全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 6 期 2013 年 3 月

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HPLC 法同时测定不同产地蟾酥中的 5 种活性成分
刘小英，刘 昕，陈笑天，刘 波，王少军，赖学文，李 斌*
江西中医学院，江西 南昌 330004
摘 要：目的 建立了同时测定蟾酥中活性成分的 HPLC 方法，并对 5 个不同产地的药材中 5 种活性成分进行测定。方法
采用 HPLC 法测定，色谱柱为 Hypersil ODS 柱（250 mm×4.6 mm，25 μm），流动相为醇-水（50∶50），检测波长 296 nm，
柱温 30 ℃，体积流量 1 mL/min，并在此色谱条件下测定不同产地经 60%甲醇回流提取的蟾酥样品中活性成分的量。结果 各
成分的质量浓度和峰面积具有良好的线性关系，且有很好的分离度。日蟾毒它灵、蟾毒灵、沙毒精、华蟾酥毒基、脂蟾毒配
基平均回收率为 99.9%、99.6%、97.9%、96.7%、99.5%，RSD 为 2.8%、3.2%、1.9%、1.0%、3.4%。不同产地蟾酥样品的
HPLC 色谱图差别明显，所含成分的种类和质量分数差异较大。结论 本方法简便、灵敏度高，具有实用性，可作为蟾酥药
材的质量控制方法。
关键词：蟾酥；高效液相色谱；日蟾毒它灵；蟾毒灵；沙毒精；华蟾酥毒基；脂蟾毒配基
中图分类号：R286.022 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)06 - 0760 - 03
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.06.024
Determination of five active components in Venenum Bufonis from different
habitats by HPLC
LIU Xiao-ying, LIU Xin, CHEN Xiao-tian, LIU Bo, WANG Shao-jun, LAI Xue-wen, LI Bin
Jiangxi University of Traditional Chinese Medicines, Nanchang 330004, China
Key words: Venenum Bufonis; HPLC; gamabufalin; bufalin; arenobufagin; cinobufagin; resibufogenin

蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍 Bufo bufo
gargarizans Cantor 或黑眶蟾蜍 B. melanostictus
Schneider 的干燥分泌物，其活性成分有甾体化合
物、吲哚系生物碱等，具有解毒、止痛、开窍醒神
的功能，是传统中药材[1]。现代研究表明，生物碱
具有抗肿瘤作用，对结肠癌、肝癌、胰腺癌等多种
癌症有抑制作用，多用于中药成方制剂中。近些年，
已有学者采用紫外分光光度法[1]、薄层色谱法[2]、
高效液相色谱法[3-4]对蟾酥定量分析，但未见报道采
用高效液相色谱法同时测定蟾酥药材中日蟾毒它
灵、蟾毒灵、沙毒精、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基 5
种活性成分的方法，本实验建立了同时测定该 5 种
活性成分的的 HPLC 方法，并比较了安徽等 5 个不
同产地蟾酥样品中各成分量的差异。
1 仪器与材料
Agilent 1100 高效液相色谱仪，Hypersil ODS
（250 mm×4.6 mm，25 μm）色谱柱；日蟾毒它灵、
蟾毒灵和沙毒精购自江西本草天工科技有限公司，
质量分数≥98%，批号分别为 1057-100527、1044-
100412、0928-10029；华蟾酥毒基和脂蟾毒配基对
照品购自中国食品药品检定研究院，批号分别为
110803-200605 、 110718-0925 ； 黑 眶蟾 蜍 Bufo
Melanostictus Schneider 样品产自安徽，北京，江苏，
山东济南、临沂，由江西中医学院赖学文副教授鉴
定；甲醇为色谱纯；超纯水，其他试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 方法学考察
2.1.1 色谱条件 色谱柱为 Hypersil ODS（250 mm×
4.6 mm，25 μm），流动相为甲醇-水（50∶50），柱
温 30 ℃，检测波长 296 nm，体积流量 1 mL/min。
日蟾毒它灵、蟾毒灵、沙毒精、华蟾酥毒基、脂蟾
毒配基之间分离度以及与其他成分的分离度均大
于 1.5。理论塔板数均大于 3 000。色谱图见图 1。
2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取日蟾毒它

收稿日期：2012-06-14
作者简介：刘小英（1988—），女，江西吉安人，硕士研究生，从事中药活性成分研究。Tel: 15970489511 E-mail: yingzi8768@sina.com
*通信作者 李 斌 Tel: (0791)87118825 E-mail: libin7077@hotmail.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 6 期 2013 年 3 月

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1-日蟾毒它灵 2-蟾毒灵 3-沙毒精 4-华蟾酥毒基 5-脂蟾毒配基
1-gamabufalin 2-bufalin 3-arenobufagin 4-cinobufagin 5-resibufogenin
图 1 对照品 (A) 和不同产地蟾酥样品 (B) HPLC 图
Fig. 1 HPLC chromatograms of reference substances (A) and Venenum Bufonis samples from different habitats (B)

灵、蟾毒灵、沙毒精、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基 5
个对照品适量，加甲醇制成质量浓度均为 0.1
mg/mL 的对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备 取购买的蟾酥成品细
粉约 25 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加
甲醇 20 mL，称定质量，置水浴上加热回流提取 1 h，
放冷，补足甲醇减失的质量，摇匀，滤过，取续滤
液作为供试品溶液。
2.1.4 线性关系考察 精密吸取 0.109 mg/mL 日蟾
毒它灵、0.108 mg/mL 蟾毒灵、0.101 mg/mL 沙毒精、
0.114 mg/mL 华蟾酥毒基、0.112 mg/mL 脂蟾毒配基
的对照品溶液 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分别
置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀，分别
精密吸取 10 μL，注入高效液相色谱仪，测定。分
别以对照品进样量为横坐标（X），峰面积积分值为
纵坐标（Y），绘制标准曲线。回归方程：日蟾毒它
灵 Y＝456.62 X－283.94，r＝0.999 0；蟾毒灵 Y＝
161.81 X＋17.65，r＝0.999 5；沙毒精 Y＝436.34 X－
34.16，r＝0.999 2；华蟾酥毒基 Y＝1 025.6 X－5.14，
r＝0.999 8；脂蟾毒配基 Y＝415.93 X－76.81，r＝
0.999 1。结果表明，日蟾毒它灵在 0.218～1.090 μg，
蟾毒灵在 0.216～1.080 μg，沙毒精在 0.202～1.010
μg，华蟾酥毒基在 0.228～1.140 μg，脂蟾毒配基在
0.224～1.120 μg 线性关系良好。
2.1.5 稳定性试验 精密吸取“2.1.3”项下的同一
样品溶液，室温下分别在 0、2、4、8、10、24 h 进
样 10 μL，测定日蟾毒它灵、蟾毒灵、沙毒精、华
蟾酥毒基和脂蟾毒配基的峰面积的 RSD，均小于
1.50%，结果表明处理后的样品溶液在 24 h 内基本
稳定。
2.1.6 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液，按
“2.1.1”项下色谱条件，重复进样 5 次，每次 10 μL，
在色谱峰保留时间稳定情况下，分别计算 5 个峰面
积的 RSD，日蟾毒它灵为 1.34%、蟾毒灵为 1.14%、
沙毒精为 0.99%、华蟾酥毒基为 0.82%、脂蟾毒配
基为 0.94%，表明精密度良好。
2.1.7 重复性试验 称取同一批样品，平行制备 5
份，按“2.1.3”项下的方法制备样品溶液，依法测
定日蟾毒它灵、蟾毒灵、沙毒精、华蟾酥毒基和脂
蟾毒配基得其 RSD 分别为 1.98%、1.07%、2.35%、
3.22%、2.89%。测得其和的平均质量分数的 RSD
为 3.11%，表明该方法重复性良好。
2.1.8 加样回收率试验 精密称取 6 份己测定的同一
蟾酥样品约 30 mg，分别精密称定。各加入约 1 倍的
日蟾毒它灵、蟾毒灵、沙毒精、华蟾酥毒基和脂蟾毒
配基 5 个对照品，按“2.1.3”项下的方法制备样品溶
液，进样 10 μL。测得 5 个对照品的回收率分别为
99.9%、99.6%、97.9%、96.7%、99.5%，RSD 分别为
2.8%、3.2%、1.9%、1.0%、3.4%，结果见表 1。
2.2 样品测定 取不同产地药材制备供试品溶液，
依法测定，用外标法计算日蟾毒它灵、蟾毒灵、沙
毒精、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的质量分数，结果
见表 1。
3 讨论
3.1 检测波长的选择
取适量 5 种对照品分别加流动相使溶解，并稀释
至适当浓度，经紫外光谱扫描测定，在 296 nm 处 5 者
均接近最大吸收，故选择 296 nm 作为测定吸收波长。

0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
安徽
江苏
山东济南
山东临沂
北京
1
2
3 4
1 2
1
2
3
1
2
3
5 6
1
2
3
5
1
2
3
4
5
t / min t / min
4
3
A B
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 6 期 2013 年 3 月

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表 1 蟾酥样品中活性成分的测定结果
Table 1 Determination of active components in Venenum Bufonis
质量分数 / % 编号 来 源 性 状
日蟾毒它灵 蟾毒灵 沙毒精 华蟾酥毒 脂蟾毒配基 合计
1 安徽 块，棕色 4.803 35.098 0.268 7.608 － 47.777
2 江苏 块，棕色 2.393 6.374 30.804 － 44.791 84.362
3 北京 块，棕褐色 50.228 12.728 0.274 20.238 － 83.468
4 山东济南 块，棕黄色 2.827 22.993 0.190 5.243 1.993 33.246
5 山东临沂 块，棕黄色 32.941 6.396 2.607 － 13.327 55.271
“－”未检出
“–” undetected
3.2 提取方法及溶剂的选择
精密称取样品 0.5 g 分别用 50 mL 甲醇、60%
甲醇回流提取 1 h；甲醇、60%甲醇超声提取 30 min。
经比较最后选用 60%甲醇回流提取 1 h。
采用不同比例的流动相，如甲醇-水（60∶40）
未得到满意的分离效果，经比较，本实验所采用的
流动相可以使蟾酥样品在“2.1.1”项色谱条件下可
基线分离，达到定量测定的要求。
市场上蟾酥样品中所含成分和种类的量差异很
大。对 5 批蟾酥样品进行定量测定结果表明，安徽
和山东济南 2 批样品中蟾毒灵量较高，北京和山东
临沂样品中日蟾毒它灵量较高，而江苏样品中脂蟾
毒配基量较高。江苏和北京 2 批样品总量较其他产
地高，质量优，而另外 3 批样品较低，质量较劣。
参考文献
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[2] 赵 强, 孟凡静, 刘安西. 蟾酥的研究进展 [J]. 中草
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[3] 董玮玮, 周 伟, 李顺旭, 等. 高效液相色谱法测定蟾
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学, 2010, 8(10): 721-724.
[4] 陈 莹, 袁 丹, 孔令锋, 等. HPLC 法测定仙蟾胶囊
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