全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 15期 2016年 8月

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蒙古黄芪中 2种具有免疫活性的可溶性粗蛋白提取工艺优选
陈秀红，魏砚明，任晋宏，薛慧清*，武福云，高 丽，岳晓华，李 敏，刘 瑞，白承之，梁 锐，刘必旺
山西中医学院 实验中心，山西 晋中 030619
摘 要：目的 优选蒙古黄芪 Astragalus membranaceus mongholicus中 2种免疫活性蛋白 AmPR10-16kDa和 HQGP-2的最佳
提取工艺。方法 以蒙古黄芪中所含可溶性蛋白 AmPR10-16kDa 和 HQGP-2 二级结构的圆二色性对提取温度和提取溶剂种
类进行考察；对该 2 种蛋白提取条件进行单因素考察，并采用 L9(34) 正交试验设计法，采用 Image 凝胶图形分析软件以
AmPR10-16kDa 和 HQGP-2 在 SDS-PAGE 凝胶图中的蛋白条带灰度值（峰面积）为指标，考察提取温度、料液比、提取时
间、提取溶剂（pH值）、药材粒度、提取次数对 AmPR10-16kDa和 HQGP-2蛋白条带灰度值的影响，从而确定 AmPR10-16kDa
和 HQGP-2的最佳提取工艺，辅以其免疫抑制率（CCK-8法）和可溶性蛋白定量测定（BCA法）作为佐证。结果 建立了
蒙古黄芪中 AmPR10-16kDa和 HQGP-2 的最佳提取工艺：向药材粉末（过 4号筛）5.0 g中加入 16倍量 Tris-HCl，在温度
40 ℃条件下恒温提取 60 min，以 100 r/min搅拌。蒙古黄芪蛋白质提取率为 65 mg/g，且质量浓度为 90 μg/mL 粗蛋白的免疫
抑制率为 90.90%。结论 优化的提取工艺能正确反映 AmPR10-16kDa和 HQGP-2收率的最高相对量，为 AmPR10-16kDa和
HQGP-2的进一步研究提供了稳定、合理、可行的提取工艺。
关键词：蒙古黄芪；蛋白质；蛋白质二级结构；SDS-PAGE；正交试验；CCK-8法
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)15 - 2641 -09
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.15.010
Optimization of extraction technology of two immune active proteins from
Astragalus membranaceus var. mongholicus
CHEN Xiu-hong, REN Jin-hong, WEI Yan-ming, XUE Hui-qing, WU Fu-yun, GAO Li, YUE Xiao-hua, LI
Min, LIU Rui, BAI Cheng-zhi, LIANG Rui, LIU Bi-wang
Experiment Mamagement Center, Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China
Abstract: Objective To optimize the extraction technology of immune active glycoproteins AmPR10-16kD and HQGP-2 from
Astragalus membranaceus var. mongholicus (AMM). Methods The optimized extraction temperature conditions were investigated
by circular dichroism of water-soluble protein involving in AmPR10-16kD and HQGP-2 with secondary structure from AMM. The
optimized extraction technology was investigated using single factor test and orthogonal test with gray value of water-soluble protein
AmPR10-16kD and HQGP-2 as the index which was determined by Image of gel graphical analysis software. In this study, the
effects of temperature, solid-liquid ratio, time, solvent, granularity, and times on gray value were investigated, for which the
inhibitory effect of water-soluble protein was determined as an evidence by CCK-8 method, and the content of water-soluble protein
is determined as an evidence by BCA method. Results The optimized extraction technique for proteins AmPR10-16kD and
HQGP-2 in AMM was established, that was 5.0 g powder of AMM over the No.4 sieve, olvent Tris-HCl, solid-liquid ratio 1:16 and
60 min for extraction at the temperature of 40 ℃ and being mixed under 100 r/min. The water-soluble protein extract rate in the
orthogonal test analysis was 65 mg/g, of which inhibitory effect was 90.90% at a concentration of 90 μg/mL. Conclusion The
optimal extraction conditions could accurately reflect the relative amounts of AmPR10-16kD and HQGP-2 maximum extraction rate,
providing a stable, reasonable, and feasible extraction process for further study of the bioactive substance of AMM.
Key words: Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao; protein; secondary structure of protein; SDS-
PAGE; orthogonal test; CCK-8 method

收稿日期：2016-03-31
基金项目：国家国际合作专项项目（2013DFA30700）；山西省科技攻关项目（20130321031-01）；山西省自然科学基金资助项目（2013011052-4）
作者简介：陈秀红，在读硕士研究生，主要从事中药提取分离纯化及活性成分研究。Tel: (0351)3179766 E-mail: chenxhog@126.com
*通信作者 薛慧清，博士，教授，硕士生导师，从事中药及天然药物的提取分离及活性研究。Tel: (0351)3179766 E-mail: xuehuiqing@sina.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 15期 2016年 8月

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黄芪 Astragali Radix为常用大宗药材，始载于
《神农本草经》，有补气固表、利尿消肿、托毒生肌
之功效，被广泛应用于临床各科，素有“十药八芪”
之称[1]，现代药理学研究证明黄芪具有保肝、利尿、
抗肿瘤、抗衰老、抗应激、抗溃疡、调节血糖和血
压、抑制病毒、抗菌等多种作用，不仅能增强机体
的免疫功能，还具有双向调节作用[2-8]。《中国药典》
2015年版[9]收载的黄芪为豆科黄芪属植物蒙古黄芪
Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var.
mongholicus (Bge.) Hsiao 或 膜 荚 黄 芪 A.
membranaceus (Fisch.) Bge. 的干燥根。本课题组从
黄芪中已分离得到具有明显免疫抑制作用的糖蛋白
类化合物 HQGP[10-11]、AmGP-2[12]、AmGP-3[13]、
AmPR10-16kDa（1.60×104）及 HQGP-2（3.10×
104），药理学研究表明黄芪蛋白质对小鼠脾淋巴细
胞有抑制作用 [14-16]；对佐剂性关节炎（adjuvant
arthritis，AA）模型大鼠和实验性自身免疫性脑脊
髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，
EAE）模型小鼠有治疗作用[17-20]。同时淋巴细胞体
外增殖试验显示，黄芪蛋白抑制作用不同于雷公藤
甲素、雷帕霉素、氢化可的松，推测其具有独特的
作用机制[21]。本研究以 AmPR10-16kDa及 HQGP-2
的提取工艺优化为研究对象，采用圆二色谱（CD）
法[22-23]考察提取温度与提取溶剂对目标蛋白结构的
影响，应用 Image 凝胶图形分析软件以 AmPR10-
16kDa及HQGP-2在 SDS-PAGE胶图中的蛋白条带
灰度值（峰面积）为定量指标，采用单因素方差分
析筛选显著性单因素，采用正交试验设计筛选出优
化的提取工艺，采用 CCK-8法测定正交试验设计下
各样品的免疫活性，并采用 BCA 法测定可溶性蛋
白质量来证明所筛选提取工艺的合理性，为
AmPR10-16kDa 及 HQGP-2 的进一步研究提供稳
定、合理、可行的提取工艺。
1 仪器与材料
MOS-500型圆二色光谱仪，法国 Bio-Logic公
司；BIO-RAD3000型电泳系统，美国 Bio-Rad公司；
SpectraMax 190型酶标仪，美国MD公司；PHS-3C
型 pH计，上海精科公司；M150型低温粉碎机，昆
山强威粉体设备有限公司；A-1000S型水流抽气机，
上海爱朗仪器有限公司；AVC-3A1型超净工作台，
新加坡艺思高科技有限公司；倒置显微镜，日本
Olympus公司；HH.CP-160二氧化碳细胞培养箱，
上海姚氏仪器设备厂；BioSpectrum凝胶成像系统，
美国 UVP公司。
SPF级雌性 ICR小鼠，体质量 15～18 g；SPF
级雌性 SD大鼠，体质量 150～180 g，购自北京维
通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号
SCXK（京）（2012）0001。
刀豆蛋白 A（ConA），Sigma公司；细胞增殖-
毒性检测试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8），日
本同仁化学研究所；磷酸盐缓冲液（PBS）、牛血清
白蛋白（BSA）对照品（批号 2015011），武汉博士
德生物公司；非预染中、低相对分子质量（1.44×
104、1.84×104）标准蛋白Marker，美国 Thermo公
司；RPMI 1640培养基（Hyclone改良型），赛默飞
世尔生物化学制品（北京）有限公司；胎牛血清、
青霉素-链霉素混合液（100×）、三羟甲基氨基甲烷
（Tris）均购自北京索莱宝科技有限公司；醋酸格拉
替雷（GA），Sigma 公司；2-(N-吗啉代)乙烷磺酸
（MES）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、十二烷基
硫酸钠（SDS）和二喹啉甲酸（BCA）蛋白质定量
试剂盒，均购自武汉博士德生物公司；水为双蒸水，
试剂均为分析纯。
蒙古黄芪购自山西浑原黄芪种植基地，经山西
中医学院刘计权副教授鉴定为 4～5 年生豆科植物
蒙古黄芪 Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var.
mongholicus (Bge.) Hsiao的干燥根。
2 方法与结果
2.1 可溶性蛋白的圆二色性考察（定性研究）
2.1.1 原料预处理 将黄芪洗净，50 ℃烘干，低温
粉碎，过筛，留 1、2、3、4、5、6号筛粉待用。
2.1.2 测定条件 室温 18～25 ℃，相对湿度
45%～75%。CD 值测试要求：供试品为 1～100
mg/L，液池厚度 1 mm，起始波长 190 nm，终止波
长 250 nm，步长 1 nm，重复 1次，采集时间 1 s，
CD 参数±（100～300）mD，CD 单位为椭圆率，
狭缝宽度 2.0 nm。
2.1.3 不同提取温度的考察 称定药材粉末（3 号
筛）共 7份，每份 5.0 g，用溶剂润湿后装纱布袋，
各加入用 PBS（pH 7.4）50 mL，称定，分别在 4、
25、40、55、70、85、100 ℃时水浴提取 60 min，
4 ℃于冰箱中浸提 60 min，时时搅拌，冷至室温，
称定，加 PBS补足质量，将提取混悬液置于布氏漏
斗抽滤装置中抽滤，滤液过 0.45 μm 滤膜，所得滤
液作为待测溶液，分别吸取 250 μL 待测溶液置于 1
mm石英比色池中，测定其 CD 值，可得到 7 个谱
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（图 1），100 ℃有明显的二级结构 CD 谱；其他温
度的蛋白质的 CD谱图为一条趋向于 X轴的曲线。
说明随着温度的升高，可溶性蛋白在 205～245 nm
范围内部分蛋白的二级结构在发生明显折叠变化，
4 ℃时样品的蛋白质二级结构为 α-螺旋（222 nm），
100 ℃时为 β-转角（212 nm），其他温度 CD 谱也
随温度变化 CD值呈逐渐上升趋式，55 ℃时样品的
蛋白质二级结构居中。



图 1 不同提取温度下可溶性蛋白的 CD谱
Fig. 1 CD spectra of soluble protein at different extraction
temperatures

2.1.4 不同提取溶剂的考察 称定药材粉末（3 号
筛）共 5份，分别加入都含有 10 mmol/L NaCl的
0.02 mol/L醋酸-醋酸铵缓冲液（pH 5.0），25 mmol/L
MES缓冲液（pH 6.0），25 mmol/L HEPES缓冲液
（HEPES，pH 7.0），PBS缓冲液（pH 7.4），25 mmol/L
Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）各 50 mL，提取温度 55 ℃，
其他条件同“2.1.3”项，吸取待测溶液 250 μL 置于
1 mm石英比色池中，测定 CD值。结果如图 2所示：
5条 CD谱带均为趋向于 X轴的曲线，不过随着 pH



图 2 不同提取溶剂的可溶性蛋白 CD谱
Fig. 2 CD spectra of soluble protein using different
extraction solvents
值的升高，每条谱带的 CD值呈逐渐下降趋式。在
205～240 nm，醋酸-醋酸铵缓冲液所提取可溶性蛋
白 CD值最大，依次为MES、PBS、Tris-HCl缓冲
液，HEPES所得可溶性蛋白 CD值最小。
其他因素（料液比、提取时间、药材粒度、提
取次数）对可溶性蛋白的 CD值影响很小，故文中
不再列出具体考察结果。
2.2 AmPR10-16kDa 和 HQGP-2 蛋白质提取单因
素考察
2.2.1 精密度试验 按仪器标准操作方法测定
Marker 1.44×104、1.84×104 标准蛋白（非预染中
低分子量标准蛋白 Marker）的灰度值，其 RSD 分
别为 2.2%、2.0%，表明仪器精密度良好。
2.2.2 稳定性试验 分别计算正交试验 Z3 组蛋白
中 AmPR10-16kDa和 HQGP-2蛋白提取样品在 5、
10、15、20、25、30、35、40、45 min的灰度值，
计算得其 RSD分别为 2.0%、2.2%，表明 45 min内
样品稳定性良好。
2.2.3 重复性试验 取 6份供试蛋白样品（正交试
验 Z3组蛋白），对其中 AmPR10-16kDa和 HQGP-2
蛋白进行灰度值测定，结果其 RSD 分别为 1.6%和
2.1%，证明该方法重复性良好。
2.2.4 提取温度对AmPR10-16kDa和HQGP-2蛋白
收率的影响 称量蒙古黄芪药材粉末（3号筛）共 7
份，每份 5.0 g，溶剂润湿后装入纱布袋，各加入用
PBS（pH 7.4）50 mL，称定，分别在 4、25、40、
55、70、85、100 ℃时水浴提取 60 min，4 ℃于冰
箱中浸提 60 min，时时搅拌，冷至室温，称定，加
PBS补足质量，将提取混悬液置于布氏漏斗抽滤装
置中抽滤，滤液过 0.45 μm 滤膜，所得滤液作为待
测溶液。配制 15%分离胶、5%浓缩胶，加样 10 μL、
Marker 7.0 μL，电泳条件为 80～120 V电压，采用
Image软件与 SPSS 17.0统计学软件（实验中所有结
果用 ±x s表示，两组间均数比较采用 t检验，各组
分间的差异比较用 One-way 检验）对 AmPR10-
16kDa 和 HQGP-2 蛋白条带进行分析，与对照组
1.44×104 蛋白（非预染中低分子量标准蛋白
Marker）条带灰度值比较，P＜0.05为显著性差异，
P＜0.01为极显著性差异（n＝3）。
如图 3所示，随着温度的升高，AmPR10-16kDa
和 HQGP-2蛋白质色带依次变浅，蛋白质杂色带依
次也变浅；如表 1所示，AmPR10-16kDa和 HQGP-2
蛋白质条带的灰度值由高依次降低，依据表 1灰度
1- 4 ℃
2- 25 ℃
3- 40 ℃
4- 55 ℃
5- 70 ℃
6- 85 ℃
7-100 ℃
190 200 210 220 230 240 250
λ/nm
1
3
6 5
4
2
7
CD
参
数
/m
D

20

10

0

−10

−20

−30
190 200 210 220 230 240 250
λ/nm
1-醋酸-醋酸铵缓冲液
2-MES缓冲液
3-HEPES缓冲液
4-PBS缓冲液
5-Tris-HCl缓冲液
9

6

3

0

−3

−6

−9

−12
CD
参
数
/m
D

5
4
2
3
1
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图 3 不同提取温度下提取的 AmPR10-16kDa 和 HQGP-2
SDS-PAGE电泳图
Fig. 3 SDS-PAGE Electrophoresis of AmPR10-16kDa and
HQGP-2 at different extraction temperatures
值的显著性与图 1中 CD值考察结果，故提取温度
的选择水平定为 40、55、70 ℃。
2.2.5 料液比对目标黄芪蛋白得率的影响 称定药
材粉末（3号筛）共 6份，每份 5.0 g，分别加入 PBS
30、40、50、60、70、80 mL，称定，于 55 ℃时水
浴提取，其他条件同“2.2.4”项，以 AmPR10-16kDa
和HQGP-2在 SDS-PAGE胶图中的蛋白条带灰度值
（峰面积）为定量指标，经体积换算后，研究料液比
对目标蛋白得率的影响。如图 4和表 1所示，随着
料液比的逐渐增大，AmPR10-16kDa蛋白质条带的
灰度值依次升高后降低，HQGP-2 蛋白质条带的灰
度值依次降低后升高，依据显著性所示，故料液比
水平选择 1∶12、1∶14、1∶16。
2.2.6 提取时间对目标黄芪蛋白得率的影响 称定

表 1 蒙古黄芪中 AmPR10-16kDa和 HQGP-2蛋白质提取条件单因素灰度值分析 ( x±s, n = 3)
Table 1 Single factor test analysis of gray value of extraction conditions of AmPR10-16kDa and HQGP-2 in AMM ( x ±s, n = 3)
组别 试验号
灰度值
提取温度 料液比 提取时间 提取溶剂 粒度 提取次数
对照 — 113 197±350 143 146±550 129 160±380 111 899±280 74 362±138 123 255±490
AmPR10-16 kDa 1 14 543±250** 15 228±210** 11 436±138** 691±129** 7 669±128** 11 234±328**
2 13 149±255** 18 228±222** 11 141±142** 3 538±109** 9 139±107** 2 302±289**
3 12 594±259** 23 474±189** 12 771±145** 4 556±119** 11 663±122** 1 180±207**
4 9 864±205** 24 402±138** 9 705±151** 4 796±121** 17 781±129** —
5 4 657±268** 27 675±144** 9 270±180** 4 978±149** 13 414±157** —
6 2 609±147** 23 747±167** 6 800±155** — 13 060±161** —
7 949±159** — 5 894±127** — — —
HQGP-2 1 15 075±138** 16 019±201** 10 464±211** 4 595±186** 7 392±129** 9 669±211**
2 12 753±146** 15 686±189** 9 922±171** 7 661±125** 7 738±157** 1 485±189**
3 11 202±199** 15 646±177** 10 956±209** 10 026±172** 8 080±182** 752±189**
4 8 383±172** 17 924±187** 8 034±210** 12 672±159** 15 026±201** —
5 5 701±155** 19 572±197** 8 319±169** 9 472±107** 10 804±209** —
6 4 809±167** 19 982±156** 4 467±152** — 11 157±189** —
7 1 668±177** — 3 997±111** — — —
与对照组比较：**P＜0.01
**P < 0.01 vs control group

药材粉末（3号筛）共 7份，每份 5.0 g，各加入 PBS
50 mL，于 55 ℃水浴提取 30、40、50、60、70、
80、90 min，其他条件同“2.2.4”项，以 AmPR10-
16kDa和HQGP-2在 SDS-PAGE胶图中的蛋白条带
灰度值（峰面积）为定量指标，研究料液比对目标
蛋白得率的影响。如图 5和表 1所示，随着提取时
间的延长，AmPR10-16kDa和 HQGP-2蛋白质色带
先深后浅，灰度值先升高后降低，依据显著性所示，
故提取时间水平选择 40、50、60 min。
2.2.7 溶剂种类对目标黄芪蛋白得率的影响 称定
药材粉末（过 3号筛）5份，每份 5.0 g，分别加入
都含有 10 mmol/L NaCl的 0.02 mol/L醋酸-醋酸铵
缓冲液（pH 5.0），25 mmol/L MES缓冲液（pH 6.0），
25 mmol/L HEPES缓冲液（pH 7.0），PBS缓冲液（pH
7.4），25 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）各 50 mL，
提取温度 55 ℃，其他条件同“2.2.4”项，测定
1 2 3 4 5 6 7
Marker 4 25 40 55 70 85 100
提取温度/℃

1.16×105
6.62×104
4.50×104
3.50×104
3.10×104
2.50×104
1.84×104
1.60×104
1.44×104
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图 4 不同料液比下提取的 AmPR10-16kDa和 HQGP-2的
SDS-PAGE电泳图
Fig. 4 SDS-PAGE Electrophoresis of AmPR10-16kDa and
HQGP-2 at different solid-liquid ratios

图 5 不同提取时间下提取的 AmPR10-16kDa 和 HQGP-2
的 SDS-PAGE电泳图
Fig. 5 SDS-PAGE Electrophoresis of AmPR10-16kDa and
HQGP-2 at different extraction time

AmPR1016kDa和 HQGP-2在 SDS-PAGE胶图中的
蛋白条带灰度值（峰面积），并采用 BCA法测定正
交试验及其显著性单因素的可溶性蛋白的量，研究
溶剂对目标蛋白得率的影响。如图 6和表 1所示，
AmPR10-16kDa的蛋白质条带的灰度值依次升高，
蛋白质色带依次加深，灰度值依次增大，HQGP-2
的先升高后降低，依据表 1 灰度值的显著性与图 2
中 CD值考察结果，故提取溶剂选择 HEPES、PBS、
Tris-HCl。
2.2.8 药材粒度对目标黄芪蛋白得率的影响 称定
1～6号筛药材粉末各 5.0 g，各加入 PBS 50 mL，提
取温度 55 ℃，其他条件同“2.2.4”项，以 AmPR10-
16kDa和HQGP-2在 SDS-PAGE胶图中的蛋白条带
灰度值（峰面积）为定量指标，研究药粉粒度对目
标蛋白得率的影响。如图 7和表 1所示，随着粉末



图 6 不同溶剂种类提取的 AmPR10-16kDa和 HQGP-2的
SDS-PAGE电泳图
Fig. 6 SDS-PAGE Electrophoresis of AmPR10-16kDa and
HQGP-2 using different extraction solvents


图 7 不同药材粒度提取的 AmPR10-16kDa和 HQGP-2的
SDS-PAGE电泳图
Fig. 7 SDS-PAGE Electrophoresis of AmPR10-16kDa and
HQGP-2 by different powder particle sizes

粒度的减小，AmPR10-16kDa和 HQGP-2蛋白质色
带先深后浅，灰度值先增大后减小，4 号筛粉末的
灰度值最大，故选用 4号筛粉末。
2.2.9 提取次数 称定药材粉末（过 4号筛）5.0 g，
提取温度 55 ℃，其他条件同“2.2.4”项，提取 3
次，每次滤液单独放，以 AmPR10-16kDa和 HQGP-2
在 SDS-PAGE胶图中的蛋白条带灰度值（峰面积）
为定量指标，研究提取次数对目标蛋白得率的影响。
如图 8和表 1所示，随着提取次数的增多，AmPR10-
16kDa和 HQGP-2蛋白质色带由深至浅，灰度值由
大变小，提取 1次即可将大部分蛋白浸提出来，故
在规模生产中，提取 2次即可。
2.3 蒙古黄芪粗蛋白提取工艺的优化
2.3.1 正交试验设计 在上述单因素试验的基础
上，以具有显著性的提取温度（A）、料液比（B）、
浸提时间（C）和提取溶剂（D）为考察因素，设计
1 2 3 4 5 6 7


1.16×105
6.62×104
4.50×104
3.50×104
3.10×104
2.50×104
1.84×104
1.60×104
1.44×104
Marker 30 40 50 60 70 80 90
提取时间/min
1.16×105
6.62×104
4.50×104
3.50×104
3.10×104
2.50×104
1.84×104
1.60×104
1.44×104
Marker 1 2 3 4 5
提取溶剂（与图 2相同）


1.16×105
6.62×104
4.50×104
3.50×104
3.10×104
2.50×104
1.84×104
1.60×104
1.44×104
Marker 1 2 3 4 5 6
筛号
1 2 3 4 5 6
Marker 1∶6 1∶8 1∶10 1∶12 1∶14 1∶16
料液比


1.16×105
6.62×104
4.50×104
3.50×104
3.10×104
2.50×104
1.84×104
1.60×104
1.44×104
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图 8 不同提取次数时AmPR10-16kDa和HQGP-2的 SDS-
PAGE电泳图
Fig. 8 SDS-PAGE Electrophoresis of AmPR10-16kDa and
HQGP-2 for different extraction times
4 因素 3 水平的正交试验，以 AmPR10-16kDa 和
HQGP-2在 SDS-PAGE电泳图中的蛋白条带灰度值
（峰面积）为定量指标，从 AmPR10-16kDa 和
HQGP-2 蛋白得率及纯度角度出发，对黄芪粗蛋白
提取工艺进行优化。
2.3.2 供试品溶液的制备 称定药材粉末（过 4号
筛）9份，各 5.0 g，分别向粉末中各加入提取溶剂
为 D 的 B 倍量缓冲液，称定，在温度 A 的条件时
水浴提取 C min，每 10 min搅拌 1次，静置片刻，
冷至室温，称定，补足减失的质量。取以上提取液，
同“2.2.4”项方法抽滤，所得滤液作为待测溶液。
2.3.3 加样 加样14.0 μL，同时加入Marker 7.0 μL。
2.3.4 蒙古黄芪中AmPR10-16kDa和HQGP-2最佳
提取工艺确定 正交试验设计及结果见表 2和图 9，
方差分析见表 3。
由表 2可知 9组试验组合中AmPR10-16kDa和
HQGP-2 各因素的最佳搭配为实验最佳水平组合为
A1B3C3D3；直观分析得出：各因素对AmPR10-16kDa
和 HQGP-2 提取影响的程度均依次为 A＞D＞B＞
C；AmPR10-16kDa的 A因素中 K1＞K2＞K3，D因
素中 K3＞K2＞K1，B因素中 K3＞K2＞K1，C因素中
K3＞K1＞K2；HQGP-2的 A因素中 K1＞K2＞K3，D
因素中 K3＞K1＞K2，B因素中 K3＞K2＞K1，C因素
中 K1＞ K2＞ K3；因此得出最佳水平组合为
A1B3C3D3。
由表 3可知，以极差最小的因素 C为误差项进
行方差分析，结果发现因素 A、D具有显著性差异，
因素 B、C则无显著性影响，按方差分析法的观点，

表 2 蒙古黄芪中 AmPR10-16kDa和 HQGP-2蛋白质提取条件正交试验分析
Table 2 Orthogonal test analysis of extraction conditions of AmPR10-16kDa and HQGP-2 in AMM
试验号 A/℃ B C/min D
灰度值 可溶性粗蛋白
提取率/(mg·g−1) AmPR10-16kDa HQGP-2
1 40 (1) 1∶12 (1) 40 (1) HEPES缓冲液 (1) 429 464.724 106 617.560 56±1
2 40 (1) 1∶14 (2) 50 (2) PBS缓冲液 (2) 468 670.529 105 919.183 61±1
3 40 (1) 1∶16 (3) 60 (3) Tris-HCl缓冲液 (3) 776 509.848 154 194.798 63±1
4 55 (2) 1∶12 (1) 50 (2) Tris-HCl缓冲液 (3) 574 881.345 85 017.140 56±1
5 55 (2) 1∶14 (2) 60 (3) HEPES缓冲液 (1) 346 246.395 37 987.883 53±2
6 55 (2) 1∶16 (3) 40 (1) PBS缓冲液 (2) 368 923.721 70 215.441 53±1
7 70 (3) 1∶12 (1) 60 (3) PBS缓冲液 (2) 113 741.295 16 749.084 47±1
8 70 (3) 1∶14 (2) 40 (1) Tris-HCl缓冲液 (3) 436 618.203 75 190.819 50±1
9 70 (3) 1∶16 (3) 50 (2) HEPES缓冲液 (1) 110 531.627 48 364.498 48±1
K1 558 215.034 372 695.788 411 668.883 295 414.249 — — —
122 243.847 69 461.261 84 007.940 64 323.314 — — —
K2 430 017.154 417 178.376 384 694.500 317 111.848 — — —
64 406.821 73 032.628 79 766.940 64 294.569 — — —
K3 220 297.042 418 655.065 412 165.846 596 003.132 — — —
46 768.134 90 924.912 69 643.922 104 800.919 — — —
R 337 917.992 45 959.277 27 471.346 300 588.883 — — —
75 475.713 21 463.651 14 364.018 40 506.350 — — —
Marker 1 2 3
次数



1.16×105
6.62×104
4.50×104
3.50×104
3.10×104
2.50×104
1.84×104
1.60×104
1.44×104
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图 9 正交试验中各样品的 SDS-PAGE电泳图
Fig. 9 SDS-PAGE Electrophoresis of each sample in
orthogonal test

表 3 AmPR10-16kDa和HQGP-2蛋白质提取条件方差分析
Table 3 ANOVA on extraction conditions of AmPR10-
16kDa and HQGP-2
方差来源 偏差平方和 自由度 F值 显著性
A 1.75×1011 2 117.78 P＜0.01
9.35×109 2 28.62 P＜0.05
B 4.09×109 2 2.76
7.94×108 2 2.43
C (误差) 1.48×109 2 1.00
3.27×108 2 1.00
D 1.69×1011 2 113.73 P＜0.01
3.28×109 2 10.04
F0.05(2, 2) = 19.00 F0.01(2, 2) = 99.00

只需对有显著影响的因素选择最佳水平，而其他对
试验结果影响较小的因素，则可按实际需要选择适
当的水平，选择最佳提取工艺条件为 A1B3C3D3，即
向药材粉末（过 4 号筛）中加入 pH 值为 8.00 的
Tris-HCl缓冲液 16倍，在温度 40 ℃条件下常压水
浴提取 60 min，时时搅拌（100 r/min）。
2.3.5 验证试验 分别取 3份药材粉末 Y1、Y2、Y3
（过 4号筛）各 5.0 g，各加入 16倍量 Tris-HCl，在
温度 40 ℃条件下恒温提取 60 min，时时搅拌（100
r/min）。取以上提取液，同“2.2.4”项方法抽滤，
所得滤液作为待测溶液。对所得 3份黄芪粗蛋白样
品分别制作 SDS-PAGE胶图，加样同“2.3.3”项方
法，并测定可溶性蛋白提取率。结果见表 4，结果
证明该提取工艺稳定性良好。
2.4 蒙古黄芪粗蛋白的体外免疫抑制活性测定
2.4.1 样品处理 黄芪粗蛋白样品在 4 ℃下透析
表 4 验证试验
Table 4 Validation test
样品
灰度值 可溶性粗蛋白
提取率/(mg·g−1) AmPR10-16kDa HQGP-2
Y1 796 666.006 166 204.456 66
Y2 789 236.556 159 227.331 65
Y3 771 220.079 156 224.007 64
RSD/% 1.67 3.19 1.54

（透析袋截留相对分子质量 3.5×103）过夜，蛋白得
率 90%～95%，经 SDS-PAGE跑胶得蛋白条带数量
未有改变，纯化倍数（以小鼠为基准）是 0.94。
2.4.2 免疫抑制活性测定 采用 CCK-8 法测定正
交试验中 9组黄芪粗蛋白的体外免疫抑制活性，正
交实验中的 9 组取终质量浓度为 10 μg/mL 蛋白样
品，最优组合为 10、30、50、70、90 μg/mL 5 个终
质量浓度梯度。常规制备小鼠用脾淋巴细胞[24]，调
节细胞悬液密度为 3×109/L，并用台盼蓝染色检测
细胞活力＞99%。于 96孔细胞培养板中每孔加入制
备好的细胞悬液 100 μL 及 ConA 5 μL（终质量浓度
5 μg/mL），将培养板在培养箱中预培养 24 h（37 ℃，
5% CO2），用完全培养基稀释样品成不同质量浓度，
每孔加入 8 μL 上述质量浓度的含样品培养基至终
质量浓度，空白组加入不含细胞的培养基，阴性对
照加入含有细胞的培养基，阳性对照组加入醋酸格
拉替雷（GA）至终质量浓度为 30 μg/mL，每个组 6
个重复孔，将细胞培养板置于 37 ℃、5% CO2培养
箱孵育 48 h。将细胞培养板取出后，向每孔加入 10
μL CCK-8溶液，将其置于培养箱内孵育 4 h，用酶
标仪测定在 450 nm处的吸光度（A）值。
细胞形态观察：采用倒置显微镜观察样品抑制
率最高的脾细胞形态变化。结果如表 5所示，由正
交试验的 9组实验数据可知，正交试验 3的抑制率
最高，其次为正交试验 4组，样品对 SD大鼠和 ICR
小鼠脾淋巴细胞的抑制作用差距不大，正交试验 3
组样品对脾淋巴细胞的抑制率随着浓度的增加而增
加，呈现出明显的量效关系，在最高质量浓度 90
μg/mL 时抑制率为 90.90%，与阳性对照醋酸格拉替
雷的抑制率相接近。
在上述实验中，样品对 ICR小鼠脾淋巴细胞的
抑制率最高，故选择对黄芪粗蛋白较敏感的 ICR小
鼠脾淋巴细胞进行形态学观察，黄芪粗蛋白在不同
质量浓度（10、30、50、70、90 μg/mL）条件下对
Marker 1 2 3 4 5 6 7 8 9
次数

1.16×105
6.62×104
4.50×104
3.50×104
3.10×104
2.50×104
1.84×104
1.60×104
1.44×104
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表 5 蒙古黄芪粗蛋白对 SD大鼠与 ICR小鼠脾淋巴细胞的
抑制作用 ( x±s, n = 3)
Table 5 Inhibitory effect of crude protein from AMM on
lymphocyte in spleen of SD rats and ICR mice ( x ±s, n = 3)
组别
质量浓度/
(μg·mL−1)
脾淋巴细胞抑制率/%
SD大鼠 ICR小鼠
阴性对照组 0 — —
阳性对照组
（醋酸格拉替雷）
30 93.96±1.03 96.23±1.38
正交试验 1 10 35.71±0.79 37.79±1.67
2 10 48.09±1.09 51.70±1.60
3 10 59.35±2.76 64.10±2.94
4 10 57.27±1.89 62.62±0.12
5 10 35.98±2.23 39.90±1.08
6 10 46.88±1.07 49.50±1.47
7 10 39.01±0.99 40.73±0.14
8 10 34.89±1.78 37.24±2.02
9 10 32.11±2.01 34.05±1.69
正交试验 3
（抑制率最高组合）
90 88.71±2.77* 90.90±4.84*
70 78.78±2.61* 82.04±1.22*
50 70.56±2.65* 75.32±1.77*
30 65.22±3.61** 70.18±3.41*
10 57.22±3.01** 62.07±2.52**
正交试验 3（未透析） 10 60.33±3.41** 66.03±2.07**
与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group

小鼠脾淋巴细胞均有影响，阴性对照组的脾淋巴细
胞的形态完整、数量众多，阳性对照组（醋酸格拉
替雷）和 90 μg/mL 的脾淋巴细胞急剧减少、细胞的
完整性受到损坏、出现明显的细胞碎片和细胞集聚
现象，细胞的受损程度与浓度有相关性。
3 讨论
在自身免疫性疾病和器官移植抗排异反应的治
疗中，免疫抑制剂的使用量较大，只是化学药类免
疫抑制剂毒副作用大，中药历来以药效广泛、毒副
作用小为优点，可弥补化学药的不足，尤其对于长
期用药的慢性排异、自身免疫性疾病。目前，国内
研究成熟的中药免疫抑制剂只有雷公藤多苷[25]，国
外有日本研发的冬虫夏草提取物修饰产品 FTY
720[26]，显示出中药免疫抑制剂的开发意义非常大。
本实验在以往黄芪可溶性蛋白提取及纯化的基
础上 [10-13,27-29]，进一步提出以提高目标蛋白
AmPR10-16kDa和 HQGP-2的提取率及降低其纯化
难度为目标，对提取温度、料液比、提取时间、提
取溶剂、药粉粒度、提取次数 6因素进行考察，以
显著性单因素做正交试验。其中，提取温度的筛选，
采用 CD 法进行考察，与所得纯品 AmPR10-16kDa
和 HQGP-2（质量分数＞95%）的蛋白质二级结构
进行比照，如果纯品 AmPR10-16kDa和 HQGP-2的
蛋白质二级结构拟合于α-螺旋，则提取温度≤40 ℃
更合理，反之则＞40 ℃更合理；以各因素 SDS-
PAGE 电泳图的蛋白条带灰度值为指标选出显著性
单因素；分析正交试验所得的蛋白条带灰度值和可
溶性蛋白对脾淋巴细胞的免疫抑制活性结果，说明
以目标蛋白的收率为指标所优化的提取条件更科学
合理。
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