全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 11 期 2015 年 6 月

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热毒宁注射液化学成分研究（II）
李海波 1, 2, 3，于 洋 3，王振中 1, 2，梅玉丹 3，秦大鹏 3，李 林 3，萧 伟 1, 2*，姚新生 3*
1. 江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001
2. 中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港 222001
3. 暨南大学药学院中药及天然药物研究所，广东 广州 510632
摘 要：目的 研究中药复方热毒宁注射液化学成分。方法 综合应用硅胶、ODS、Sephadex LH-20 和 Toyopearl HW-40 柱
色谱以及反相 MPLC、HPLC 等现代色谱技术进行分离和纯化，根据化合物的光谱数据和理化性质鉴定化合物结构，并通过
观察细胞病变效应（CPE）和检测细胞存活率的方法，对分离得到的咖啡酰奎宁酸类化合物进行了体外抗呼吸道合胞病毒
（RSV）作用研究。结果 从热毒宁注射液中分离得到 16 个化合物，分别鉴定为 5-O-咖啡酰奎宁酸（1）、5-O-咖啡酰奎宁酸
甲酯（2）、4-O-咖啡酰奎宁酸（3）、4-O-咖啡酰奎宁酸甲酯（4）、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸（5）、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯
（6）、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸（7）、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯（8）、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸（9）、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸甲
酯（10）、断马钱子酸（11）、马钱子苷半缩醛内酯（12）、7-表-马钱子苷半缩醛内酯（13）、E-aldosecologanin（14）、Z-aldosecologanin
（15）、5H,8H-pyrano [4,3-d] thiazolo [3,2-a] pyridine-3-carboxylic acid（16）。化合物 1～10 具有较强的体外抗 RSV 的效果，其
中化合物 1～4 的 EC50值在 10～30 μmol/L，选择指数（SI）大于 30；化合物 5～10 的 EC50值小于 10 μmol/L，SI 大于 100。
结论 化合物 1～16 均为首次从热毒宁注射液中分离得到，咖啡酰奎宁酸类化合物可能为热毒宁注射液抗病毒的主要药效物
质基础之一。
关键词：热毒宁注射液；抗病毒；咖啡酰奎宁酸；5-O-咖啡酰奎宁酸；断马钱子酸
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)11 - 1597 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.11.006
Study on chemical constituents from Re-Du-Ning Injection (II)
LI Hai-bo1, 2, 3, YU Yang3, WANG Zhen-zhong1, 2, MEI Yu-dan3, QIN Da-peng3, LI Lin3, XIAO Wei1, 2, YAO
Xin-sheng3
1. Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China
2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China
3. Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Products, College of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou 510632, China
Abstract: Objective To investigate the chemical constituents from Re-Du-Ning Injection (RDN). Methods The chemical
constituents were isolated by chromatography on silica gel, ODS, Sephadex LH-20, and Toyopearl HW-40 columns and reverse phase
MPLC and HPLC repeatedly. Their structures were identified by spectral data and physicochemical property. Results Sixteen
compounds were isolated and identified as 5-O-caffeoylquinic acid (1), 5-O-caffeoylquinic acid methyl ester (2), 4-O-caffeoylquinic
acid (3), 5-O-caffeoylquinic acid methyl ester (4), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (5), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid methyl ester (6), 3,5-
di-O-caffeoylquinic acid (7), 3,5-di-O-caffeoylquinic acid methyl ester (8), 3,4-di-O-caffeoylquinic acid (9), 3,4-di-O-caffeoylquinic
acid methyl ester (10), secologanic acid (11), vogeloside (12), 7-epi-vogeloside (13), E-aldosecologanin (14), Z-aldosecologanin (15),
and 5H,8H-pyrano [4,3-d] thiazolo [3,2-a] pyridine-3-carboxylic acid (16). Compounds 1—10 showed high efficiency and low toxicity
with antivirus activity against RSV. Conclusion All the isolated compounds are reported from RDN Injection for the first time, and
caffeoylquinic acids may be one of antivirus pharmacodynamic material bases of RDN.
Key words: Re-Du-Ning Injection; antivirus; caffeoylquinic acid; 5-O-caffeoylquinic acid; secologanic acid

收稿日期：2014-12-15
基金项目：江苏省自然科学青年基金：基于活性成分追踪分离及快速检识分析新策略的中药复方药效物质基础研究（BK20140441）；江苏省博
士后科研资助计划（1401171C）
作者简介：李海波（1985—），女，福建宁德人，博士，研究方向为中药及天然药物的活性成分研究。E-mail: lihaibo1985124@sina.com
*通信作者 萧 伟，教授，博士生导师，研究方向为中药新剂型的研究与开发。Tel: (0518)85521956 E-mail: xw_kanion@163.com
姚新生，中国工程院院士，博士生导师，研究方向为中药及天然药物活性成分研究。Tel: (020)85225849 E-mail: tyaoxs@jnu.edu.cn
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热毒宁注射液是江苏康缘药业股份有限公司自
主研发的原国家中药二类新药，属中药复方注射液，
由栀子、青蒿和金银花 3 味中药精制而成，具有清
热、疏风、解毒的功效，临床上主要用于治疗外感
风热所致的感冒、咳嗽、上呼吸道感染、急性支气
管炎等症[1-3]。其临床疗效确切，效果显著，前期报
道从热毒宁注射液抗病毒活性部位（95%乙醇洗脱
部位）中分离鉴定 20 个化合物，并对黄酮类化合物
进行了体外抗病毒活性评价，结果显示木犀草素具
有较强的体外抗甲型流感病毒的活性[4]。热毒宁注
射液正丁醇萃取部位的 HPLC 液相图谱涵盖了热毒
宁注射液的主要色谱峰，为了全面阐释热毒宁注射
液中的化学成分，并对注射液指纹图谱中的色谱峰
进行指认，本实验拟对热毒宁注射液正丁醇部位的
化学成分进行研究，从中分离得到 16 个化合物，分
别鉴定为 5-O-咖啡酰奎宁酸（5-O- caffeoylquinic
acid，1）、5-O-咖啡酰奎宁酸甲酯（5-O- caffeoylquinic
acid methyl ester，2）、4-O-咖啡酰奎宁酸（4-O-
caffeoylquinic acid，3）、4-O-咖啡酰奎宁酸甲酯
（5-O-caffeoylquinic acid methyl ester，4）、4,5-O-二
咖啡酰奎宁酸（4,5-di-O-caffeoylquinic acid，5）、
4,5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯（4,5-di-O- caffeoylquinic
acid methyl ester，6）、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸
（3,5-di-O-caffeoylquinic acid，7）、3,5-O-二咖啡酰
奎宁酸甲酯（3,5-di-O-caffeoylquinic acid methyl
ester ， 8 ）、 3,4-O- 二咖啡酰奎宁酸（ 3,4-di-O-
caffeoylquinic acid，9）、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯
（3,4-di-O-caffeoylquinic acid methyl ester，10）、断
马钱子酸（secologanic acid，11）、马钱子苷半缩醛
内酯（vogeloside，12）、7-表马钱子苷半缩醛内酯
（7-epi-vogeloside，13）、E-aldosecologanin（14）、
Z-aldosecologanin（15）、5H,8H-pyrano [4,3-d] thiazolo
[3,2-a] pyridine-3-carboxylic acid（16）。所有化合物
均为首次从热毒宁注射液中分离得到，采用观察细
胞病变效应（CPE）和检测细胞存活率的方法[5]对
咖啡酰奎宁酸类化合物进行体外抗呼吸道合胞病毒
（RSV）的活性评价，结果显示该类化合物具有较强
的体外抗 RSV 的效果，其中化合物 1～4 的 EC50
值在 10～30 μmol/L，选择指数（SI）大于 30；化
合物 5～10 的 EC50 值小于 10 μmol/L，SI 大于 100。
1 仪器与材料
Brucker AVANCE400 型核磁共振仪（瑞士
Brucker 公司），Finnigan LCQ Advantage MAX 质谱
仪（美国 Thermo Fisher Scientific 公司），Waters
Snapt G2 mass spectrometer 高分辨质谱仪（美国
Waters 公司），Shimadzu 分析高效液相色谱（日本
Shimadzu 公司，Shimadzu LC-6AD 泵，紫外检测
器），Shimadzu 制备型高效液相色谱（日本 Shimadzu
公司）。分析高效液相色谱柱为 C18 柱（250 mm×
4.6 mm，5 μm，Nacalai Tesque Inc.，日本），制备高
效液相色谱柱为 C18 柱（250 mm×20 mm，5 μm，
Nacalai Tesque Inc.，日本）。薄层硅胶 GF254 和柱色
谱硅胶（青岛海洋化工厂），HP-20 大孔树脂
（Mitsubishi-Chemical，日本），反相 ODS 填料（Merck
公司），Sephadex LH-20 填料（Amersham Biosciences
公司），Toyo-pearl HW-40 填料（Toyo Soda MFG）。
热毒宁注射液（江苏康缘药业股份有限公司生产，
批号 100906）。人喉癌上皮细胞（Hep-2 细胞，中国
科学院武汉病毒所）；呼吸道合胞病毒（RSV，中国
科学院武汉病毒所）。
2 提取与分离
取热毒宁注射液 700 支（10 mL/支），减压回收
溶剂，得热毒宁注射液成品浓缩液 700 g 于 10 倍量
水中，等体积醋酸乙酯和正丁醇分别萃取 3 次，减
压浓缩得到醋酸乙酯萃取物（RDN-E，69.9 g）、正
丁醇萃取物（RDN-B，300 g）和水层（RDN-W，
327 g）。取正丁醇部位 RDN-B（150 g）进行硅胶柱
色谱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱得到 8 个馏份 Fr. 1～
8。Fr. 2 经 Sephadex LH-20（氯仿-甲醇 1∶1）柱色
谱分离得到 2 个馏份 Fr. 2A～2B，Fr. 2B 经过反复
ODS 中低压柱色谱分离，HPLC 制备得到化合物 1
（85 mg）、2（27.7 mg）、3（98 mg）和 4（40 mg）。
Fr. 4～5 经反复硅胶、ODS 和 Sephadex LH-20 柱色
谱以及反相 HPLC 分离得到化合物 5（440.6 mg）、
6（159.2 mg）、7（16.4 mg）、8（28.9 mg）、9（15.6
mg）、10（25.2 mg）、11（6.8 mg）、12（7.9 mg）
和 13（10.1 mg）。Fr. 7 经 Sephadex LH-20 柱色谱分
离，甲醇为流动相除去色素，然后经 ODS 中低压
柱色谱分离，HPLC 制备得到化合物 14（8.9 mg）、
15（9.2 mg）和 16（10.0 mg）。
3 结构鉴定
化合物 1：白色无定形粉末，ESI-MS m/z: 377
[M＋Na]+, 353 [M－H]−，相对分子质量为 354。结合
1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为 C16H18O9，
不饱和度为 8。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.57
(1H, d, J = 16.0 Hz, H-β), 6.27 (1H, d, J = 16.0 Hz,
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H-α), 7.04 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-2′), 6.93 (1H, dd, J =
8.2, 1.9 Hz, H-6′), 6.77 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5′), 2.21
(2H, m, H-2), 4.18 (1H, brs, H-3), 3.74 (1H, dd, J =
8.6, 3.2 Hz, H-4), 5.28 (1H, ddd, J = 9.0, 8.6, 4.4 Hz,
H-5), 2.07 (2H, m, H-6)。以上数据与文献报道一致[6]，
故鉴定化合物 1 为 5-O-咖啡酰奎宁酸。
化合物 2：白色无定形粉末，ESI-MS m/z: 391
[M＋Na]+, 367 [M－H]−，相对分子质量为 368。结
合 1H-NMR和 13C-NMR数据确定分子式为C17H20O9，
不饱和度为 8。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.53
(1H, d, J = 15.8 Hz, H-β), 6.22 (1H, d, J = 15.8 Hz,
H-α), 7.04 (1H, brd, J = 1.9 Hz, H-2′), 6.95 (1H, dd,
J = 8.1, 1.9 Hz, H-6′), 6.78 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5′),
2.21 (2H, m, H-2), 4.14 (1H, ddd, J = 6.4, 3.2, 3.2 Hz,
H-3), 3.72 (1H, dd, J = 7.7, 3.2 Hz, H-4), 5.28 (1H,
ddd, J = 7.7, 7.9, 4.4 Hz, H-5), 2.07 (2H, m, H-6),
3.70 (3H, s, 7-OCH3)。以上数据与文献报道一致[7]，
故鉴定化合物 2 为 5-O-咖啡酰奎宁酸甲酯。
化合物 3：白色无定形粉末，ESI-MS m/z: 377
[M＋Na]+, 353 [M－H]−，相对分子质量为 354。结
合 1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为
C16H18O9，不饱和度为 8。 1H-NMR (400 MHz,
CD3OD) δ: 7.66 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-β), 6.39 (1H,
d, J = 15.8 Hz, H-α), 7.08 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2′),
6.98 (1H, dd, J = 8.1, 1.8 Hz, H-6′), 6.80 (1H, d, J =
8.1 Hz, H-5′), 2.20 (2H, m, H-2), 4.31 (1H, m, H-3),
4.82 (1H, dd, J = 12.0, 3.0 Hz, H-4), 4.31 (1H, m,
H-5), 2.05 (2H, m, H-6)。以上数据与文献报道一致[8]，
故鉴定化合物 3 为 4-O-咖啡酰奎宁酸。
化合物 4：白色无定形粉末，ESI-MS m/z: 391
[M＋Na]+, 367 [M－H]−，相对分子质量为 368。结
合 1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为
C17H20O9，不饱和度为 8。 1H-NMR (400 MHz,
CD3OD) δ: 7.65 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-β), 6.38 (1H,
d, J = 15.9 Hz, H-α), 7.08 (1H, brd, J = 1.8 Hz, H-2′),
6.93 (1H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz, H-6′), 6.80 (1H, d, J =
8.4 Hz, H-5′), 2.21 (2H, m, H-2), 4.29 (1H, m, H-3),
4.84 (1H, overlap, H-4), 5.28 (1H, m, H-5), 2.05 (2H,
m, H-6), 3.76 (3H, 7-OCH3)。以上数据与文献报道一
致[9]，故鉴定化合物 4 为 4-O-咖啡酰奎宁酸甲酯。
化合物 5：淡黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 539
[M＋Na]+, 515 [M－H]−，相对分子质量为 516。结
合 1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为
C25H24O12，不饱和度为 14。1H-NMR (400 MHz,
CD3OD) δ: 7.61 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-3′), 6.32 (1H,
d, J = 16.0 Hz, H-2′), 7.51 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-3″),
6.12 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-2″), 7.02 (2H, d, J = 2.0
Hz, H-5′, 5″), 6.76 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-8′), 6.94 (1H,
dd, J = 8.2, 2.0 Hz, H-9′), 6.77 (1H, d, J = 8.2 Hz,
H-8″), 6.93 (1H, dd, J = 8.2, 2.0 Hz, H-9″), 2.35～
2.11 (2H, m, H-2), 4.38 (1H, td, J = 6.6, 3.3 Hz, H-3),
5.13 (1H, dd, J = 8.8, 1.9 Hz, H-4), 5.56 (1H, m, H-5),
2.38～2.11 (2H, m, H-6)。以上数据与文献报道一
致[10]，故鉴定化合物 5 为 4,5-O-二咖啡酰奎宁酸。
化合物 6：淡黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 529
[M－H]−，提示相对分子质量为 530。结合 1H-NMR
和 13C-NMR 数据确定分子式为 C26H26O12，不饱和
度为 14。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.60 (1H, d,
J = 16.0 Hz, H-3′), 6.30 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-2′),
7.51 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-3″), 6.17 (1H, d, J = 16.0
Hz, H-2″), 7.03 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-5′), 6.76 (1H, d,
J = 8.2 Hz, H-8′), 6.94 (1H, dd, J = 8.2, 2.0 Hz, H-9′),
7.01 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-5″), 6.76 (1H, d, J = 8.2
Hz, H-8″), 6.91 (1H, dd, J = 8.2, 2.0 Hz, H-9″),
2.35～2.11 (4H, m, H-2, 6), 4.35 (1H, td, J = 6.6, 3.3
Hz, H-3), 5.13 (1H, dd, J = 8.2, 2.8 Hz, H-3), 5.56
(1H, dd, J = 14.6, 7.0 Hz, H-5), 3.72 (3H, s, 7-OCH3)。
以上数据与文献报道一致[11]，故鉴定化合物 6 为 4,
5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯。
化合物 7：淡黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 539
[M＋Na]+, 515 [M－H]−，相对分子质量为 516。结
合 1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为
C25H24O12，不饱和度为 14。1H-NMR (400 MHz,
CD3OD) δ: 7.62 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-3′), 6.35 (1H,
d, J = 16.0 Hz, H-2′), 7.58 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-3″),
6.27 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-2″), 7.07 (2H, brd, J = 2.0
Hz, H-5′, 5″), 6.96 (2H, d, J = 8.1 Hz, H-8′, 8″), 6.79
(2H, d, J = 8.0, 1.9 Hz, H-9′, 9″), 2.30 (2H, m, H-2),
5.43 (2H, m, H-3, 5), 3.99 (1H, dd, J = 6.5, 3.2 Hz,
H-4), 2.19 (2H, m, H-6)。以上数据与文献报道一
致[12]，故鉴定化合物 7 为 3,5-O-二咖啡酰奎宁酸。
化合物 8：淡黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 529
[M－H]−，提示相对分子质量为 530。结合 1H-NMR
和 13C-NMR 数据确定分子式为 C26H26O12，不饱和
度为 14。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.61 (1H, d,
J = 15.8 Hz, H-3′), 6.33 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-2′),
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7.54 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-3″), 6.21 (1H, d, J = 16.0
Hz, H-2″), 7.06 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-5′), 6.96 (1H, td,
J = 8.2, 2.0 Hz, H-8′), 6.78 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-9′),
7.05 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-5″), 6.96 (1H, d, J = 8.0
Hz, H-8″), 6.78 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz, H-9″),
2.35～2.27 (2H, m, H-2), 5.39 (1H, td, J = 7.7, 3.3 Hz,
H-3), 3.97 (1H, dd, J = 6.7, 3.3 Hz, H-4), 5.31 (1H, m,
H-5), 2.27～2.12 (2H, m, H-6), 3.69 (3H, s, 7-OCH3)。
以上数据与文献报道一致[13]，故鉴定化合物 8 为 3,
5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯。
化合物 9：淡黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 539
[M＋Na]+, 515 [M－H]−，提示相对分子质量为 516。
结合 1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为
C25H24O12，不饱和度为 14。1H-NMR (400 MHz,
CD3OD) δ: 7.65 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-3′), 6.34 (1H,
d, J = 15.8 Hz, H-2′), 7.58 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-3″),
6.27 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-2″), 7.06 (1H, brd, J = 1.9
Hz, H-5′), 6.96 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-8′), 6.79 (1H, dd,
J = 8.0, 1.9 Hz, H-9′), 7.07 (1H, brd, J = 1.9 Hz,
H-5″), 6.95 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-8′), 6.77 (1H, dd, J =
8.0, 1.9 Hz, H-9′), 2.21 (2H, m, H-2), 5.62 (1H, m,
H-3), 5.03 (1H, dd, J = 8.4, 3.0 Hz, H-4), 4.32 (1H, m,
H-5), 2.21 (1H, m, H-6)。以上数据与文献报道一致[14]，
故鉴定化合物 9 为 3,4-O-二咖啡酰奎宁酸。
化合物 10：淡黄色无定形粉末，ESI-MS m/z:
529 [M－H]−，提示相对分子质量为 530。结合
1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为 C26H26O12，
不饱和度为 14。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.62
(1H, d, J = 15.8 Hz, H-3′), 6.32 (1H, d, J = 15.8 Hz,
H-2′), 7.53 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-3″), 6.21 (1H, d, J =
16.0 Hz, H-2″), 7.06 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-5′), 6.96
(1H, d, J = 8.0 Hz, H-8′), 6.78 (1H, d, J = 8.0, 2.0 Hz,
H-9′), 7.05 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-5″), 6.97 (1H, d, J =
8.0 Hz, H-8″), 6.78 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz, H-9″),
2.31 (2H, m, H-2), 5.62 (1H, m, H-3), 5.02 (1H, dd, J =
8.4, 3.0 Hz, H-4), 4.33 (1H, m, H-5), 2.21 (2H, m, H-6),
3.75 (3H, s, 7-OCH3)。以上数据与文献报道一致[14]，
故鉴定化合物 10 为 3,4-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯。
化合物 11：白色粉末，ESI-MS m/z: 399 [M＋
Na]+, 375 [M－H]−，提示相对分子量为 376。结合
1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为 C16H22O10，
不饱和度为 6。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.44
(1H, brs, H-3), 5.62 (1H, m, H-8), 5.45 (1H, d, J = 3.8
Hz, H-1), 5.23 (1H, m, H-10), 4.64 (1H, d, J = 7.8 Hz,
H-1′), 3.86 (1H, dd, J = 11.9, 1.8 Hz, H-6′), 3.65 (1H,
dd, J = 11.9, 5.6 Hz, H-6′), 3.32 (1H, m, H-5), 2.91
(1H, dd, J = 16.5, 4.9 Hz, H-6), 2.23 (1H, dd, J = 16.5,
8.8 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 168.4
(C-11), 153.4 (C-3), 133.5 (C-8), 120.1 (C-10), 105.3
(C-4), 103.1 (C-7), 100.1 (C-1′), 98.6 (C-1), 78.5
(C-3′), 78.0 (C-5′), 74.7 (C-2′), 71.5 (C-4′), 62.7
(C-6′), 43.5 (C-9), 30.5 (C-6), 23.9 (C-5)。以上数据与
文献报道一致[15]，故鉴定化合物 11 为断马钱子酸。
化合物 12：白色粉末，ESI-MS m/z: 411 [M＋
Na]+, 387 [M－H]−，提示相对分子质量为 388。结
合 1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为
C17H24O10，不饱和度为 6。化合物 12的 1H-NMR (400
MHz, CD3OD）和 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) 与
化合物 11 进行对比，发现化合物 12 仅多出 1 个甲
氧基信号 [3.47 (3H, s, 11-OCH3)]，其余信号基本一
致。化合物 12 的核磁数据与文献报道一致[16]，故
鉴定化合物 12 为马钱子苷半缩醛内酯。
化合物 13：白色粉末，ESI-MS m/z: 411
[M+Na]+, 387 [M－H]−，提示相对分子质量为 388。
结合 1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为
C17H24O10，不饱和度为 6。化合物 13 与化合物 12
具有相同的相对分子质量，其 1H-NMR (400 MHz,
CD3OD) 和 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) 数据非常
相似，结合 1H-1H COSY、HSQC 和 HMBC 谱的信
息，确定化合物 13 与 12 的平面结构相同，进一步
通过与文献报道[16]比对确定了 2 个化合物为 C-7 的
差向异构体，故鉴定化合物 13 为 7-表断氧化马钱
子苷半缩醛内酯。
化合物 14：黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 781
[M＋Na]+, 757 [M－H]−，提示相对分子质量为 758。
结合 1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为
C34H46O19，不饱和度为 12。1H-NMR (400 MHz,
CD3OD) δ: 5.58 (1H, overlap, H-1), 7.55 (1H, brs,
H-3), 3.10 (1H, m, H-5), 2.44 (1H, m, H-6), 3.08 (1H,
m, H-6), 6.72 (1H, t, J = 6.8 Hz, H-7), 5.77 (1H, m,
H-8), 2.77 (1H, brdd, J = 8.8, 5.1 Hz, H-9), 5.28 (1H,
brd, J = 9.9 Hz, H-10), 5.34 (1H, brd, J = 17.2 Hz,
H-10), 3.74 (3H, s, 11-OCH3), 4.70 (1H, d, J = 8.1 Hz,
H-1′), 5.50 (1H, d, J = 3.7 Hz, H-1″), 7.49 (1H, brs,
H-3″), 4.05 (1H, m, H-5″), 9.22 (1H, s, H-7″), 5.58
(1H, m, H-8″), 2.61 (1H, m, H-9″), 5.02 (1H, m,
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 11 期 2015 年 6 月

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H-10″), 5.05 (1H, m, H-10″), 3.54 (3H, s, 11″-OCH3)；
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 97.7 (C-1), 154.4
(C-3), 110.5 (C-4), 33.6 (C-5), 29.8 (C-6), 157.0
(C-7), 135.5 (C-8), 45.4 (C-9), 120.5 (C-10), 169.1
(C-11, 11″), 52.0 (11-OCH3), 100.2 (C-1′), 74.7 (C-2′,
2′′′), 78.2 (C-3′), 71.6 (C-4′, 4′′′), 78.3 (C-5′), 62.8
(C-6′), 97.4 (C-1″), 152.1 (C-3″), 109.4 (C-4″), 31.0
(C-5″), 143.3 (C-6″), 197.0 (C-7″), 135.4 (C-8″), 46.4
(C-9″), 119.4 (C-10″), 51.7 (11″-OCH3), 99.9 (C-1′′′),
78.0 (C-3′′′), 78.4 (C-5′′′), 62.6 (C-6′′′)。以上数据与文献
报道一致[17]，故鉴定化合物 14 为 E-aldosecologanin。
化合物 15：黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 781
[M＋Na]+, 757 [M－H]−，提示相对分子质量为 758。
结合 1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为
C34H46O19，不饱和度为 12。化合物 15 和 14 具有相
同的相对分子质量和分子式，且其 1H-NMR (400
MHz, CD3OD) 和 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) 与
化合物 14 非常相似，仅 7″-CHO (δH 10.03, δC 192.0)
和 C-7 (δH 6.39, δC 150.6）的碳和氢化学位移发生了
明显的变化。结合 1H-1H COSY、HSQC 和 HMBC
谱的信息，确定化合物 15 和 14 具有相同的平面的
结构，2 个化合物是在 C-7, 6″双键上几何构型不同
的同分异构体。将化合物 15 的全部碳氢信号进行
了归属，经过 SciFinder Scholar 网络检索，发现与
文献报道的 Z-aldosecologanin 的数据一致[7]，故鉴
定化合物 15 为 Z-aldosecologanin。
化合物 16：黄色胶状物，ESI-MS m/z: 482 [M＋
Na]+, 917 [2M－H]−，提示相对分子质量为 459。结
合 1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为
C19H25NO10S，不饱和度为 8。1H-NMR (400 MHz,
CD3OD) δ: 5.49 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-1), 7.41 (1H,
brs, H-3), 3.16 (1H, overlap, H-5), 2.17 (1H, m, H-6),
1.50 (1H, m, H-6), 5.00 (1H, m, , H-7), 5.54 (1H, m,
H-8), 2.69 (1H, m, H-9), 5.27 (1H, m, H-10), 3.15 (1H,
m, H-12), 3.34 (1H, m, H-12), 5.11 (1H, m, H-13), 4.67
(1H, d, J = 7.9 Hz, H-1′), 3.46～3.17 (4H, m, H-2′～5′),
3.64 (1H, m, H-6′), 3.85 (1H, m, H-6′)；13C-NMR (100
MHz, CD3OD) δ: 97.9 (C-1), 149.7 (C-3), 107.9 (C-4),
28.4 (C-5), 33.0 (C-6), 62.7 (C-7), 133.6 (C-8), 44.5
(C-9), 120.8 (C-10), 166.2 (C-11), 32.1 (C-12), 63.4
(C-13), 169.7 (C-14), 99.9 (C-1′), 74.7 (C-2′), 78.3
(C-3′), 71.5 (C-4′), 77.9 (C-5′), 62.6 (C-6′)。以上数据与
文献报道一致[18]，故鉴定化合物 16 为 5H,8H-pyrano
[4,3-d] thiazolo [3,2-a] pyridine-3-carboxylic acid。
4 咖啡酰奎宁酸类化合物体外抗 RSV 的活性评价
4.1 细胞毒性检测
实验采用 AlamarBlue®（Invitrogen）试剂盒检
测化合物对细胞的毒性作用。化合物的最高毒性测
试浓度均为 500 μmol/mL。
AlamarBlue®是一种氧化还原指示剂，能根据代
谢活性产生吸光度变化和荧光信号。AlamarBlue®
易溶于水，其氧化形式进入细胞后经线粒体酶还原
产生可测量的荧光及颜色变化，用于细胞活性和细
胞增殖的定量分析以及体外细胞毒性研究。这种测
定是基于具有代谢活性的细胞将试剂转换成荧光和
比色指示剂的能力，受损和无活性细胞具有较低的
代谢活性，对应的信号较低。因此荧光信号强弱可
以反映细胞活性的高低。
将 Hep-2 细胞接种于 96 孔细胞培养板中，细胞
贴壁后备用。用细胞维持液将单体化合物从 2 倍起
始浓度连续 3 倍梯度稀释 6 个梯度，每浓度梯度单
孔检测。实验分为 3 组，样品组加入 Hep-2 细胞＋
化合物，空白对照组加入细胞维持液，细胞对照组
加入 Hep-2 细胞，培养 72 h 后，光镜下观察化合物
引起的细胞病变效应，加入 AlamarBlue®，37 ℃孵
育 2 h，荧光检测 AlamarBlue®的还原情况，激发光
波长 570 nm，发射光波长 595 nm。计算 CC50 值，
结果见表 1。
细胞活力＝(样品组荧光值－空白对照组荧光值)/(细胞
对照组荧光值－空白对照组荧光值)
4.2 对 RSV 的抑制试验
Hep-2 细胞接种于 96 孔细胞培养板中，细胞贴
壁后备用。待细胞长成单层后加入 100 μL 含 2 倍药
物的维持培养基和 100 μL RPMI 1640 培养基稀释
的 RSV 病毒液，37 ℃培养。实验设药物组、细胞
对照组（无病毒感染）、病毒对照组（病毒感染后未
加药物）和阳性药物（利巴韦林）组，每天观察并记
录细胞出现特异性 CPE 情况，培养 5 d 后（病毒对
照孔 75%～100%病变）检测各组细胞活力，检测方
法同“4.1”项。再根据各组的细胞活力值，按公式计
算抑制率，得出 EC50值，结果见表 1。
抑制率＝(药物组细胞活力－病毒对照组细胞活力)/(细
胞对照组细胞活力－病毒对照组细胞活力)
实验结果表明咖啡酰奎宁酸类化合物（1～10）
具有较强的体外抗呼吸道合胞病毒的效果，其中化
合物 1～4 的 EC50 值在 10～30 μmol/L，SI 值大于
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 11 期 2015 年 6 月

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表 1 咖啡酰奎宁酸类化合物体外抗 RSV 实验结果
Table 1 Antiviral experiment results of caffeoylquinic acids
in vitro
化合物 CC50 /(μmol·L−1) EC50 /(μmol·L−1) SI
1 ＞1 000 28.00 ＞35.7
2 ＞1 000 11.33 ＞88
3 ＞1 000 28.07 ＞35
4 ＞1 000 20.06 ＞50
5 ＞1 000 7.76 ＞129
6 ＞1 000 4.13 ＞242
7 ＞1 000 1.69 ＞591
8 ＞1 000 1.72 ＞581
9 ＞1 000 2.12 ＞472
10 687.1 2.40 286
利巴韦林 ＞600 10.03 ＞60
CC50-50%细胞发生病变时的药物浓度；EC50-能够有效抑制 50%细胞
感染病毒的药物浓度；SI＝CC50/EC50
CC50-the median lethal dose of a substance, or the amount required to kill
50% of a given test population; EC50-the molar concentration of an
agonist, which produces 50% of the maximum possible response for that
agonist; SI (selected index) = CC50/EC50
30；化合物 5～10 的 EC50值小于 10 μmol/L，SI 值
大于 100，高于阳性对照药利巴韦林的 SI 值，值得
进一步深入研究该类化合物的抗病毒作用机制。
5 讨论
在前期研究的基础上本研究采用现代化学-药
理学相结合的方法对临床疗效确切、应用广泛的热
毒宁注射液正丁醇萃取部位进行系统的化学成分研
究。综合应用各种色谱分离手段分离鉴定了 16 个化
合物，所有化合物均为首次从热毒宁注射液中分离
得到，并采用观察细胞病变效应（CPE）和检测细
胞存活率的方法，对分离得到的咖啡酰奎宁酸类化
合物进行了体外抗 RSV 作用研究，结果显示该类化
合物具有较强的体外抗 RSV 效果，可能是热毒宁注
射液的主要抗病毒药效物质基础之一。这在一定程
度上揭示了该产品发挥抗病毒作用的物质基础，为探
讨咖啡酰奎宁酸类成分对复方药效的贡献提供了依
据。此部分工作也为后期热毒宁注射液指纹图谱的指
认以及建立与功效相关联的质量控制方法奠定了一
定的基础。
志谢：中国科学院武汉病毒所陈绪林教授课题
组帮助完成单体化合物的体外活性评价工作；暨南
大学药学院中药及天然药物研究所帮助完成核磁和
质谱的测试工作。
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