全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 9 期 2013 年 5 月

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Z-藁本内酯对人脐静脉内皮细胞保护作用及其机制研究
王迎超 1，黄 怡 1，王 毅 1，王 怡 2，张 萌 2*
1. 浙江大学药物信息学研究所，浙江 杭州 310058
2. 天津中医药大学 现代中药国家重点实验室，天津 300193
摘 要：目的 通过观察 Z-藁本内酯对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞间黏附分子-1
（ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）及核因子-κB（NF-κB）表达的影响，探讨其对炎性因子损伤内皮细胞的保护
作用及其机制。方法 向体外培养的 HUVEC 中加入 TNF-α 10 ng/mL 造成细胞损伤，同时加入不同浓度（5、10、20 μmol/L）
的 Z-藁本内酯，共同孵育 24 h，MTT 法检测各组细胞活力，ELISA 法测定细胞培养液中 ICAM-1 和 VCAM-1 的量，Western
blotting 法检测各组细胞 NF-κB 蛋白表达。结果 与对照组比较，TNF-α 可造成 HUVEC 明显损伤（P＜0.05、0.01），显著
增加 HUVEC 中 ICAM-1 和 VCAM-1 的表达（P＜0.01）。与模型组比较，Z-藁本内酯可以剂量相关地降低 ICAM-1（P＜0.01）
和 VCAM-1（P＜0.05）的表达，显著减少细胞 NF-κB 蛋白的表达（P＜0.05）。结论 Z-藁本内酯可减轻 TNF-α 对 HUVEC
的损伤，其作用机制可能与通过抑制 NF-κB 的激活，进而减少 ICAM-1 和 VCAM-1 的表达有关。
关键词：Z-藁本内酯；人脐静脉内皮细胞；肿瘤坏死因子-α；细胞间黏附分子-1；血管细胞黏附分子-1；核转录因子-κB
中图分类号：R282.710.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)09 - 1157 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.09.017
Protection of Z-ligustilide on human umbilical vein endothelial cells and its mechanism
WANG Ying-chao1, HUANG Yi1, WANG Yi1, WANG Yi2, ZHANG Meng2
1. Institute of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China
2. Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193,
China
Abstract: Objective To observe the effect of Z-ligustilide on the expression of tumor necrosis factor-α (TNF-α)-induced human
umbilical vein endothelial cells (HUVEC) intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1),
and nuclear factor kappa B (NF-κB), and to investigate the protection on endothelial cells injured by inflammatory cytokines and its
mechanism. Methods TNF-α (10 ng/mL) was added to in vitro cultured HUVEC to induce the cell injury. After co-incubated with the
different concentration (5, 10, and 20 μmol/L) of Z-ligustilide for 24 h, the cell viability in each group was measured by MTT. The levels
of ICAM-1 and VCAM-1 were assayed using enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Western blotting was used to detect the
expression of NF-κB protein of cell in each group. Results TNF-α could induce the obvious injury of HUVEC compared with the
control group (P < 0.05, 0.01), and increase the expression of ICAM-1 and VCAM-1 in HUVEC (P < 0.01). Compared with the model
group, Z-ligustilide could dose-dependently reduce the expression of ICAM-1 (P < 0.01) and VCAM-1 (P < 0.05) and obviously decrease
the NF-κB expression (P < 0.05). Conclusion Z-ligustilide could attenuate TNF-α-induced injury in HUVEC via suppressing the
activation of NF-κB and inhibiting the excessive expression of ICAM-1 and VCAM-1.
Key words: Z-ligustilide; human umbilical vein endothelial cells; tumor necrosis factor-α; intercellular adhesion molecule-1; vascular
cell adhesion molecule-1; nuclear factor kappa B

血管内皮细胞具有多种生物学功能，它所产生
和分泌的多种生物活性物质具有维持血管张力、调
节血压、抗血栓形成等作用。血管内皮细胞损伤是
动脉粥样硬化（AS）发病的始动环节，损伤后的内
皮细胞合成和分泌血管活性物质的功能和细胞因子
间平衡遭到破坏。白细胞特别是单核细胞与活化血
管内皮细胞黏附并迁移聚集于内膜下，摄取氧化低
密度脂蛋白形成泡沫细胞，而大量的泡沫细胞堆积

收稿日期：2012-08-16
基金项目：科技部国际合作课题（2009DFB30510）
作者简介：王迎超（1989—），男，硕士研究生。E-mail: chaoyingwang@163.com
*通信作者 张 萌 E-mail: zhangm7@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 9 期 2013 年 5 月

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最终形成 AS。
许多中药及其活性成分能够保护TNF-α损伤的
血管内皮细胞，进而发挥抗 AS 作用[1-2]。Z-藁本内
酯是川芎和当归中主要的内酯类化合物，也是其主
要活性成分。药理研究表明，Z-藁本内酯有良好的
抗炎、镇痛和保护大脑缺血再灌注损伤等作用[3-7]，
但其对 AS 的作用鲜见报道。本实验采用体外培养
人脐静脉内皮细胞（HUVEC），建立肿瘤坏死因子-α
（TNF-α）诱导的炎症损伤模型，通过研究 Z-藁本内
酯对 HUVEC 细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管
细胞黏附分子-1（VCAM-1）及核因子-κB（NF-κB）
的表达，探讨 Z-藁本内酯的内皮保护作用及其机制。
1 材料
1.1 药品和试剂
Z-藁本内酯（质量分数＞98%），上海融禾医药
科技有限公司，批号 110825。二甲基亚砜（DMSO）、
噻唑蓝（MTT），Sigma 公司；高糖 M199 培养基、
胰蛋白酶、I 型胶原酶、胎牛血清（FBS），Gibco
公司；TNF-α，Prospec 公司；ICAM-1、VCAM-1
ELISA 试剂盒，NF-κB 抗体，R&D 公司；β-actin
抗体，碧云天生物技术研究所；核蛋白和胞浆蛋白
提取试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司。
SDS-PAGE 浓缩胶和分离胶自制。
1.2 仪器
ELx800 酶标仪，美国 BioTek 公司；DYY—6C
型电泳仪，北京市六一仪器厂；iBlotTM Gel Transfer
System，美国 Invitrogen 公司；UMAX—2100XL 扫
描仪，北京志和利华科贸有限公司。
1.3 细胞
HUVEC，由浙江大学医学院附属妇产科医院提
供脐带，自行消化分离细胞。
2 方法
2.1 细胞培养
HUVEC 细胞置于含 12.5% FBS 的高糖 M199
培养基中，于 37 ℃、5% CO2 恒温培养，每 2 d 换
液 1 次，待细胞生长至 80%融合时，0.25%胰蛋白
酶-0.02% EDTA 消化传代，传代比例 1∶2，3～4 d
传代 1 次。所有实验均采用对数生长期细胞进行。
2.2 TNF-α致 HUVEC 损伤浓度筛选
调整对数生长期 HUVEC 浓度为 2.0×105/mL，
以每孔 100 μL 接种于 96 孔板中。24 h 后，待细胞
贴壁生长至融合，更换无血清高糖 M199 培养液同
步化处理 12 h。将细胞分成对照组（给予完全培养
液，即 M199＋12.5% FBS），TNF-α 1.25、2.5、5、
10 ng/mL 组（均同时加入完全培养液），各组细胞
于 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养 24 h，吸弃培养液，
每孔加入 MTT 稀释液（0.5 mg/mL）100 μL，37 ℃、
5% CO2 培养箱中继续孵育 4 h 后弃 MTT 液，每孔
加入 100 μL DMSO 以溶解甲臜，混匀后，酶标仪测
定 550 nm 处吸光度（A）值。
2.3 MTT 法检测 HUVEC 活力
实验分为对照组（给予完全培养液，即 M199＋
12.5% FBS），模型组（加入 TNF-α 10 ng/mL），Z-
藁本内酯低、中、高浓度组（在给予 TNF-α 10 ng/mL
的同时，分别加入 Z-藁本内酯 5、10、20 μmol/L），
于 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养 24 h，吸弃培养液，
每孔加入 MTT 稀释液（0.5 mg/mL）100 μL，37 ℃、
5% CO2 培养箱中继续孵育 4 h，弃掉 MTT 液，每
孔加入 100 μL DMSO 溶解甲臜，混匀后，酶标仪测
定 550 nm 处 A 值。
2.4 ELISA 检测 ICAM-1 和 VCAM-1 的量
将 HUVEC 以 1×106/孔接种在 6 孔板中，待细
胞贴壁融合后，更换无血清 M199 培养液同步化处
理 12 h，用含有不同浓度（5、10、20 μmol/L）Z-
藁本内酯和 TNF-α（终浓度为 10 ng/mL）的 M199
完全培养液在 37 ℃培养 24 h，收集上清液，按照
ELISA 试剂盒说明书测定 ICAM-1 和 VCAM-1 的
量。先分别向酶标板中加入辣根过氧化物酶标记的
ICAM-1 和 VCAM-1 单克隆抗体，同时加入待测样
品上清液 100 μL，室温孵育 1.5 h，洗涤液洗板 4
次，于反应孔内加入底物溶液室温避光反应 20～30
min，50 μL 终止液终止反应，并于 450 nm 波长处
读取 A 值。按照试剂盒说明随行标准曲线测定各组
ICAM-1 和 VCAM-1 的量。
2.5 Western blotting 法检测 NF-κB 表达
实验分组与处理同“2.4”项。收集细胞上清液
后，细胞用预冷 PBS 清洗，按照核蛋白和胞浆蛋白
提取试剂盒说明提取细胞核蛋白。将等量蛋白样品
与上样缓冲液 1∶1 混合，94 ℃水浴 10 min 使蛋白
充分变性，10% SDS-PAGE 进行电泳，电泳结束后
将蛋白移至 PVDF 膜上，室温下 10%牛奶封闭 2 h，
分别与 NF-κB 抗体（1∶500）、Actin 抗体（1∶1 000）
4 ℃共同孵育过夜，T-PBS 洗 15 min，共洗 3 次。
用对应的辣根过氧化物酶结合的二抗（1∶10 000）
室温孵育 2 h，T-PBS 洗 3 次，每次 15 min，ECL
显色后曝光。蛋白条带用 UMAX—2100XL 扫描仪
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扫描，Quantity One 软件计算条带灰度值。
2.6 数据处理
数据以 ±x s 表示，组间比较采用 t 检验。
3 结果
3.1 TNF-α致 HUVEC 损伤浓度筛选
向体外培养的 HUVEC 加入 TNF-α后，细胞活
力降低，且降低程度随 TNF-α质量浓度的增加而加
强，细胞存活率与对照组相比显著下降（P＜0.05、
0.01）。结果见图 1。当 TNF-α质量浓度为 10 ng/mL
时，细胞存活率约 83%，因此确定在后续实验中采
用 TNF-α质量浓度为 10 ng/mL。
3.2 对 TNF-α损伤的 HUVEC 活力的影响
与对照组相比，TNF-α明显降低 HUVEC 活力

与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group
图 1 TNF-α对 HUVEC 活力的影响 ( 3=± n , sx )
Fig. 1 Effect of TNF-α on cell viability of HUVEC
( 3=± n , sx )
（P＜0.01）；而 Z-藁本内酯 1～100 μmol/L 与 TNF-α
共同作用于 HUVEC 时，HUVEC 活力强于模型组，
且与对照组相比无统计学差异，提示 Z-藁本内酯抑
制黏附分子分泌及降低 NF-κB 表达的作用不是通
过其细胞毒作用产生的。结果见图 2。后续实验选
择 Z-藁本内酯 5、10、20 μmol/L 3 个浓度进行。
3.3 对 TNF-α 损伤的 HUVEC 中 ICAM-1 和
VCAM-1 表达的影响
对照组 HUVEC 中 ICAM-1 和 VCAM-1 表达量
较低，而模型组中 ICAM-1 和 VCAM-1 表达量均显
著增加（P＜0.01），表明炎性因子损伤内皮细胞后
细胞黏附因子表达均显著增加。Z-藁本内酯干预后，
可以浓度相关地抑制 ICAM-1和VCAM-1的过度表
达（P＜0.05、0.01）。结果见图 3。

与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group
图 2 Z-藁本内酯对 TNF-α 损伤的 HUVEC 活力的影响
( 3=± n , sx )
Fig. 2 Effect of Z-ligustilide on HUVEC viability injured by
TNF-α ( 3=± n , sx )

与对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：▲P＜0.05 ▲▲P＜0.01
**P < 0.01 vs control group; ▲P < 0.05 ▲▲P < 0.01 vs model group
图 3 Z-藁本内酯对 TNF-α损伤的 HUVEC 中 ICAM-1 和 VCAM-1 表达的影响 ( 3=± n , sx )
Fig. 3 Effect of Z-ligustilide on expression of ICAM-1 and VCAM-1 in HUVEC injured by TNF-α ( 3=± n , sx )

对照 1.25 2.5 5.0 10.0
TNF-α / (ng·mL−1)
**
** *
120
100
80
60
40
20
0
细
胞
存
活
率
/
%


120
100
80
60
40
20
0
细
胞
存
活
率
/
%

** *
对照 模型 0.1 1 5 10 20 50 100
Z-藁本内酯 / (μmol·L−1)

对照 模型 5 10 20
Z-藁本内酯 / (μmol·L−1)
**
▲▲
**
▲
▲
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
IC
A
M
-1
表
达
/
%

V
C
A
M
-1
表
达
/
%

对照 模型 5 10 20
Z-藁本内酯 / (μmol·L−1)
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3.4 对 TNF-α损伤的 HUVEC NF-κB 表达的影响
与对照组相比，TNF-α 10 ng/mL 作用于正常
HUVEC，显著增加细胞核内 NF-κB 蛋白表达（P＜
0.05）。与模型组相比，Z-藁本内酯可降低 TNF-α损
伤的 HUVEC 中 NF-κB 蛋白表达，并呈浓度相关，
浓度达 20 μmol/L 时，作用显著（P＜0.05）。结果
见图 4。

与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：▲P＜0.05
*P < 0.05 vs control group; ▲P < 0.05 vs model group
图 4 Z-藁本内酯对 TNF-α损伤的 HUVEC 中 NF-κB 表达
的影响 ( 3=± n , sx )
Fig. 4 Effect of Z-ligustilide on expression of NF-κB in
HUVEC injured by TNF-α ( 3=± n , sx )
4 讨论
近年来对血管内皮的研究使人们重新认识血管
内皮功能和多种心血管疾病的发病机制，发现多种
药物能调整内皮细胞的内环境及其分泌功能，从而
逆转内皮功能障碍[8]。本实验发现，TNF-α 10 ng/mL
可以显著降低 HUVEC 活力；而 Z-藁本内酯在浓度
大于 0.01 μmol/L 且与 TNF-α 共同作用于 HUVEC
时，未造成细胞活力明显降低，高浓度时可以提高
HUVEC 存活率，表明 Z-藁本内酯抑制 ICAM-1 和
VCAM-1分泌及降低NF-κB表达的作用不是通过其
细胞毒作用而产生的[9]。
TNF-α是一种单核因子，主要由活化的单核/巨
噬细胞产生。TNF-α损伤HUVEC后，可使由HUVEC
合成和分泌的血管活性物质和细胞因子间平衡遭到
破坏，内皮细胞黏附分子和化学趋化因子等表达增
加，ICAM-1 和 VCAM-1 可介导循环系统中白细胞
特别是单核细胞与活化血管内皮细胞黏附并迁移聚
集于内膜下，摄取脂质形成泡沫细胞，大量的泡沫
细胞堆积最终形成 AS[10-11]。本研究结果显示，TNF-α
作用于 HUVEC 后，HUVEC 分泌 ICAM-1 和
VCAM-1 的量显著增加，与文献报道一致[12]；而当
Z-藁本内酯干预后，明显抑制 ICAM-1 和 VCAM-1
的表达。NF-κB 是一种多极性转录调节蛋白，能调
节多种参与免疫反应的细胞因子、炎症介质、黏附
分子的基因转录过程，诱导 mRNA 表达。NF-κB 未
被激活时与 IκB-α 形成一个复合物，分布在细胞浆
中，当受到 TNF、LPS 等炎症细胞因子刺激后，IκB-α
将发生磷酸化而迅速降解，NF-κB 被释放，激活并
进入细胞核，与 ICAM-1 和 VCAM-1 等黏附分子的
启动子和增强子中的 κB 序列位点特异性结合，从而
启动一系列基因的转录[13-14]。本研究发现，Z-藁本内
酯可抑制 TNF-α激活 NF-κB，有效阻止 NF-κB 的激
活和释放入核，提示 Z-藁本内酯可能是通过抑制
NF-κB 的激活，从而减少内皮细胞 ICAM-1 和
VCAM-1 的表达，发挥其内皮保护功能。
参考文献
[1] Zeng Y, Song J X, Shen X C. Herbal remedies supply a
novel prospect for the treatment of atherosclerosis: a
review of current mechanism studies [J]. Phytother Res,
2012, 26(2): 159-167.
[2] Yang Y Y, Hu C J, Chang S M, et al. Aspirin inhibits
monocyte chemoattractant protein-1 and interleukin-8
expression in TNF-alpha stimulated human umbilical vein
endothelial cells [J]. Atherosclerosis, 2004, 174(2): 207-
213.
[3] Chung J W, Choi R J, Seo E K, et al. Anti-inflammatory
effects of (Z)-ligustilide through suppression of mitogen-
activated protein kinases and nuclear factor- kappa B
activation pathways [J]. Arch Pharm Res, 2012, 35(4):
723-732.
[4] Du J, Yu Y, Ke Y, et al. Ligustilide attenuates pain
behavior induced by acetic acid or formalin [J]. J Ethno-
pharmacol, 2007, 112(1): 211-214.
[5] Kuang X, Du J R, Liu Y X, et al. Postischemic
administration of Z-Ligustilide ameliorates cognitive
dysfunction and brain damage induced by permanent
forebrain ischemia in rats [J]. Pharmacol Biochem Behav,
2008, 88(3): 213-221.
[6] Peng H Y, Du J R, Zhang G Y, et al. Neuroprotective effect
of Z-ligustilide against permanent focal ischemic damage in
rats [J]. Biol Pharm Bull, 2007, 30(2): 309- 312.
[7] Wu X M, Qian Z M, Zhu L, et al. Neuroprotective effect
of ligustilide against ischaemia-reperfusion injury via
up-regulation of erythropoietin and down-regulation of
NF-κB
β-actin
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
N
F-
κB
/β
-a
ct
in

▲
*
对照 模型 5 10 20
Z-藁本内酯 / (μmol·L−1)
6.5×104
4.2×104
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 9 期 2013 年 5 月

·1161·
RTP801 [J]. Br J Pharmacol, 2011, 164(2): 332-343.
[8] 王 静, 吴时达. 中药对血管内皮功能的保护作用 [J].
中国动脉硬化杂志, 2005, 13(1): 116-118.
[9] Yu A L, Lu C Y, Wang T S, et al. Induction of heme
oxygenase 1 and inhibition of tumor necrosis factor
alpha-induced intercellular adhesion molecule expression
by andrographolide in EA. hy926 cells [J]. J Agric Food
Chem, 2010, 58(13): 7641-7648.
[10] 何玉辉, 刘惠亮. 粘附分子与动脉粥样硬化关系的研
究进展 [J]. 疑难病杂志, 2006, 5(2): 155-157.
[11] Lawson C, Wolf S. ICAM-1 signaling in endothelial cells
[J]. Pharmacol Rep, 2009, 61(1): 22-32.
[12] Mochizuki M, Tsuchie Y, Yamada N, et al. Effect of
sesame lignans on TNF-alpha-induced expression of
adhesion molecules in endothelial cells [J]. Biosci
Biotechnol Biochem, 2010, 74(8): 1539-1544.
[13] 朱 妮. 核转录因子 NF-κB 及其抑制剂的研究进展
[J]. 中国生物制品学杂志, 2011, 24(7): 869-872.
[14] Wick G, Grundtman C. Inflammation and Atherosclerosis
[M]. New York: Springer Wien, 2012.