全 文 ：·1498· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 10 期 2015 年 5 月

毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷对人宫颈癌 HeLa 细胞凋亡及 Bcl-2/Bax 表
达的影响
张冬梅
郑州大学附属郑州中心医院，河南 郑州 450007
摘 要：目的 探讨毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（CG）对宫颈癌细胞系 HeLa 细胞凋亡及 Bcl-2/Bax 表达的影响。方法 体
外培养 HeLa 细胞，分为对照组和实验组，实验组用不同质量浓度的 CG 分别处理 24、48 h，采用 MTT 法测定 CG 对 HeLa
细胞增殖的影响；Hoechst 33258 染色观察细胞凋亡情况；采用流式细胞仪检测细胞凋亡和周期；Western blotting 法检测半
胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-3）、Bcl-2/Bax 蛋白表达情况。结果 CG（2.5～100 μg/mL）能抑制 HeLa 细胞的增殖，呈
剂量和时间依赖性；质量浓度为 20、40、80 μg/mL 的 CG 作用 HeLa 细胞 48 h 后，细胞凋亡率逐渐上升，分别为 10.40%、
25.50%、39.40%，明显高于对照组（1.80%）；实验组 HeLa 细胞 Caspase-3 的活性形式 cleaved Caspase 表达量显著增加；促
凋亡蛋白 Bax 表达量升高，而抗凋亡蛋白 Bcl-2 表达量降低，呈剂量依赖性。结论 CG 能抑制 HeLa 细胞的增殖并诱导其
凋亡，其作用机制可能与增加细胞 Caspase-3 活性、下调 Bcl-2 蛋白的表达及上调 Bax 蛋白有关。
关键词：毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷；HeLa 细胞；凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；Bax；Bcl-2
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670 (2015)10 - 1498 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.10.017
Effects of calycosin-7-O-β-D-glucoside on cell apoptosis in cervical cancer HeLa
cells and expression of Bcl-2/Bax
ZHANG Dong-mei
Zhengzhou Center Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Zhengzhou 450007, China
Abstract: Objective To explore the effect of calycosin-7-O-β-D-glucoside (CG) on apoptosis in cervical cancer HeLa cells and
expression of Bcl-2/Bax. Methods HeLa cells were cultured and divided into two groups, including control group and experimental
group. Cell viabilities were determined by the MTT method; Apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry; The changes of
protein expression of cleaved Caspase-3, Bcl-2, and Bax were detected by Western blotting. Results From the data of MTT, the cell
proliferation of human cervical cancer HeLa cells was inhibited by CG (2.5—100 μg/mL) in a dose- and time-dependent manner. Flow
cytometry assays showed that EGCG significantly induced the apoptosis in HeLa cells. The apoptosis rate of the experimental group were
increased gradually in 48 h after treated with CG (20, 40, and 80 μg/mL), they were 10.40%, 25.50%, and 39.40%, respectively,
significantly higher than those in the control group. The data of Western blotting showed that CG down-regulated Bcl-2 and up-regulated
cleaved Caspase-3 and Bax in a dose-dependent manner. Conclusion CG could inhibit the the proliferation of HeLa cells and promote
apoptosis, and the anticancer effect of CG may be associated with the down-regulation of Bcl-2 expression and up-regulation of Bax
expression, as well as the increase of relative activity of Caspase-3. CG may be a promising antitumor agent for cancer treatment.
Key words: calycosin-7-O-β-D-glucoside; HeLa cells; apoptosis; Caspase-3; Bax; Bcl-2

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，其在全球恶
性肿瘤中发病率高居第 2 位，病死率居第 4 位，
而在发展中国家其发病率和病死率均高居第 2
位，全球每年有超过 25 万患者死于宫颈癌[1]。近
年来，宫颈癌发病率趋于年轻化，严重危害着女
性的健康。宫颈癌患者死亡的主要原因是肿瘤复
发和转移[2-4]。化疗药物在一定程度上能抑制肿瘤
细胞增殖和转移，但传统的化疗药物毒性大且由

收稿日期：2015-02-11
作者简介：张冬梅（1979—），女，主治医师，硕士研究生，现工作于郑州大学附属郑州中心医院妇产科。
Tel: 13523407607 E-mail: 944820307@qq.com
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于肿瘤耐药性，临床上疗效并不理想，且部分
患者难以耐受。因此从天然植物中寻找高效低
毒的具有抗肿瘤活性的成分成为了国内外研究
的热点 [5-7]。
毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷（calycosin-7-O-β-D-
glucoside，CG）是黄芪中的主要活性成分，具有广
泛的药理活性，包括抗肿瘤、降血压、调血脂、降
血糖及抗氧化等[8-10]。迄今发现 CG 能有效地诱导
细胞凋亡和抑制多种癌细胞的生长，但其作用机制
仍未明确。本研究旨在探讨 CG 对宫颈癌 HeLa 细
胞凋亡及 Bcl-2/Bax 表达的影响，以期为临床应用
提供理论研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料
人宫颈癌细胞系 HeLa 细胞购自中国科学院上
海细胞库；CG（质量分数≥95%）购于 Sigma 公司；
胎牛血清购自 Invitrogen 公司；RPMI 1640 培养液
购于杭州四季青生物材料研究所；噻唑蓝（MTT）
试剂盒购于武汉谷歌生物科技有限公司；
AnnexinV/PI 细胞凋亡检测试剂盒购于 Bender 公
司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-3）活性检
测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司；
Bcl-2、Bax 抗体购于美国 Cell Signaling Technology
公司；辣根酶标记兔抗山羊 IgG 购自武汉博士德生
物科技有限公司。
1.2 细胞培养
将 HeLa 细胞培养于含 10%小牛血清、100
U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素的 RPMI 1640 培
养液中，置于 37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱内
培养，取对数生长期细胞用于实验。
1.3 MTT 法检测细胞增殖
取对数生长期的 HeLa 细胞，调整细胞浓度以
1×104/mL 接种于 96 孔板，每孔 200 μL，待细胞贴
壁后分别加入含 CG（终质量浓度为 0、2.5、5.0、
10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、160.0 μg/mL）的培
养液，并设立调零孔。每个质量浓度设 5 个复孔，
继续培养 24、48，于实验结束前 4 h 加入 MTT 试
剂 20 μL/孔，继续孵育 4 h，吸弃上清，加入二甲
基亚砜（DMSO）150 μL/孔，摇床上振荡 10 min，
结晶充分溶解后酶标仪上检测 570 nm 处的吸光度
（A）值，计算细胞存活率。
存活率＝(实验组平均 A 值－调零孔 A 值)/(对照组平均
A 值－调零孔 A 值)
1.4 Hoechst 33258 染色法检测细胞凋亡
分组及加药处理同“1.3”项，CG 终质量浓度
分别为 0、20、40、80 μg/mL。培养 HeLa 细胞 48 h
后，PBS 清洗 1 次，加入 4%多聚甲醛室温固定 15
min，PBS 清洗 2 次，加入 1 mmol/L Hoechst 33258
室温染色 15 min，封片，荧光显微镜（激发波长 365
nm）下观察（×200）细胞核形态。
1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期
将对数生长期细胞以 1×106/mL 浓度接种于 6
孔培养板内，贴壁后分别加入含 CG（终质量浓度
分别为 0、20、40、80 μg/mL）的培养液，培养 48
h 后，收集细胞，离心固定后加入 Annexin V-FITC
和 PI，室温避光染色。筛网滤过后送流式细胞仪进
行细胞凋亡及细胞周期的检测。
1.6 Western blotting 检测 cleaved Caspase-3、
Bcl-2、Bax 蛋白表达
细胞接种及分组同“1.5”项，处理 48 h 后收
集细胞，参照细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书进行操
作，提取细胞总蛋白，并测定蛋白浓度，蛋白样品
加入 1/5 体积的 5×上样缓冲液，沸水煮沸 5 min，
根据蛋白浓度以每孔 20 μg 上样，进行 SDS-聚丙烯
酰胺凝胶电泳，然后电转至 PVDF 膜上，室温封闭
1 h，分别加入 1∶1 000 稀释的兔抗人 Bcl-2、Bax
蛋白，4 ℃过夜。β-actin 作为内参，TBST 洗膜 3
次，加入 1∶1 000 稀释的辣根酶标记的兔抗山羊
IgG，室温孵育 2 h，同样洗膜 3 次，ECL 发光液显
色，观察各条带深浅变化。
1.7 统计学方法
采用 SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析，计
量资料用 ±x s 表示，两组间比较采用 t 检验；多组
间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用
LSD-t 检验。
2 结果
2.1 CG 对 HeLa 细胞活力的影响
CG 处理 24、48 h，质量浓度在 2.5～160.0
μg/mL 内均可抑制 HeLa 细胞活力，且随着 CG 质
量浓度的升高和处理时间的延长，细胞增殖抑制作
用逐渐增强，呈浓度和时间依赖效应。见图 1。
2.2 CG 对 HeLa 细胞凋亡和细胞周期的影响
Hoechst 33258 荧光染色法检测显示，对照组
HeLa 细胞发出微弱的蓝色荧光，细胞核无明显的
形态学改变；CG 处理组 HeLa 细胞核浓缩聚集、碎
裂，核边集，并发出较强的蓝色荧光。结果见图 2。
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图 1 CG 对 HeLa 细胞活力的影响 ( ± = 5x s , n )
Fig. 1 Effect of CG on cell viability of HeLa cells ( ± = 5x s , n )
流式细胞仪检测结果显示，CG 能诱导 HeLa
细胞凋亡。CG（终质量浓度分别为 20、40、80
μg/mL）处理 HeLa 细胞 48 h 后，细胞凋亡率分别
为 10.40%、25.50%、39.40%，明显高于对照组凋
亡率（1.2%）。见图 3 和表 1。
与对照组比较，CG 处理的细胞 G0/G1 期细胞
比例增高，S 期细胞比例减少（P＜0.05），进一步
说明 CG 处理后 HeLa 细胞的分裂和增殖受到抑制，
而早期凋亡率增加。见表 1。


对照 CG 20 μg·mL−1 CG 40 μg·mL−1 CG 80 μg·mL−1
图 2 CG 对 HeLa 细胞凋亡的影响 (Hoechst 33258 染色)
Fig. 2 Effect of CG on apoptosis of HeLa cells (Hoechst 33258 staining)
对照 CG 20 μg·mL−1 CG 40 μg·mL−1 CG 80 μg·mL−1


图 3 CG 诱导 HeLa 细胞早期凋亡
Fig. 3 CG-induced early apoptosis of HeLa cells
表 1 各组细胞的凋亡率及细胞周期 ( ± = 5x s , n )
Table 1 Apoptosis rate and cell cycle in each group ( ± = 5x s , n )
组别 ρ/(μg·mL−1) 细胞凋亡率/%
细胞周期/%
G0/G1 S G2/M
对照 0 1.80±0.05 50.52±0.71 37.12±0.88 12.46±0.66
CG 20 10.40±0.24* 54.62±0.99 35.26±0.58 10.12±0.54
40 25.50±0.18* 59.10±0.67* 33.51±0.62* 7.39±0.77*
80 39.40±0.48* 67.25±0.93* 26.93±0.57* 5.82±0.51*
与对照组比较：*P＜0.05
*P < 0.05 vs control group
2.3 CG 对 HeLa 细胞 cleaved Caspase-3、Bcl-2
和 Bax 表达量的影响
对照组 HeLa 细胞中 cleaved Caspase-3 几乎没
有表达，实验组（CG 终质量浓度分别为 20、40、
80 μg/mL）处理 HeLa 细胞 48 h 后，HeLa 细胞
cleaved Caspase-3 表达量浓度依赖性地增加。
CG 处理 HeLa 细胞 48 h 后，结果显示随着 CG
质量浓度的升高，促凋亡蛋白 Bax 的表达量也逐渐
升高，而抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达量逐渐降低。结
果见图 4。
细
胞
存
活
率
/%

100
80
60
40
20
0 0 40 80 120 160
CG/(μg·mL−1)
24 h
48 h
Annexin V-FITC
104
103
102
101
100
100 101 102 103 104
PI

PI

PI
PI

104
103
102
101
100
104
103
102
101
100
104
103
102
101
100
100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104
1.20% 10.40% 25.50% 39.40%
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图 4 CG 对 HeLa 细胞中 Caspase-3、Bax 及 Bcl-2 表达量
的影响 ( ± = 5x s , n )
Fig. 4 Effects of CG on intracellular expression levels of
Caspase-3, Bax, and Bcl-2 ( ± = 5x s , n )
3 讨论
宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，是全球妇
女中发病率仅次于乳腺癌而占第 2 位的恶性肿瘤，
主要治疗手段包括外科手术、放疗和化疗，寻找和
研制高效低毒的治疗宫颈癌的药物仍然是当前宫
颈癌研究工作的热点。中药可以减轻放化疗的副反
应，提高癌症患者的生活质量，延长患者的生存期。
因此，中药因其安全性及副作用少等特点已成为肿
瘤医学的研究热点之一[11]。
细胞凋亡是多细胞机体维持内环境稳定的重
要自我调节机制，细胞凋亡与细胞增殖之间的平衡
在肿瘤发生发展中具有重要意义，细胞凋亡是程序
化、多基因调控的细胞死亡过程，通过诱导细胞凋
亡可能是肿瘤治疗最有效的途径之一，因此促进细
胞凋亡已经成为抗肿瘤研究的热点[12-13]。本研究发
现 CG 在 2.5～160 μg/mL 均能抑制人宫颈癌 HeLa
细胞的增殖，且呈现明显的剂量依赖及时间依赖效
应。Hoechst 33258 染色常用于细胞凋亡检测，染色
后活细胞呈弥散均匀荧光，出现细胞凋亡时，细胞
核或细胞质内可见浓染致密的颗粒状荧光。本实验
发现，不同质量浓度 CG 处理 HeLa 细胞 48 h 后，
细胞核荧光强度逐渐增强，显示出细胞出现凋亡现
象。流式细胞仪检测结果同样显示，CG 处理 HeLa
细胞 48 h 后可诱导凋亡，且随着药物质量浓度的升
高细胞凋亡率亦增加，呈浓度依赖效应。细胞凋亡
研究认为，Caspase 家族蛋白的激活在细胞凋亡过
程中起了关键性作用，被认为是诱发凋亡的直接效
应物。已发现的 Caspase 家族有 10 余种，其中
Caspase-3 是该家族的重要成员，是细胞凋亡过程中
的关键酶。本研究发现，CG 呈浓度依赖性地增加
HeLa 细 胞 中 Caspase-3 的 活 性 形 式 cleaved
Caspase-3 的表达量，提示 CG 能抑制细胞增殖，并
可能是通过增强细胞 Caspase-3 活性从而促进细胞
凋亡。
为进一步探讨 CG 诱导细胞凋亡，本研究检测
Bcl-2、Bax 蛋白表达的变化，研究发现不同质量浓
度 CG 处理后，HeLa 细胞 Bcl-2 表达下调，Bax 表
达上调。Bcl-2 是一种内膜蛋白，主要存在于线粒
体、内质网和核膜上，Bcl-2 在多种肿瘤细胞中表
达，能通过增强线粒体膜电位，抑制钙离子释放，
阻止核酸内切酶活化，进而发挥抗凋亡作用；Bax
属于 Bcl-2 家族成员，其作用与 Bcl-2 相反，可直
接激活死亡效应因子 Caspase 或改变细胞膜通透性
引起细胞色素 C 释放某些离子和小分子通过细胞
膜，进而促进细胞凋亡。细胞 Bcl-2 和 Bax 比例改
变可调节细胞凋亡[14]，当 Bcl-2 占优势时，细胞具
有抗凋亡作用；相反，当 Bax 过表达时，细胞容易
在诱导剂作用下发生凋亡[15]。
综上所述，CG 可抑制 HeLa 细胞增殖并诱导细
胞凋亡，其诱导细胞凋亡机制可能是通过上调 Bax
蛋白表达并下调 Bcl-2 蛋白表达，增加细胞
Caspase-3 活性。本研究为宫颈癌治疗所需的新的化
疗试剂或其类似物的发现提供了信息。随着肿瘤发
生和发展的分子机制的阐明，肿瘤细胞和正常细胞
的区别将会更加明确，利用生物技术找到肿瘤治疗
的新突破口是非常值得深入研究的。
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Caspase-3
cleaved Caspase-3
Bax
Bcl-2
β-actin
对照 20 40 80
CG/(μg·mL−1)
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