
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 171.1 (9-COOH),
146.9 (C-7), 149.4 (C-4), 146.8 (C-3), 127.8 (C-1), 122.8
(C-8), 116.5 (C-6), 115.7 (C-5), 115.1 (C-2)。以上数据
与文献报道一致[6]，故鉴定化合物 4 为咖啡酸。
化合物 5：白色粉末，ESI-MS m/z: 123 [M＋H]+,
145 [M＋Na]+, 121 [M－H]−，相对分子质量为 122。
结合 1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为
C7H6O2，不饱和度为 5。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)
δ: 9.76 (1H, s, CHO), 7.77 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-2, 6),
6.91 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-3, 5)；13C-NMR (100 MHz,
CD3OD) δ: 192.8 (CHO), 164.6 (C-4), 133.4 (C-2, 6),
130.1 (C-1), 116.9 (C-3, 5)。以上数据与文献报道一
致[7]，故鉴定化合物 5 为对羟基苯甲醛。
化合物 6：无色针晶（甲醇），ESI-MS m/z: 153
[M＋H]+, 151 [M－H]−，相对分子质量为 152。结合
1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为 C8H8O3，
不饱和度为 5。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 9.73
(1H, s, CHO), 7.43 (1H, dd, J = 8.5, 1.7 Hz, H-6),
7.41 (1H, d, J = 1.7 Hz, H-2), 6.94 (1H, d, J = 8.5 Hz,
H-5), 3.91 (3H, s, 3-OCH3)；13C-NMR (100 MHz,
CD3OD) δ: 192.9 (CHO), 154.7 (C-4), 149.7 (C-3),
130.6 (C-1), 127.9 (C-6), 116.3 (C-5), 111.2 (C-2),
56.3 (C-3-OCH3)。以上数据与文献报道一致[8]，故
鉴定化合物 6 为香草醛。
化合物7：白色粉末，ESI-MS m/z: 195 [M－H]−，
推出化合物相对分子质量为 196。结合 1H-NMR 和
13C-NMR 数据确定分子式为 C10H12O4，不饱和度为
5。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 6.82 (1H, d, J =
1.7 Hz, H-2), 6.69 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 6.66 (1H,
dd, J = 1.5, 8.0 Hz, H-6), 3.85 (3H, s, 3-OCH3), 2.84
(2H, t, J = 7.5 Hz, H-7), 2.54 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-8)；
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 170.1 (9-COOH),
149.4 (C-3), 150.1 (C-4), 133.5 (C-1), 122.0 (C-6),
116.3 (C-5), 111.2 (C-2), 56.8 (3-OCH3), 34.7 (C-8),
31.8 (C-7)。以上数据与文献报道一致[9]，故鉴定化
合物 7 为二氢异阿魏酸。
化合物8：白色粉末，ESI-MS m/z: 163 [M－H]−，
相对分子质量为 164。结合 1H-NMR 和 13C-NMR 数
据确定分子式为 C9H8O3，不饱和度为 6。1H-NMR
(400 MHz, CD3OD) δ: 7.59 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-7),
7.42 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-2, 6), 6.79 (2H, d, J = 8.6
Hz, H-3, 5), 6.27 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-8)；13C-NMR
(100 MHz, CD3OD) δ: 171.1 (9-COOH), 146.6 (C-7),
161.1 (C-4), 116.8. (C-3, 5), 127.2 (C-1), 115.6 (C-8),
131.1 (C-2, 6)。以上数据与文献报道一致[10]，故鉴
定化合物 8 为反式对羟基桂皮酸。
化合物9：白色粉末，ESI-MS m/z: 163 [M－H]−，
相对分子质量为 164。结合 1H-NMR 和 13C-NMR 数
据确定分子式为 C9H8O3，不饱和度为 6。1H-NMR
(400 MHz, CD3OD) δ: 7.95 (1H, d, J = 16.1 Hz, H-7),
7.48 (1H, dd, J = 1.4, 8.0 Hz, H-6), 7.20 (1H, td, J =
1.7, 8.5 Hz, H-4), 6.84 (2H, m, H-3, 5), 6.55 (1H, d,
J = 16.1 Hz, H-8)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ:
171.1 (9-COOH), 142.2 (C-7), 132.5 (C-4), 120.8
(C-5), 122.8 (C-1), 130.0. (C-6), 119.3 (C-8), 158.2
(C-2), 117.0 (C-3)。以上数据与文献报道一致[11]，故
鉴定化合物 9 为反式邻羟基桂皮酸。
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化合物 10：无色针状结晶（甲醇），ESI-MS m/z:
147 [M－H]−，相对分子质量为 148。结合 1H-NMR
和 13C-NMR 数据确定分子式为 C9H8O2，不饱和度
为 6。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.67 (1H, d, J =
16.0 Hz, H-7), 7.59 (2H, m, H-3, 5), 7.40 (3H, m, H-2,
4, 6), 6.49 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8)。其 TLC 行为与反
式桂皮酸对照品一致，以上数据与文献报道一致[12]，
故鉴定化合物 10 为反式桂皮酸。
化合物 11：黄绿色固体，ESI-MS m/z: 193 [M＋
H]+, 191 [M－H]−，相对分子质量为 192。结合
1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为 C10H8O4，
不饱和度为 7。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.86
(1H, d, J = 9.4 Hz, H-4), 6.21 (1H, d, J = 9.4 Hz, H-3),
7.11 (1H, s, H-8), 6.78 (1H, s, H-5), 3.92 (3H, s,
-OCH3)； 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 164.1
(C-2), 153.0 (C-7), 151.4 (C-6), 147.1 (C-10), 146.1
(C-4), 112.6 (C-3), 112.5 (C-9), 109.9 (C-5), 103.9
(C-8), 56.8 (6-OCH3)。以上数据与文献报道一致[13]，
故鉴定化合物 11 为 7-羟基-6-甲氧基-香豆素。
化合物 12：黄绿色固体，ESI-MS m/z: 223 [M＋
H]+, 221 [M－H]−，相对分子质量为 222。结合
1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定化合物分子式为
C11H10O5，不饱和度为 7。 1H-NMR (400 MHz,
CD3OD) δ: 7.82 (1H, d, J = 9.4 Hz, H-4), 6.21 (1H, d,
J = 9.4 Hz, H-3), 6.88 (1H, s, H-5), 3.94 (3H, s,
-OCH3), 3.89 (3H, s, -OCH3)。通过与化合物 11 进行
比对，发现化合物 12 仅多了 1 个甲氧基信号，少
了 1 个芳香质子信号，并与文献报道一致[14]，故鉴
定化合物 12 为 7-羟基-6, 8-二甲氧基-香豆素。
化合物 13：白色针晶，ESI-MS m/z: 147 [M＋
H]+, 145 [M－H]−，相对分子质量为 146。结合
1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为 C9H6O2，
不饱和度为 7。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.96
(1H, d, J = 9.6 Hz, H-4), 7.62 (2H, m, H-6, 7), 7.35
(2H, m, H-5, 8), 6.44 (1H, d, J = 9.6 Hz, H-3)。以上数
据与文献报道一致[15]，故鉴定化合物 13 为香豆素。
化合物 14：黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 319
[M＋H]+, 317 [M－H]−，相对分子质量为 318，
HR-ESI-Q-TOF-MS m/z: 341.100 4 [M＋Na]+（计算
值为 341.100 1），确定分子式为 C17H18O6，不饱和
度为 9。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.60 (1H, dd,
J = 1.9, 8.5 Hz, H-6′), 7.55 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-2′),
6.79 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5′), 6.75 (1H, dd, J = 2.0,
8.2 Hz, H-6), 6.88 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 6.71 (1H,
d, J = 8.2 Hz, H-5), 3.85 (3H, s, -OCH3), 3.81 (3H, s,
-OCH3)； 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 199.7
(-CO), 149.3 (C-3), 149.0 (C-3′), 155.4 (C-4′), 147.0
(C-4), 130.4 (C-1′), 116.4 (C-1), 65.5 (C-α), 56.4
(C-3′-OCH3), 56.3 (C-3-OCH3)。以上数据与文献报
道一致[16]，故鉴定化合物 14 为 3-羟基-1, 2-双 (4-
羟基-3-甲氧基苯基)-1-丙酮。
化合物 15：黄色无定形粉末。ESI-MS m/z: 317
[M＋H]−, 315 [M－H]−，相对分子质量为 316，结合
1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为 C16H12O7，
不饱和度为 11。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ:
7.76 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2′), 7.69 (1H, dd, J = 8.5,
2.1 Hz, H-6′), 6.94 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5′) 6.48 (1H,
d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.20 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6)；
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 183.4 (C-4), 164.8
(C-7), 163.4 (C-2), 161.5 (C-5), 157.3 (C-9), 149.4
(C-4′), 146.9 (C-3′), 121.9 (C-1′), 121.6 (C-6′), 115.2
(C-5′), 113.2 (C-2′), 104.2 (C-3), 103.6 (C-10), 99.0
(C-6), 93.8 (C-8), 59.8 (4′-OCH3)。以上数据与文献报
道一致[17]，故鉴定化合物 15 为异鼠李素。
化合物 16：黄色粉末，ESI-MS m/z: 325 [M＋
Na]+, 301 [M－H]−，相对分子质量为 302。结合
1H-NMR 和 13C-NMR 数据推测分子式为 C15H10O7，
不饱和度为 11。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ:
7.66 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-2′), 7.53 (1H, dd, J = 8.5,
2.2 Hz, H-6′), 6.88 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5′), 6.42 (1H,
d, J = 1.9 Hz, H-8), 6.20 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-6)；
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 176.5 (C-4), 164.8
(C-7), 161.3 (C-9), 156.7 (C-5), 148.2 (C-2), 147.3
(C-4′), 145.7 (C-3′), 122.4 (C-1′), 120.5 (C-6′), 115.8
(C-5′), 116.1 (C-2′), 136.3 (C-3), 103.4 (C-10), 98.7
(C-6), 93.9 (C-8)。以上数据与文献报道一致[18]，故
鉴定化合物 16 为槲皮素。
化合物 17：黄色无定形粉末。ESI-MS m/z: 287
[M＋H]+, 285 [M－H]−，相对分子质量为 286，结合
1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为 C15H10O6，
不饱和度为 11。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.38
(1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 7.37 (1H, dd, J = 8.5, 2.0
Hz, H-6′), 6.90 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5′), 6.43 (1H, d,
J = 2.1 Hz, H-8), 6.20 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6), 6.53
(1H, s, H-3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 183.9
(C-4), 166.4 (C-7), 166.0 (C-2), 163.2 (C-5), 159.4
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 12 期 2014 年 6 月

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(C-9), 150.9 (C-4′), 147.1 (C-3′), 123.7 (C-1′), 120.3
(C-6′), 116.8 (C-2′), 114.2 (C-5′), 105.3 (C-3), 100.1
(C-6), 95.0 (C-8)。以上数据与文献报道一致[19]，故
鉴定化合物 17 为木犀草素。
化合物 18：黄色粉末，EI-MS m/z: 633 [M＋
Na]+, 1 243 [2M＋Na]+, 609 [M－H]−, 1 219 [2M－
H]−，相对分子质量为 610。1H-NMR (400 MHz,
DMSO-d6) δ: 7.56 (1H, dd, J = 8.5, 2.2 Hz, H-6′), 7.53
(1H, brd, J = 2.2 Hz, H-2′), 6.83 (1H, d, J = 8.5 Hz,
H-5′), 6.38 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.19 (1H, d, J =
2.0 Hz, H-6), 5.34 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-1″), 5.07 (1H,
d, J = 5.8 Hz, H-1′′′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)
结合 DEPT-135 图谱共显示 27 根谱线，除去 2 个糖
基的信号剩余 15 个碳信号 δ: 179.4 (C-4), 166.0
(C-7), 163.0 (C-5), 159.4 (C-2), 158.5 (C-9), 149.8
(C-4′), 145.8 (C-3′), 135.7 (C-3), 123.2 (C-1′), 105.7
(C-10), 123.6 (C-6′), 117.7 (C-5′), 116.1 (C-2′), 100.0
(C-6), 94.7 (C-8)。以上数据与文献报道一致[20]，故
鉴定化合物 18 为芦丁。
化合物 19：黄色粉末，ESI-MS m/z: 487 [M＋
Na]+, 951 [2M＋Na]+, 463 [M－H]−，相对分子质量
为 464。结合 1H-NMR 和 13C-NMR 数据推测分子式
为 C21H20O12，不饱和度为 12。1H-NMR (400 MHz,
DMSO-d6) δ: 7.67 (1H, dd, J = 8.5, 2.3 Hz, H-6′), 7.53
(1H, d, J = 2.3 Hz, H-2′), 6.82 (1H, d, J = 8.5 Hz,
H-5′), 6.40 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.20 (1H, d, J =
2.0 Hz, H-6), 5.38 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1″)；
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 60.7 (C-6″), 67.8
(C-4″), 71.1 (C-2″), 73.1 (C-3″), 75.8 (C-5″), 93.4
(C-8), 98.6 (C-6), 101.7 (C-1″), 103.8 (C-10), 115.1
(C-5′), 115.9 (C-2′), 121.9 (C-6′), 121.0 (C-1′), 133.4
(C-3), 144.7 (C-4′), 148.4 (C-3′), 156.1 (C-2), 156.2
(C-9), 161.1 (C-5), 164.0 (C-7), 177.4 (C-4)。以上数
据与文献报道一致[21]，故鉴定化合物 19 为金丝桃苷。
化合物 20：黄色无定形粉末。ESI-MS m/z: 951
[2M＋Na]+, 463 [M－H]−，相对分子质量为 464，结
合 1H-NMR 和 13C-NMR 数据推测分子式为
C21H20O12，不饱和度为 12。1H-NMR (400 MHz,
DMSO-d6) δ: 7.45 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-2′), 7.42 (1H,
dd, J = 8.5, 2.2 Hz, H-6′), 6.90 (1H, d, J = 8.5 Hz,
H-5′), 6.78 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8), 6.44 (1H, d, J =
2.1 Hz, H-6), 6.74 (1H, s, H-3)；13C-NMR (100 MHz,
DMSO-d6) δ: 181.9 (C-4), 164.4 (C-7), 162.9 (C-2),
161.1 (C-5), 156.9 (C-9), 149.9 (C-4′), 145.7 (C-3′),
121.3 (C-1′), 105.3 (C-10), 119.1 (C-6′), 115.9 (C-5′),
113.5 (C-2′), 103.1 (C-3), 99.5 (C-6), 94.7 (C-8)。由分
子式推知，剩余的信号应归属为 1 个六碳糖基。以
上数据与文献报道一致[22]，故鉴定化合物 20 为木
犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
4 黄酮类化合物体外抗甲型流感病毒的活性评价
4.1 黄酮类化合物的细胞毒性检测
实验采用 AlamarBlue®（Invitrogen）试剂盒检
测化合物对细胞的毒性作用。单体化合物的最高毒
性测试浓度均为 500 μmol/mL。
AlamarBlue®是一种氧化还原指示剂，能根据代
谢活性产生吸光度变化和荧光信号。AlamarBlue®
易溶于水，其氧化形式进入细胞后经线粒体酶还原
产生可测量的荧光及颜色变化，用于细胞活性和细
胞增殖的定量分析以及体外细胞毒性研究。这种测
定是基于具有代谢活性的细胞将试剂转换成荧光和
比色指示剂的能力，受损和无活性细胞具有较低的
天然代谢活性，对应的信号较低。因此荧光信号强
弱可以反映细胞活性的高低。
细胞活性＝(样品孔荧光值－空白对照孔荧光值) / (细
胞对照孔荧光值－空白对照孔荧光值)
将 MDCK 细胞接种于 96 孔细胞培养板中，细
胞贴壁后备用。用细胞维持液将单体化合物从 2 倍
起始浓度连续 5 倍梯度稀释 6 个梯度，每浓度梯度
单孔检测。加化合物培养 72 h 后，光镜下观察化合物
引起的细胞病变效应，加入 AlamarBlue®，37 ℃孵育
2 h，荧光检测 AlamarBlue®的还原情况，激发光波长
570 nm，发射光波长 595 nm。实验结果见表 1。
4.2 黄酮类化合物对甲型流感病毒的抑制试验
采用检测流感病毒神经氨酸酶活性来代表病毒
的复制水平，将 MDCK 细胞接种于 96 孔细胞培养
板中备用。化合物从 2 倍最高测试浓度（100
μmol/mL）起连续 5 倍梯度稀释 6 个梯度；将孔板
中培养基弃去，同时加入化合物和病毒液于细胞孔
中，37 ℃细胞培养箱中孵育 1 h 后，弃上清培养基，
PBS 洗涤后，再次加入梯度稀释药物。置于 37 ℃
细胞培养箱培养 48 h，辅以观察细胞病变（CPE）。
取培养液上清进行神经氨酸酶活力检测。实验设空
白对照孔（正常细胞）、酶活对照孔（病毒感染后未
加药物孔）、阳性药物对照孔（感染后加利巴韦林）。
神经氨酸酶活性检测实验操作步骤如下：在 96 孔黑
色微量板中加入 40 μL 底物（MUNANA），吸取病
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表 1 黄酮类化合物体外抗流感病毒活性
Table 1 In vitro antiviral experiment results of flavonoids
化合物
CC50 /
(μmol·mL−1)
EC50 /
(μmol·mL−1)
SI
异鼠李素（15） — ND ND
槲皮素（16） — 91.284 ＞5.48
木犀草素（17） — 28.440 24.66
芦丁（18） — ND ND
金丝桃苷（19） — ND ND
木犀草素-7-O-β-D-吡喃
葡萄糖苷（20）
— ND ND
CC50：使 50%细胞发生病变时的药物浓度；EC50：指能够有效抑
制 50%细胞感染病毒的药物浓度；SI = CC50 / EC50；“－”：未检
测到明显细胞毒性，其 CC50 值大于最大测试浓度；“ND”：未检
测到病毒抑制活性，无 SI
CC50: the median lethal dose of a substance, or the amount required to
kill 50% of a given test population; EC50: the molar concentration of
an agonist, which produces 50% of the maximum possible response for
that agonist; SI (selected index) = CC50 / EC50; “—”: No cytotoxicity and
CC50 > the maximum test concentration; “ND”: No inhibitory activity
and no selected index
毒培养液 20 μL 上清加入孔板中，避光置于 37 ℃
孵育 60 min，加入 100 μL/孔终止液终止反应，多
功能检测仪上测定荧光值。激发光波长 355 nm，发
射光波长 485 nm。计算各检测孔中神经氨酸酶抑制
率，结果见表 1。
抑制率＝100－(样品孔荧光值－空白对照孔荧光值) /
(酶活对照孔荧光值－空白对照孔荧光值)
实验结果表明这些黄酮类化合物的细胞毒性较
低，所测 CC50 值大于被测试的最高浓度，同时在光
学显微镜下看不到明显的细胞病变，其中木犀草素
对流感病毒表现出较强抑制作用，EC50 值小于 50
μmol/L，SI 值大于 10，且细胞毒性较低（CC50 值
较高），值得进一步深入研究其抗病毒作用机制。
5 讨论
本研究采用现代化学-药理学相结合的方法对
临床疗效确切，应用广泛的热毒宁注射液进行抗病
毒活性成分的研究。综合应用各种色谱分离手段从
热毒宁注射液抗病毒活性部位（热毒宁注射液经
HP-20 大孔吸附树脂 95%乙醇洗脱部位）中分离并
鉴定了 20 个化合物，所有化合物均为首次从热毒宁
注射液中分离得到，并采用检测流感病毒神经氨酸
酶活性的方法，对分离得到的黄酮类化合物进行了
体外抗甲型流感病毒（A/PR/8/34 H1N1）作用研究，
结果显示木犀草素体外抑制流感病毒的活性较强，
可能是热毒宁注射液的抗病毒活性成分之一。这在
一定程度上揭示了该产品发挥抗病毒作用的物质基
础；为探讨黄酮类成分对复方药效的贡献提供了依
据。在后续研究中本课题组将继续追踪分离活性成
分，选择能反映复方整体药效活性的药理评价模型
对热毒宁注射液中的多种成分进行多方面、多层次
的研究，以期能为全面揭示热毒宁注射液的科学内
涵提供依据，并最终建立与活性相关联的质量控制
方法。同时本研究的思路与方法也为阐明中药复方
药效物质基础提供了一种可能的研究思路与方法。
志谢：暨南大学药学院中药及天然药物研究所
栗原博教授课题组帮助完成热毒宁注射液抗病毒活
性部位的筛选；中国科学院武汉病毒所陈绪林教授
课题组帮助完成单体化合物的体外活性评价工作；
暨南大学药学院中药及天然药物研究所帮助完成核
磁和质谱的测试工作。
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