全 文 ：·2036· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 14 期 2014 年 7 月

基于斑马鱼模型的朝鲜淫羊藿抗骨质疏松活性部位筛选
詹 扬 1, 2，韦英杰 1, 2*，孙 娥 1，王丹丹 1, 2，景莉君 1，贾晓斌 1
1. 中国中医科学院江苏分院，江苏省中医药研究院，国家中医药管理局中药口服释药系统重点研究室，江苏 南京 210028
2. 江苏大学药学院，江苏 镇江 212013
摘 要：目的 利用泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型筛选朝鲜淫羊藿抗骨质疏松活性部位，探讨斑马鱼骨质疏松模型的
适用性与合理性。方法 将受精后4 d的斑马鱼幼鱼暴露在25 μmol/L泼尼松龙模型药物组，含25 μmol/L泼尼松龙的15 μg/mL
依替膦酸二钠阳性药物组，0.5% DMSO 溶媒对照组、含 25 μmol/L 泼尼松龙的朝鲜淫羊藿总提物（生药 0.1、1.0、10.0、100.0
μg/mL）及其大孔树脂水及 30%、50%、70%、90%乙醇洗脱部位（生药 1.0、10.0、100.0、1 000.0 μg/mL）溶液组，28.5 ℃
下在 24 孔板中培养，每天换液至第 9 天处死。采用茜素红对各组斑马鱼幼鱼骨骼染色，并以显微检测、数码成像方法定量
分析骨骼染色区域。结果 与对照组相比，模型组斑马鱼头部骨骼染色面积和染色光密度值显著减少；与模型组比较，除朝
鲜淫羊藿大孔树脂水洗脱部位外，朝鲜淫羊藿总提物及 30%、50%、70%、90%乙醇洗脱部位的斑马鱼头部骨骼染色面积和
染色光密度值显著增加。色谱分析表明 30%、50%、70%、90%乙醇分离部位主要含黄酮类成分和少量非黄酮类化合物。结
论 斑马鱼骨质疏松模型成功用于高效筛选朝鲜淫羊藿的抗骨质疏松活性部位，具简单、高效及可操作性强的优势。
关键词：斑马鱼；骨质疏松；朝鲜淫羊藿；活性部位；筛选
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)14 - 2036 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.14.015
Screening on antiosteoporotic active parts of Epimedium koreanum based on
zebrafish model
ZHAN Yang1, 2, WEI Ying-jie1, 2, SUN E1, WANG Dan-dan1, 2, JING Li-jun1, JIA Xiao-bin1
1. Key Laboratory of Oral Drug Delivery System of Chinese Meteria Medica, State Administration of Traditional Chinese
Medicine, Jiangsu Branch of China Academy of Chinese Medical Science, Nanjing 210028, China
2. Department of Pharmaceutics, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China
Abstract: Objective Prednisolone-induced osteoporosis model using zebrafish was used to screen the antiosteoporotic active parts of
Epimedium koreanum, and to investigate the applicability and rationality of the zebrafish model of osteoporosis. Methods Zebrafish
larva at 4 d post fertilization were exposed with 25 μmol/L prednisolone (model group), 15 μg/mL etidronate disodium with 25 μmol/L
prednisolone (positive group), 0.5% DMSO (vehicle control group), E. koreanum extracts (crude drug 0.1, 1.0, 10.0, and 100.0 μg /mL)
with 25 μmol/L prednisolone, and their water and 30%, 50%, 70%, and 90% ethanol elution parts of macroporous resin (crude drug
1.0, 10.0, 100.0, and 1 000.0 μg/mL). All groups were incubated in 24-well plates (28.5 ℃) for 9 d until execution, and then zebrafish
skeleton was anesthetized and fixed for staining with alizarin red. Quantitative analysis of the stained area was performed by
microscopic inspection and digital imaging methods to reflect the amount of zebrafish head skeleton mineralization. Results The head
skeleton mineral area and integrated optical density (IOD) of 25 μmol/L prednisolone model group were significantly decreased when
compared with vehicle control group, and E. koreanum extract and its 30%, 50%, 70%, and 90% ethanol elution parts of macroporous
resin could rescue the further bone loss of zebrafish induced by prednisolone when compared with model group. HPLC analysis
indicated that the components of 30%, 50%, 70%, and 90% ethanol elution parts of macroporous resin mainly included flavonoids and
minor nonflavonoids components. Conclusion This novel osteoporosis zebrafish model is successfully used to screen the
antiosteoporotic active parts of E. koreanum, which has the advantages of simplity, high efficiency, and easy to perform.
Key words: zebrafish; osteoporosis; Epimedium koreanum Nakai; bioactive parts; screening

收稿日期：2013-10-10
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30973978，81274088）；江苏省自然科学基金资助项目（BK2011866，BK20141507，BK2011866）；
江苏省第十批“六大人才高峰”（2013-YY006）
作者简介：詹 扬（1989—），女，硕士研究生。Tel: 15905168720 E-mail: ZY20071101@163.com
*通信作者 韦英杰（1970—），女，博士，研究员，硕士生导师，主要从事中药物质基础与质量控制研究。Tel: (025)85637809 E-mail: wyj970@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 14 期 2014 年 7 月 ·2037·

我国拥有丰富、种类繁多的壮骨中药资源，中
药成分相比化学药副作用小，但其具有复杂的药用
形式，除单体化合物外，有效部位、提取物等均为
由大量化学成分构成的复杂成分体系，为壮骨中药
药效筛选带来了很多困难。斑马鱼与哺乳动物骨骼
生长发育的分子机制高度相似，而且近年来越来越
多的调节哺乳动物骨骼发育关键基因的同源基因
在斑马鱼基因组中被发现[1]，为建立斑马鱼骨质疏
松、骨关节炎等模型提供了生理及遗传学依据[2-3]。
本课题组用地塞米松和泼尼松龙诱导并建立斑马
鱼骨质疏松模型，并用其验证依替膦酸二钠
（etidronate disodium，Eti）、鲑鱼降钙素的抗骨质疏
松活性[4-5]。该模型具有在体化、微板化，简单、高
效的特点，其能否有效用于中药抗骨质疏松活性筛
选，相关实验支持具有重要意义。
淫羊藿 Epimedii Folium 是一种传统知名的补肾
壮骨中药，现代研究表明其对骨质疏松症的防治疗
效确切，其中淫羊藿黄酮类成分是主要壮骨成分[6-8]。
本研究选择朝鲜淫羊藿为代表中药，以泼尼松龙诱
导的斑马鱼骨质疏松模型评价朝鲜淫羊藿提取物
及其大孔树脂分离不同部位的抗骨质疏松活性，以
探讨该模型用于中药抗骨质疏松活性筛选的合理
性与适用性。
1 材料与仪器
朝鲜淫羊藿（亳州市千草药业饮片厂提供，批
号 20080829），经南京中医药大学吴德康教授鉴定
为朝鲜淫羊藿 Epimedium koreanum Nakai 的干燥
叶；淫羊藿苷（中国食品药品检定研究院，批号
110737-200415）；朝藿定 A、B、C 和宝藿苷 I（自
制[9-10]，经 HPLC 检测质量分数均≥98%）；泼尼松
龙（苏州亚科化学试剂股份有限公司，批号
YK2012020101）；依替膦酸二钠（中国食品药品检
定研究院，批号 101174-201001）；二甲基亚砜
（DMSO，国药集团化学试剂有限公司，批号
20120331）；多聚甲醛（成都市科龙化工试剂厂，
批号 20100504）；间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐
（MS-222，Acros Organics，批号 A0288328）；茜素
红 S （郑州四季化工产品有限公司，批号
Sj20110806）；D-101 大孔吸附树脂（天津农药股份
有限公司树脂分公司）；水为 Milli-Q system 高纯水
（Millipore，Bedford，MA，美国）；乙腈为色谱纯
（德国 Merck 公司），其余试剂均为分析纯。
ZEISS 荧光倒置显微镜 AxioVision Rel 4.8（蔡
司光学仪器国际贸易有限公司）；生化培养箱 SPX—
80（宁波海曙赛褔实验仪器厂）；Image Pro Plus 6.0
专业图像分析软件（美国 Media Cybernetics 公司）；
Agilent 1100 型系列高效液相色谱仪（美国安捷伦
公司）。
斑马鱼成鱼由南京大学模式动物研究所提供，
来自德国 tuebingen 品系。
2 方法
2.1 药物溶液的配制
2 500 μmol/L 泼尼松龙储备液配制：精密称取泼
尼松龙 9.13 mg，加入 DMSO 1.5 mL，用培养基[4]
稀释并定容至 10 mL，即得。
25 μmol/L 泼尼松龙溶液配制：取 2 500 μmol/L
泼尼松龙储备液 0.5 mL，加入适量 DMSO 后，用
培养基稀释并定容至 50 mL，得 25 μmol/L 泼尼松
龙溶液。
朝鲜淫羊藿总提取物（以下简称总提物）：称
取朝鲜淫羊藿药材 100 g，用 80%乙醇提取 2 次，
每次 3 h，滤过合并提取液，回收乙醇并浓缩至 100
mL，即得到生药 1 g/mL 总提物，备用。临用前配
制成含 25 μmol/L 泼尼松龙的生药 0.1、1.0、10.0、
100.0 μg/mL 的总提物溶液，各溶液均含 0.5%
DMSO。
总提物的大孔树脂分离部位（以下简称分离部
位）制备：取适量 D-101 树脂装柱，先用 95%乙醇
冲洗，再用纯水冲洗至无醇味，上样 5 mL 总提物
（相当于 5 g 生药），依次用水及 30%、50%、70%、
90%乙醇洗脱，每个梯度冲 5 个柱体积，分别接收
各部分的溶液，浓缩至无醇味。临用前，将水及
30%、50%、70%、90%乙醇洗脱部位分别用培养基
配制成含 25 μmol/L 泼尼松龙的 1.0、10.0、100.0、
1 000.0 μg/mL 溶液（质量浓度以生药计），各溶液
均含 0.5% DMSO。
2.2 总提物及分离部位的色谱分析
色谱条件：Zorbax Extend-C18色谱柱（250 mm×
4.6 mm，5 μm，Agilent）和 C18 预柱（12.5 mm×
4.6mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-水（B），梯
度洗脱程序：0～10 min，10%～23% A；10～35 min
23%～26% A；35～65 min，26%～48% A；65～80
min，48%～80% A；80～85 min，80%～100% A；
85～90 min，100% A；进样量 20 μL；柱温 25 ℃；
体积流量 1.0 mL/min；检测波长 272 nm；运行时间
90 min。
·2038· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 14 期 2014 年 7 月

总提物及分离部位供试液：取“2.1”项下 1.0
g/mL 的总提物适量以及水和 30%、50%、70%、
90%乙醇分离部位，用 90%甲醇分别配制成相当
于生药 0.01 g/mL 的供试液，进样 20 μL 进行色谱
分析。
2.3 朝鲜淫羊藿对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏
松防治作用
取受精后 4 d 斑马鱼幼鱼置 24 孔板，随机分为
对照组（0.5% DMSO），泼尼松龙（25 μmol/L）模
型组，含 25 μmol/L 泼尼松龙的依替膦酸二钠阳性
对照组，含 25 μmol/L 泼尼松龙的总提物（生药 0.1、
1.0、10.0、100.0 μg/mL）组，含 25 μmol/L 泼尼松
龙的水和 30%、50%、70%、90%乙醇分离部位（生
药 1.0、10.0、100.0、1 000.0 μg/mL）组，每组设 3
个孔，每孔 6 条幼鱼。28.5 ℃恒温培养，每天换药，
培养至受精后 9 d，将各组斑马鱼用 MS-222 麻醉处
死，多聚甲醛固定后进行茜素红染色，用 ZEISS 荧
光倒置显微镜采集图像，用专业图像处理软件
Image Pro Plus 6.0 计算骨骼染色面积和累积光密
度，进行骨矿化定量分析。
2.4 数据分析
统计分析应用 SPSS 16.0 软件，数据以 ±x s 表
示，采用 One-Way ANOVA 分析。各组间两两比较
采用 LSD 法，P＜0.05 为有统计学差异。
3 结果与分析
3.1 HPLC 色谱分析结果
总提物及分离部位的 HPLC 色谱图见图 1。根
据已知文献结合部分对照品对照[11-12]，推测 30%乙
醇部位以非黄酮类成分为主，如木脂素类及 9, 10-
二氢菲类成分，50%乙醇洗脱部位以二糖和三糖的
黄酮苷类成分为主，如朝藿定 A、朝藿定 B、朝藿
定 C 和淫羊藿苷，70%乙醇部位以单糖和二糖的黄
酮苷类为主，如宝藿苷 I，90%乙醇部位则以单糖的
黄酮苷类为主。
3.2 总提物对泼尼松龙诱导斑马鱼骨质疏松的防
治作用
各组受精后 9 d 斑马鱼的腹面头骨茜素红染色
的显微成像图见图 2。从图中可以看出模型组较对
照组斑马鱼头骨茜素红染色矿化面积显著减少，说
明泼尼松龙成功诱导斑马鱼骨质疏松；依替膦酸二
钠组较模型组斑马鱼头骨茜素红染色矿化面积显
著增多，依替膦酸二钠作为阳性药物可对抗泼尼松
龙诱导的斑马鱼骨质疏松。



1-朝藿定 A 2-朝藿定 B 3-朝藿定 C 4-淫羊藿苷 5-宝藿苷 I
1-epimendin A 2-epimendin B 3-epimendin C 4-icariin
5-baohuoside I
图 1 朝鲜淫羊藿总提物及分离部位 HPLC 色谱图
Fig. 1 HPLC of total extract and parts from E. koreanum
总提物组斑马鱼头骨茜素红染色矿化面积与
模型组比较相对增加。由定量分析结果（图 3）可
见，与模型组比较，总提物 100.0 μg/mL 时，斑马
鱼头骨染色面积之和及累积光密度显著升高（P＜
0.05），提示 100.0 μg/mL 总提物可对抗泼尼松龙诱
导的斑马鱼骨质疏松。
3.3 分离部位对泼尼松龙诱导斑马鱼骨质疏松的
防治作用
从图 2 中可以看出除水分离部位组外，30%、
50%、70%、90%乙醇分离部位组斑马鱼头骨矿化
面积及累积光密度较模型组相对增加。
各组斑马鱼受精后 9 d 腹面头骨茜素红染色的
矿化面积之和及累积光密度值见图 3。可以看出 30%
乙醇部位 1.0 μg/mL 组的累积光密度值、50%乙醇部
位 10.0、1 000.0 μg/mL 组矿化面积之和及累积光密
度值、70%乙醇部位 100.0 μg/mL 组矿化面积之和及
累积光密度值、90%乙醇部位 100.0 μg/mL 组矿化面
积之和及累积光密度值与模型组相比具有显著性差
异（P＜0.05）；30%乙醇部位 10.0 μg/mL 组的累积
光密度值、50%乙醇部位 100.0 μg/mL 组矿化面积之
和及累积光密度值、70%乙醇部位 10.0 μg/mL 组矿
化面积之和及累积光密度值、90%乙醇部位 1 000.0
μg/mL 组矿化面积之和及累积光密度值与模型组相
比具有极显著性差异（P＜0.01、0.001）。结果提示
除了水洗部位外，30%、50%、70%、90%乙醇分离
部位均可阻止泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松。
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
t / min
21 3
1
4
5
2
3
4
5
5
总提物
水分离部位
30%乙醇部位
90%乙醇部位
50%乙醇部位
70%乙醇部位
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 14 期 2014 年 7 月 ·2039·



对照 模型 依替膦酸二钠

0.1 μg·mL−1 1.0 μg·mL−1 10.0 μg·mL−1 100.0 μg·mL−1

1.0 μg·mL−1 10.0 μg·mL−1 100.0 μg·mL−1 1 000.0 μg·mL−1

1.0 μg·mL−1 10.0 μg·mL−1 100.0 μg·mL−1 1 000.0 μg·mL−1

1.0 μg·mL−1 10.0 μg·mL−1 100.0 μg·mL−1 1 000.0 μg·mL−1

1.0 μg·mL−1 10.0 μg·mL−1 100.0 μg·mL−1 1 000.0 μg·mL−1

1.0 μg·mL−1 10.0 μg·mL−1 100.0 μg·mL−1 1 000.0 μg·mL−1
图 2 各组受精后 9 d 斑马鱼幼鱼的腹面头骨茜素红染色的显微成像图
Fig. 2 Whole-mount preparations of ventral skull of zebrafish larva at 9 d post fertilization by alizarin red staining
总提物
水分离部位
30%乙醇部位
50%乙醇部位
70%乙醇部位
90%乙醇部位
·2040· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 14 期 2014 年 7 月














与对照组比较：###P＜0.001；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001
###P < 0.001 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs prednisolone group
图 3 朝鲜淫羊藿总提物和分离部位对斑马鱼幼鱼头骨茜素红染色面积之和及累积光密度的影响 ( ± = 5x s n, )
Fig. 3 Effect of total extract and separate fractions of E. koreanum on alizarin red staining area and integrated
optical density of zebrafish larvae skull ( ± = 5x s n, )
4 讨论
本实验以前期研究[5]为基础，用 25 μmol/L 泼
尼松龙诱导斑马鱼骨质疏松。并用该模型评价了传
统壮骨中药朝鲜淫羊藿总提物的抗骨质疏松活性，
结果与现有大鼠骨质疏松模型和细胞模型报道的
结论具一致性[13-14]；在此基础上，进一步应用该模
型评价了朝鲜淫羊藿总提物的大孔树脂分离不同
部位的抗骨质疏松活性，结果表明，除了水洗脱部
位无活性外，30%、50%、70%、90%乙醇分离部位
均有一定的抗骨质疏松活性，30%乙醇部位以非黄
矿
化
面
积
/
(×
10
5 )
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
矿
化
面
积
/
(×
10
5 )
矿
化
面
积
/
(×
10
5 )
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
对照 模型 0.1 1.0 10.0 100.0
总提物 / (μg·mL−1)
对照 模型 1.0 10.0 100.0 1 000.0
水分离部位 / (μg·mL−1)
对照 模型 1.0 10.0 100.0 1 000.0
30%乙醇部位 / (μg·mL−1)
矿
化
面
积
/
(×
10
5 )
矿
化
面
积
/
(×
10
5 )
矿
化
面
积
/
(×
10
5 )
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0对照 模型 1.0 10.0 100.0 1 000.0
50%乙醇部位 / (μg·mL−1)
对照 模型 1.0 10.0 100.0 1 000.0
70%乙醇部位 / (μg·mL−1)
对照 模型 1.0 10.0 100.0 1 000.0
90%乙醇部位 / (μg·mL−1)
累
积
光
密
度
/
(×
10
5 )

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0累
积
光
密
度
/
(×
10
5 )

累
积
光
密
度
/
(×
10
5 )

对照 模型 0.1 1.0 10.0 100.0
总提物 / (μg·mL−1)
对照 模型 1.0 10.0 100.0 1 000.0
水分离部位 / (μg·mL−1)
对照 模型 1.0 10.0 100.0 1 000.0
30%乙醇部位 / (μg·mL−1)
对照 模型 1.0 10.0 100.0 1 000.0
50%乙醇部位 / (μg·mL−1)
对照 模型 1.0 10.0 100.0 1 000.0
70%乙醇部位 / (μg·mL−1)
对照 模型 1.0 10.0 100.0 1 000.0
90%乙醇部位 / (μg·mL−1)
累
积
光
密
度
/
(×
10
5 )

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
累
积
光
密
度
/
(×
10
5 )

累
积
光
密
度
/
(×
10
5 )

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
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中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 14 期 2014 年 7 月 ·2041·

酮类成分为主，50%、70%、90%乙醇分离部位主
要含黄酮类成分，提示朝鲜淫羊藿抗骨质疏松活性
成分主要为黄酮类成分，尚含其他如木脂素类及 9,
10-二氢菲类等少量成分，这与最新的朝鲜淫羊藿活
性部位筛选报道结论具一致性[15]，说明斑马鱼模型
用于中药抗骨质疏松活性筛选具可行性与合理性。
目前，利用斑马鱼作为整体动物药效筛选模
型已成为斑马鱼研究的热点之一。斑马鱼幼鱼骨
骼发育具有骨形成和骨吸收的完整体系，用泼尼
松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型实现在体化、微
板化。该模型克服传统哺乳动物骨质疏松模型耗
时长、效率差、灵敏度低、用药量大的缺陷，避
免原代骨细胞模型条件苛刻度，操作复杂，作用
环节单一等不足，为抗骨质疏松中药的活性筛选
提供简单、高效新方法。
参考文献
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