全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 10 期 2016 年 5 月

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高良姜素抑制乳腺癌转移作用机制研究
许奕夫，姚 鑫*
苏州大学附属第一医院 药学部，江苏 苏州 215006
摘 要：目的 探究高良姜素对 MDA-MB-231 乳腺癌细胞迁移及侵袭的影响及其作用机制。方法 采用 MTT 法观察不同
浓度高良姜素对乳腺癌细胞 MDA-MB-231 增殖的影响；划痕愈合实验和 Transwell 小室迁移实验考察高良姜素对
MDA-MB-231 水平迁移能力和垂直迁移能力的影响；Transwell 小室侵袭实验分析高良姜素对 MDA-MB-231 细胞侵袭能力
的影响；采用蛋白免疫印迹（Western blotting）法考察高良姜素对 MDA-MB-231 细胞 PI3K、Akt、MMP-2、MMP-9 蛋白表
达的影响，免疫荧光染色实验验证高良姜素对 MDA-MB-231 细胞 PI3K、Akt、MMP-2、MMP-9 蛋白表达的影响；Western
blotting 法和免疫荧光染色实验考察高良姜素对核转录因子（NF-κB）p65 磷酸化表达和入核的影响；制备乳腺癌 MDA-MB-231
细胞株裸鼠移植瘤模型，高良姜素 200 μg/kg ig 给药 15 d，检测肿瘤体积和质量，计算抑瘤率，Western blotting 分析肿瘤组
织 PI3K、AKT、MMP-2、MMP-9 表达及 NF-κB p65 磷酸化表达情况。结果 高良姜素体外浓度为 50、100、200 μmol/L 时
可显著抑制 MDA-MB-231 细胞的增殖；高良姜素能剂量依赖性抑制 PI3K、Akt、MMP-2、MMP-9 蛋白表达，降低 NF-κB p65
磷酸化表达和入核； 200 μg/kg 高良姜素能抑制裸鼠乳腺癌的生长，抑瘤率为 43.66%；高良姜素能抑制瘤组织中 PI3K、Akt、
MMP-2、MMP-9 表达以及 NF-κB p65 磷酸化表达。结论 高良姜素在体内对 MDA-MB-231 生长有明显的抑制作用，在体
外能抑制 MDA-MB-231 细胞增殖、迁移、侵袭，抑制相关蛋白 PI3K、Akt 和 MMP-2、MMP-9 蛋白表达，抑制转录因子 NF-κB
磷酸化表达及入核，阻断其激活。
关键词：高良姜素；乳腺癌；MDA-MB-231；迁移；侵袭；基质金属蛋白酶
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)10 - 1731 - 09
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.10.017
Inhibitory effect and mechanism of galangin on breast cancer metastasis
XU Yi-fu, YAO Xin
Department of Pharmacy, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, China
Abstract: Objective To explore the effect of galangin on the migration and invasion of breast cancer and its action mechanism.
Methods MTT assay was adopted to observe the effect of galangin at different concentration on the growth capacity of breast cancer
cells MDA-MB-231. Wound healing and Transwell assay were conducted to detect the effect of galangin on the migration and invasion
of MDA-MB-231 cells. Western blotting and immunofluorescence assay were adopted to investigate the migration and invasion related
proteins including PI3K, AKT, MMP-2, and MMP-9. The effect of galangin on NF-κb p65 phosphorylation and NF-κb p65 nuclear
transition in vitro was assayed by Western blotting and immunofluorescence assay. Furthermore, the antitumor effect of galangin in
MDA-MB-231 tumor bearing BALB/c mice model was assayed in vivo. Results Galangin inhibited the migration of MDAMB-231
cells in a dose-dependent manner. In wound healing and transwell experiments, with the increase in the concentration of galangin, the
number of migrant MDA-MB-231 cells and the invasion capacity of breast cancer cells decreased. Galangin could decrease the protein
expression of PI3K, Akt, MMP-2, and MMP-9. Besides, galangin significantly inhibit the phosphorylation of transcription factor
NF-κB p65 and NF-κB p65 nuclear transition. Galangin also inhibited the growth of MDA-MB-231 cancer cells in vivo and
down-regulated PI3K, Akt, MMP-2, and MMP-9. Conclusion Galangin could inhibit the growth capacity of breast cancer cells
MDA-MB-231 and block the migration and invasion of MDA-MB-231 cells. The mechanism for antitumor effect of galangin is
through inhibiting NF-κb p65 activity and MMP-2/9 expression, and blocking PI3K-AKT signaling pathway.
Key words: galangin; breast cancer; MDA-MB-231; migration; invasion; MMPs

收稿日期：2015-08-07
基金项目：江苏省卫生厅医学科研项目（Z201304）
作者简介：许奕夫，男，学士，主要从事医院药学研究。E-mail: xyfsuzhou@163.com
*通信作者 姚 鑫，男，硕士，主要从事医院药学研究。E-mail: yaobest@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 10 期 2016 年 5 月

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乳腺癌细胞的恶性生物学行为主要表现在其增
殖、侵袭和迁移的能力上，癌细胞从原发灶脱离进
入体循环，必须要有迁移以及穿过细胞外基质
（extracellular matrix，ECM）的过程（侵袭），ECM
的降解在很大程度上受到 IV 型胶原酶的调节[1]。基
质金属蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9 都属于 IV 型胶
原酶，它们参与了 ECM 的主要成分的降解，所以在
肿瘤细胞的浸润和转移灶的形成等过程中扮演着重
要的角色[2]。近年来发现，磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）
和其下游分子蛋白 Akt（RAC-alpha serine/threonine-
protein kinase）所组成的信号通路与乳腺癌的发生发
展密切相关[3]。该通路调节乳腺癌细胞的增殖和存
活，其活性异常不仅能导致细胞恶性转化，而且与
乳腺癌的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及 ECM 的降
解等相关，目前以 PI3K-Akt 信号通路关键分子为靶
点的肿瘤治疗策略正在发展中[4]。
高良姜 Alpinia officinarum Hance，别名小良姜，
为姜科植物，是一种热带多年生长的山姜，属药食
兼用植物。高良姜素是从高良姜中提取的有效成
分，是一种天然的黄酮醇类化合物，不仅具有抗氧
化、抗溃疡、镇痛抗炎、抗菌作用，还有抗肿瘤作
用[5-8]，但其抗乳腺癌转移的功效及分子机制未被证
实，因此本研究采用体外人乳腺癌 MDA-MB-231
细胞模型来考察高良姜素对迁移及侵袭关键环节
的影响，采用 Western blotting、免疫荧光等方法探
究高良姜素对 PI3K、Akt、MMP-2 和 MMP-9 蛋白
表达影响，探究高良姜素抑制迁移及侵袭相关蛋白
表达的分子机制。本研究还观察高良姜素对小鼠体
内肿瘤生长的影响，进一步验证其抗肿瘤作用，为
其抗肿瘤作用研究与开发提供依据。
1 材料
1.1 细胞株与动物
MDA-MB-231 乳腺癌细胞从 ATCC 细胞库（美
国）获得。BALB/c 雌性裸鼠，SPF 级，体质量 18～
22 g，许可证号 SCXK（沪）2008-0016，购自上海
西普尔必凯实验动物有限公司。
1.2 试剂与药品
高良姜素购自南京青泽医药科技开发有限公
司（批号 485-49-4，质量分数 98%）。DMEM 培养
基、胎牛血清购自美国 Gibco 公司；MTT 购自
Promega 公司；Transwell 迁移小室和侵袭小室购自
美国 Corning 公司；PI3K、AKT、MMP-2、MMP-9、
磷酸化-NF-κB p65（p-NF-κB p65Ser 276）、总 NF-κB
p65（t-NF-κB p65）和 GAPDH 一抗抗体、荧光二
抗（辣根过氧化物标记的羊抗兔 IgG）、FITC 荧光
二抗购自 Santa Cruz 公司；Hoechest 购自上海碧云
天生物技术有限公司；青霉素-链霉素溶液购自上海
碧云天生物技术有限公司。
1.3 仪器
DM1L 莱卡倒置荧光显微镜（德国莱卡公司）；
3111 型 CO2 培养箱（Forma）；BT323S 电子天平（德
国赛多利斯有限公司）；KA-1000 离心机（上海安
亭科学仪器厂）；TECAN 3360063 酶标仪（Sunrise
公司）。
2 方法
2.1 高良姜素体外对 MDA-MB-231 细胞增殖、迁
移及侵袭的影响
2.1.1 细胞培养 MDA-MB-231 乳腺癌细胞于含
10%胎牛血清以及 1×105 U/L 青霉素、100 mg/L 链
霉素的 DMEM 培养基中，于 37 ℃、5% CO2培养
箱中进行常规培养。
2.1.2 对 MDA-MB-231 细 胞 增 殖 的 影 响
MDA-MB-231 细胞生长至 80%融合，0.25%胰蛋白
酶消化，DMEM 完全培养基重悬，每孔 5×103 个
细胞接种于 96 孔板。待细胞贴壁后，加入高良姜
素，使其终浓度分别为 10、25、50、100、200 μmol/L，
对照组加入 20 μL PBS，每个药物浓度设 5 个复孔。
培养 24 h 后加入 20 μL MTT 溶液（5 mg/mL)，在
培养箱中孵育 4 h，96 孔板震摇 15 min，吸弃上清，
加入二甲基亚砜（DMSO）震荡，用全自动酶标仪
在 490 nm 测定吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制
率。实验重复 3 次[9]。
细胞增殖抑制率＝1－给药组 A 值/对照组 A 值
2.1.3 对 MDA-MB-231 细胞水平运动能力的影响
取对数生长期 MDA-MB-231 细胞，消化细胞，调
整细胞密度至 2×105 个/mL，备用。将上述细胞悬
液加入 6 孔板中，每孔体积 2 mL，放入 37 ℃、5%
CO2培养箱继续培养，待细胞呈融合状态，用 100 μL
无菌枪头进行划痕。划痕完毕后，用移液枪吸出培
养液，加入适量的 PBS 将细胞清洗 3 遍，除去细胞
碎片，弃去 PBS，每孔加入用无血清 DMEM 培养
基配制的不同浓度高良姜素（0、25、50、100 μmol/L）
溶液，每个浓度 3 个复孔，在划痕的不同时间点（0、
24 h）将 6 孔板置于倒置显微镜下拍照，测量每组
MDA-MB-231 细胞显微镜图像中空白间距（单位为
cm），并计算 24 h 与 0 h 空白距离的比值，观察划
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痕愈合的程度[10]。
2.1.4 对 MDA-MB-231 细胞迁移能力的影响 常
规培养 MDA-MB-231 细胞，实验前 24 h 撤血清饥
饿。消化细胞，用无血清的 DMEM 培养基重悬浮，
调整细胞密度为 2×106 个/mL，在 24 孔板中加入
DMEM培养基，每孔 600 μL。取上述细胞悬液 90 μL
加入 Transwell 迁移小室上室中，同时各孔加入浓
度分别为 250、500、1 000 μmol/L 的高良姜素药液，
体积 10 μL，终浓度为 25、50、100 μmol/L，对照
组加入等体积 PBS，每个浓度 3 个复孔。将小室浸
于 24 孔板的培养液中，37 ℃、5% CO2 孵箱内孵
育 6 h，取出小室，用镊子轻轻取下滤膜，5%戊二
醛 4 ℃固定 10 min，取出用 0.1%结晶紫染液于水
平摇床上染色 30 min，PBS 漂洗 3 次，用棉签擦掉
膜上层未穿过的细胞，置于载玻片上，观察细胞迁
移情况并拍照，200 倍镜下，随机选取 5 个视野，
计数穿膜细胞数目[11]，根据公式计算迁移抑制率。
迁移抑制率＝(对照组穿膜细胞数－给药组穿膜细胞
数)/对照组穿膜细胞数
2.1.5 对 MDA-MB-231 细胞侵袭能力的影响 取
对数生长期 MDA-MB-231，调整细胞浓度至 1×105
个/mL，取 90 μL 细胞悬液加入 Transwell 侵袭小室
上室中，同时各孔加入浓度分别为 250、500、1 000
μmol/L 的高良姜素药液，体积 10 μL，终浓度为 25、
50、100 μmol/L，对照组加入等体积 PBS，每个浓
度 3个复孔。下室 24孔板中每孔加入 900 μL含 10%
FBS 的 DMEM 培养基。将小室放入 24 孔板中，
37 ℃、5% CO2 培养箱常规培养 24 h，取出小室，
用镊子取下滤膜，5%戊二醛 4 ℃固定，用 0.1%结
晶紫染液染色 30 min，PBS 漂洗 3 次，用棉签擦掉
膜上层未穿过的细胞，置于载玻片上，观察细胞迁
移情况并拍照，200 倍镜下随机选取 5 个视野，观
察侵袭细胞数目[12]，根据公式计算侵袭抑制率。
侵袭抑制率＝(对照组侵袭细胞数－给药组侵袭细胞
数)/对照组侵袭细胞数
2.1.6 对MDA-MB-231细胞迁移及侵袭相关蛋白表
达的影响 Western blotting 检测：取 MDA-MB-231
细胞接种于培养皿中，每个培养皿各加入 1 mL 细
胞悬液（密度为 1×105 个/mL），其余为含 10%胎
牛血清的 DMEM 培养液，共 10 mL 体系。细胞分
组及给药方式同“2.1.5”项，37 ℃、5% CO2培养
箱培养 24 h 后提取蛋白，并采用 BCA 法测定蛋白
浓度。变性后取 50 μg 上样，用 10%分离胶、5%浓
缩胶电泳：每块胶 0.02 A，至溴酚蓝消失，之后转
到 PVDF 膜上。一抗（PI3K、AKT、MMP-2、MMP-9
和 GAPDH）以 1∶1 000，4 ℃孵育过夜后加辣根过
氧化物标记的羊抗兔 IgG（1∶10 000）。加入化学发
光试剂，用 Kodak 胶卷曝光，以 GAPDH 作为内参，
采用 Adobe Photoshop CS6 软件进行灰度分析[13]，实
验重复 3 次。
免疫荧光检测：MDA-MB-231 单层生长细胞在
传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻
片的培养皿中，待细胞接近长成单层后，细胞分组及
给药方式同“2.1.5”项。取出盖玻片，PBS 洗 2 次；
用多聚甲醛固定细胞。固定完毕后的细胞使用 Triton
对细胞进行通透处理 5～15 min，通透后用 PBS 洗涤
3×5 min，加入一抗抗体（PI3K、Akt、MMP-2、
MMP-9）孵育 4 ℃过夜。PBST 漂洗 3 次，每次冲洗
5 min。结合 FITC 荧光二抗，室温避光孵育 2 h。PBST
漂洗 3 次，每次冲洗 5 min，滴加封片剂 1 滴，封片，
荧光显微镜观察细胞 FITC 荧光染色强度。
2.1.7 对 NF-κB p65 表达及入核的影响 Western
blotting 法考察高良姜素对 NF-κB p65 表达的影响，
具体操作同“2.1.6”项。免疫荧光实验中将玻片放
入 6 孔板，MDA-MB-231 细胞悬液滴至玻片，且不
能溢出，待细胞贴壁后，加足含高良姜素培养液（浓
度为 0、100 μmol/L）培养 24 h。取出细胞玻片后用
甲醇固定 15 min，现用现配。PBS 冲洗，0.1% Triton
作用 20 min，PBS 洗 3 次，10%正常羊血清封闭 10
min。加入 NF-κB p65 一抗（1：500），4 ℃孵育过
夜。加入 FITC 荧光二抗，室温 30 min，90%甘油封
片，用 Hochest 染核，直接于显微镜下观察[14]。
2.2 高良姜素体内对荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响
2.2.1 动物模型制备、分组及给药 将单层培养的
MDA-MB-231细胞消化脱壁后稀释为5×105的细胞
悬液，将 MDA-MB-231 细胞悬液接种于 BALB/c 雌
性裸鼠背部一侧皮下，接种 48 h 后，观察肿瘤生长
状况，将裸鼠随机分为 2 组：模型组（0.9%生理盐
水）、高良姜素组（200 μg/kg，预试验结果提示 200
μg/kg 给药，对裸鼠体质量无影响，对裸鼠主要脏器
没有毒性作用），每组 3 只裸鼠。高良姜素组 ig 给予
质量浓度为 20 μg/mL 的高良姜素溶液，模型组 ig 给
予含 1% DMSO 的生理盐水，体积均为 10 mL/kg，
每天 1 次，连续 25 d。实验期间自由饮食饮水，每 3
天用游标卡尺测量瘤体长径（a，mm）和短径（b，
mm），并称裸鼠体质量。给药结束后的第 2 天处死
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裸鼠拍照，计算瘤体积（V，V＝ab2/2），绘制肿瘤生
长曲线。剥取瘤组织，称质量，计算抑瘤率。
抑瘤率＝1－药物组平均瘤质量/模型组平均瘤质量
2.2.2 对荷瘤裸鼠肿瘤组织相关蛋白表达及 NF-κB
p65 表达及入核的影响 称取肿瘤组织 200 mg，在
研钵中用液氮研磨，加入 1 000 μL 的细胞裂解液，
吸入 1.5 mL 的灭菌离心管中，将含有蛋白裂解液的
离心管在冰上冰浴 20 min，15 000 r/min 离心 20
min，吸取上清。按照“2.1.6”和“2.1.7”项方法
检测肿瘤组织中 PI3K、Akt、MMP-2、MMP-9 蛋
白表达水平及 NF-κB p65 表达及入核水平。
2.3 统计学分析
采用 SPSS 17.0 软件包进行统计学处理，结果
以 ±x s 表示，各组间的比较采用单因素方差分析，
样本均数间的比较采用 LSD-t 检验。
3 结果
3.1 体外对 MDA-MB-231 细胞增殖、迁移及侵袭
的影响
3.1.1 抑制 MDA-MB-231 细胞增殖 MTT 结果显
示，10、25 μmol/L 高良姜素对 MDA-MB-231 细胞
增殖无影响，在 50 μmol/L 时对 MDA-MB-231 细胞
增殖有显著抑制作用（P＜0.01），抑制率达 30.5%，
在 100、200 μmol/L 时对 MDA-MB-231 细胞增殖有
极显著抑制作用，抑制率分别为 48.65%和 70.58%
（P＜0.001）。结果见图 1。
3.1.2 抑制 MDA-MB-231 细胞水平运动的能力
观察不同浓度高良姜素于不同时间点对乳腺癌细
胞划痕愈合能力的影响，随着高良姜素浓度的增
加，MDA-MB-231 细胞划痕的愈合程度呈递减趋
势，结果以 0 h 和 24 h 两个时间点为例，呈现对照
组和高良姜素组细胞的划痕愈合情况，见图 2。24 h
时，对照组划痕区域的乳腺癌 MD-MB-231 细胞发
生明显迁移，而随着高良姜素浓度的增加，划痕区
域细胞愈合程度呈降低趋势。


与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下同
*P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs control group, same as below
图1 高良姜素对MDA-MB-231细胞增殖的影响 ( x ±s, n = 3)
Fig. 1 Effect of galangin on proliferation of MDA-MB-231
cells ( x ±s, n = 3)



图 2 高良姜素对 MDA-MB-231 细胞划痕愈合能力的影响 ( x ±s, n = 3)
Fig. 2 Effect of galangin on wound-healing assay of MDA-MB-231 cells ( x ±s, n = 3)
3.1.3 抑制 MDA-MB-231 细胞迁移 Transwell 小
室迁移实验结果发现，随着高良姜素浓度的增加，
细胞迁移能力呈递减趋势，见图 3。对照组穿膜细
胞数目较多，高良姜素各浓度处理 6 h 后，穿膜细
胞数目与对照组比较呈减少趋势。与对照组比较，
25、50、100 μmol/L 高良姜素对 MDA-M-231 细胞
迁移均有显著抑制作用（P＜0.05、0.01、0.001），
迁移抑制率分别为 23.08%、35.29%和 51.63%。
3.1.4 抑制 MDA-MB-231 细胞侵袭 Transwell 小
室侵袭实验结果发现，随着高良姜素浓度的增加，
细胞侵袭能力呈递减趋势，见图 3。对照组侵袭细
胞数目较多，高良姜素各浓度处理 24 h 后，侵袭细
胞数目与对照组比较呈减少趋势。与对照组比较，
25、50、100 μmol/L 高良姜素对 MDA-M-231 细胞
侵袭均有显著抑制作用（P＜0.05、0.01、0.001），
侵袭抑制率分别为 22.55%、30.84%和 48.67%。
3.1.5 抑制迁移及侵袭相关蛋白表达 Western
blotting 结果（图 4）显示，实验各组 GAPDH 的条

对照 高良姜素 25 μmol·L−1 高良姜素 50 μmol·L−1 高良姜素 100 μmol·L−1
0 h





24 h
对照 25 50 100
高良姜素/(μmol·L−1)
24
h
与
0
h
空
白
距
离
的
比
值

100




50




0
* *
0 10 25 50 100 200
高良姜素/(μmol·L−1)
80

60

40

20

0

增
殖
抑
制
率
/%

***
***
**
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图 3 高良姜素对 MDA-MB-231 细胞迁移和侵袭能力的影响 ( x ±s, n = 3)
Fig. 3 Effects of galangin on migration and invasion of MDA-MB-231 cells ( x ±s, n = 3)


图 4 高良姜素对 MDA-MB-231 细胞 PI3K、Akt、MMP-2 和 MMP-9 蛋白表达的影响 (Western blotting, x ±s, n = 3)
Fig. 4 Effect of galangin on protein expression of PI3K, Akt, MMP-2, and MMP-9 in MDA-MB-231 cells (Western blotting,
x ±s, n = 3)
带灰度相近，高良姜素作用 24 h 后可以在一定程度
上剂量依赖性抑制 MDA-MB-231 细胞中 PI3K 和
Akt 的蛋白表达 ；高 良姜素可以 显著抑制
MDA-MB-231 细胞中 MMP-2 和 MMP-9 的蛋白表
达。细胞免疫荧光实验结果也证实高良姜素处理细
胞后，MDA-MB-231 细胞的 MMP-2 表达亮度有明
显的减弱，结果见图 5。实验结果证实高良姜素可以
下调MDA-MB-231细胞 PI3K-Akt-MMPs信号通路。
3.1.6 抑制 MDA-MB-231 细胞 NF-κB p65 磷酸化
表达及入核 Western blotting 结果（图 6）显示，
实验各组 GAPDH 的条带灰度相近，t-NF-κB p65
蛋白表达与对照组比较无显著变化，但 p-NF-κB
p65Ser276 表达水平在高良姜素处理后显著低于对照
组，50、100 μmol/L 高良姜素组条带灰度较对照组
明显减弱（P＜0.05、0.01）。免疫荧光染色检测
NF-κB的主要亚基p65是否被转移到MDA-MB-231
细胞核内，判断 NF-κB 是否被激活。高姜良素作用
24 h 后，高姜良素 100 μmol/L 组 MDA-MB-231 细
胞核内 NF-κB p65 蛋白的量显著低于对照组。结果
见图 7。
迁移



侵袭
60

40

20

0
迁
移
抑
制
率
/%

对照 高良姜素 25 μmol·L−1 高良姜素 50 μmol·L−1 高良姜素 100 μmol·L−1
***

**
*

25 50 100
高良姜素/(μmol·L−1)
*

60

40

20

0
**

***

侵
袭
抑
制
率
/%

25 50 100
高良姜素/(μmol·L−1)
PI3K

Akt

MMP-2

MMP-9

GAPDH
对照 25 50 100
高良姜素/(μmol·L−1)
蛋
白
相
对
表
达
量

1.5

1.0

0.5

0
对照
高良姜素 25 μmol·L−1
高良姜素 50 μmol·L−1
高良姜素 100 μmol·L−1
**
**

**

**

**
**

***
PI3K Akt MMP-2 MMP-9
*

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A-MMP-2 B-MMP-9 C-PI3K D-Akt
图 5 免疫荧光染色法检测 MDA-MB-231 细胞 PI3K、Akt、
MMP-2 和 MMP-9 蛋白表达
Fig. 5 Protein expression of PI3K, Akt, MMP-2, and MMP-9
in MDA-MB-231 cells by immunofluorescent staining




图 6 高良姜素对 MDA-MB-231 细胞 p-NF-κB p65 Ser 276 及
t-NF-κB p65 蛋白表达的影响 ( x ±s, n = 3)
Fig. 6 Effect of galangin on protein expression of p-NF-κB
p65Ser 276 and t-NF-κB p65 in MDA-MB-231 cells ( x ±s, n = 3)
3.2 体内对荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制作用
3.2.1 对荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制作用 与模型
组比较，高良姜素组对荷瘤裸鼠肿瘤生长具有明显
抑制作用。图 8 和 9 结果显示，高良姜素（200 μg/kg）
给药 25 d，具有较强的抑制乳腺癌 MDA-MB-231
荷瘤裸鼠肿瘤质量和体积增长的作用（P＜0.01）。



图 7 高良姜素对 MDA-MB-231 细胞 NF-κB p65 入核的
影响 (免疫荧光染色)
Fig. 7 Effect of galangin on NF-κB p65 nuclear translocation
in MDA-MB-231 cells (immunofluorescent staining)

与模型组比较：##P＜0.01，下同
##P < 0.01 vs model group, same as below
图8 高良姜素对乳腺癌荷瘤裸鼠肿瘤质量的影响 ( x ±s, n = 3)
Fig. 8 Effect of galangin on tumor weight of nude mouse
inoculated with MDA-MB-231 cells ( x ±s, n =3)
与模型组比较，高良姜素组瘤质量轻于模型组的瘤
质量（P＜0.01），高良姜素的抑瘤率为 43.66%。而
与模型组比较，高良姜素给药后对裸鼠的体质量
（图 9）并没有明显影响，提示高良姜素抑瘤效率并
不是由高良姜素药物毒性所导致的。
3.2.2 抑制瘤组织 PI3K、Akt、MMP-2、MMP-9、
p-NF-κB p65 的表达 如图 10 所示，与模型组比较，
高良姜素组裸鼠肿瘤组织中 PI3K、Akt、MMP-2、
MMP-9 蛋白表达明显减少，特别是 MMP-2 的表达。
A



B



C



D
对照 25 50 100
高良姜素/(μmol·L−1)
NF-κB p65 染核 合成
对照




高良姜素
100 μmol·L−1
对照 25 50 100
高良姜素/(μmol·L−1)
p-NF-κB p65 Ser 276

t-NF-κB p65

GAPDH
对照 25 50 100
高良姜素/(μmol·L−1)
1.5

1.0

0.5

0.0
蛋
白
相
对
表
达
量

**

*

1.5
1.0
0.5
0.0
肿
瘤
质
量
/g

1



2

1 模型


2 高良姜素
200 μg·kg−1
p-NF-κB p65 Ser 276
模型 高良姜素200 μg·kg−1
##

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 10 期 2016 年 5 月

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图 9 高良姜素对乳腺癌荷瘤裸鼠肿瘤体积和体质量的影响 ( x ±s, n = 3)
Fig. 9 Effect of galangin on tumor volume and body weight of nude mouse inoculated with MDA-MB-231 cells ( x ±s, n = 3)


















图 10 高良姜素对乳腺癌荷瘤裸鼠肿瘤组织内 PI3K、Akt、MMP-2、MMP-9 及 p-NF-κB p65 蛋白表达的影响 ( x ±s, n = 3)
Fig. 10 Effect of galangin on protein expression of PI3K, Akt, MMP-2, MMP-9, and p-NF-κB p65 in tumor tissue of nude
mouse inoculated with MDA-MB-231 cells ( x ±s, n = 3)
与模型组比较，高良姜素组 p-NF-κB p65 Ser 276 的表
达下调，对 t-NF-κB p65 蛋白表达水平无影响。
4 讨论
乳腺癌是严重威胁女性生命健康的重大疾病
之一，乳腺癌术后复发转移并不少见，其发生率一
般在 10%～30%。西医通过术后化疗、放疗、生物
治疗以及内分泌治疗等手段延缓其复发转移时间，
降低其发生率。但对患者创伤较大，并且有严重的
副作用，严重影响患者的生活质量，故研发毒副作
用较小，疗效好的新型抗乳腺癌药物尤为重要[15]。
乳腺癌细胞的迁移、侵袭在转移过程中发挥重
要作用。乳腺癌细胞在原发部位降解细胞外基质及
基底膜，迁移进入血管，随着血液流动到达远端器
官形成转移灶。由于 PI3K-Akt 与乳腺癌转移密切
相关，PI3K-Akt 过度活化后影响下游多种效应分
子 MMP-2 和 MMP-9 的表达，在乳腺癌细胞内发
挥促进增殖、迁移侵袭等关键作用。抑制 PI3K、
Akt 表达，则可以抑制乳腺癌细胞迁移侵袭，减缓
肿瘤进展[16]。
核转录因子NF-κB由 2类亚基形成同源或异源
二聚体。一类亚基包括 p65（也称 RelA）、RelB 和
C-Rel；另一类亚基包括 p50 和 p52。最常见的NF-κB
肿
瘤
体
积
/m
m
3
0 5 10 15 20 25
t/d
1 000
800
600
400
200
0
0 5 10 15 20 25
t/d
模型
高良姜素 200 μg·kg−1

30
25
20
15
10
5
0
体
质
量
/g

PI3K

Akt


MMP-2

MMP-9


GAPDH
对照 高良姜素 200 μg·kg−1
1.5


1.0


0.5


0.0
p-NF-κB p65 Ser 276

t-NF-κB p65

GAPDH
对照 高良姜素 200 μg·kg−1
蛋
白
相
对
表
达
量

1.5

1.0

0.5

0.0 蛋
白
相
对
表
达
量

p-NF-κB p65 Ser 276
对照 高良姜素 200 μg·kg−1
PI3K Akt MMP-2 MMP-9
模型
高良姜素 200 μg·kg−1
##
##

##

##

##

##
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亚基组成形式为 p65/p50 或 p65/p65。NF-κB 未被激
活时和 IκB-α 形成一个复合物，分布在细胞浆中。
NF-κB激活后，IκB-α会在 Ser32和 Ser36被磷酸化，
随后被泛素-蛋白酶体途径降解。NF-κB 和 IκB-α 解
聚后，其核定位序列被暴露，从而被转运到细胞核
内促进 NF-κB 依赖的基因转录。很早就有研究提出
NF-κB 在癌变的过程中起着重要作用，特别是 RelA
（p65）亚基可反式激活很多基因，调节细胞的生长、
凋亡、血管形成和侵袭转移。更重要的是在决定肿
瘤致命性的转移和侵袭方面，NF-κB 也具有重要作
用，它能调节与肿瘤转移有关的 PI3K-Akt、MMPs
（MMP-9）等基因的表达[17]。
本 研 究 表 明 高 良 姜 素 对 乳 腺 癌 细 胞
MDA-MB-231 的增殖抑制作用明显（P＜0.01），
在浓度为 50 μmol/L 时，抑制率可达 30.5%。通过
观察高良姜素对乳腺癌细胞水平运动能力的影
响，随着高良姜素给药浓度的增加，乳腺癌
MDA-MB-231 细胞的水平运动迁移能力逐渐减
弱。通过观察高良姜素对乳腺癌 MDA-MB-231
细胞 Transwell 小室侵袭能力的影响，发现随着高
良姜素给药浓度的增加，MDA-MB-231 侵袭基底
膜的能力逐渐减弱。
因为 PI3K-Akt 介导了 MDA-MB-231 细胞的迁
移 侵 袭 过 程 ， 因 此 推 测 高 良 姜 素 可 能 对
MDA-MB-231 细胞 PI3K-Akt 以及 MMPs 的表达有
调控作用。本研究采用 Western blotting 法检测了高
良姜素对 MDA-MB-231 细胞 PI3K-Akt 和 MMP-2/9
表达的影响，发现高良姜素可以下调 PI3K、Akt 的
蛋白表达；进一步用免疫荧光实验方法对
PI3K-AKT 调控的 MMP-2/9 的蛋白表达进行了测
定，发现高良姜素同时下调 MMP-2 的蛋白表达，
初步说明了高良姜素具有下调 PI3K-Akt 以及
MMPs 表达的功能。进一步分子机制研究发现高良
姜素对 MDA-MB-231 核转录因子 NF-κB p65 的磷
酸化，对 NF-κB p65 的入核同样具有抑制作用。在
人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞裸鼠移植瘤模型中，
实验结果表明，高良姜素也能抑制 MDA-MB-231
乳腺癌细胞在体的生长，同时高良姜素对瘤组织内
PI3K、Akt、MMP-2/9 蛋白表达和核转录因子 NF-κB
p65 的活化有明显抑制作用。
研究初步证实高良姜素能有效抑制乳腺癌
MDA-MB-231 在体内外的生长，能够抑制乳腺癌
MDA-MB-231 细胞核转录因子 NF-κB p65 入核，抑
制 NF-κB p65 的磷酸化表达，阻断 NF-κB p65 的激
活，抑制PI3K-Akt信号通路，下调MMP-2和MMP-9
的表达，发挥阻断乳腺癌 MDA-MB-231 细胞的迁
移侵袭作用。
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