全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 1 期 2014 年 1 月

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不同种质资源蛇足石杉引种及差异蛋白比较分析
林如辉 1，张丹凤 2，张 靖 2，周以飞 2，潘大仁 2*
1. 福建省食品药品监督管理局培训中心，福建 福州 350001
2. 福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002
摘 要：目的 筛选野生蛇足石杉引种驯化的优质种质资源，并建立其分子鉴别方法。方法 对来自福建大田、三明市郊、
南靖 3 个不同种质资源野生蛇足石杉引种驯化，HPLC 法分析不同种质资源蛇足石杉中石杉碱甲（Hup A）量；采用蛋白质
双向电泳技术，分析不同种质资源蛇足石杉差异蛋白。结果 种质资源来自大田的蛇足石杉适应性较强，植株长势好，成活
率为 65.5%，且茎叶 Hup A 量也较高，分别为 197.80 和 87.54 μg/g；遮阳成活率为 77.8%，远高于未遮阳的成活率（7.1%）；
黄土地成活率为 75%，远高于水田沙壤土的成活率（18.8%）。不同种质资源蛇足石杉共有 15 个差异蛋白质点，不同种质资
源蛇足石杉的差异蛋白质点丰度差异较大。结论 人工引种栽培时，土壤选择以黄土质为佳，并需要给予必要的遮阳；种质
资源来自福建大田的蛇足石杉可以作为蛇足石杉优质种质资源进行引种驯化；利用蛇足石杉差异蛋白质点的丰度差异，可以
作为鉴别不同蛇足石杉种质资源的依据。
关键词：不同种质资源；蛇足石杉；石杉碱甲；差异蛋白；引种驯化
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)01 - 0113 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.01.022
Introduction of Huperzia serrata for selecting different germplasm resources
and comparative analysis on differences in protein
LIN Ru-hui1, ZHANG Dan-feng2, ZHANG Jing2, ZHOU Yi-fei2, PAN Da-ren2
1. Training Center of Fujian food and Drug Administration, Fuzhou 350001 China
2. College of Crop Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350003, China
Abstract: Objective To select the high quality germplasm resources from the wild Huperzi serrata during introduction and
domestication and to establish the method of molecular identification. Methods After introduction and domestication, three different
germplasm resources of H. serrata from Datian, Sanming suburb, and Nanjing were used to determine the contents of huperzine A
(Hup A) by HPLC and to analyze the differential protein by two-dimensional gel electrophoresis of protein. Results H. serrata from
Datian showed the strong adaptability in the growth potential, survival ratio of 65.5% with higher contents of Hup A, 197.80 and 87.54
μg/g in the stems and leaves of H. serrata, respectively. The survival ratio of H. serrata was 77.8% under shadow, far higher than that
(7.1%) under non-shadow, and was 75% in loessland, far higher than that (18.8%) in sand loam paddy field. There were fifteen
differential protein spots in H. serrata from the three different germplasm resources. All the protein spots of H. serrata from different
germplasm resources had obvious abundance differences. Conclusion The loessland is more suitable for the growth of H. serrata
under shadow by artificial cultivation. The H. serrata with the germplasm resource from Datian, Fujian province is used as high
quality one during the introduction and domestication. The different germplasm resources of H. serrata could be identified according
to the abundance differences in differential protein spots.
Key words: different germplasm resources; Huperzi serrata (Thunb. ex Murray); huperzine A; differential protein; introduction and
domestication

蛇足石杉 Huperzia serrata (Thunb. ex Murray)
Trev. 为蕨类植物，属石杉科（Huperiaceae）石杉
属 Huperzia Bernh. 多年生草本植物，其主要有效成
分石杉碱甲（huperzine A，Hup A）是一种高效、低
毒、可逆并高选择性抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）的
药物，临床上用于治疗重症肌无力和早期阿尔茨海

收稿日期：2013-05-13
作者简介：林如辉，副主任药师。
*通信作者 潘大仁，教授，博士生导师。E-mail: 545117397@qq.com
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默病，且疗效显著[1-3]，但在蛇足石杉中的量只有
万分之几至万分之十几[4]。由于目前蛇足石杉栽
培尚未成功[5-6]，化学合成也很难获得高纯度活性
Hup A[7]，因此 Hup A 的原料只能来源于储量有限
的野生蛇足石杉，对野生蛇足石杉的引种驯化意
义重大。
药用植物次生代谢产物是天然药物的主要先导
物，次生代谢产物的量成为野生药用植物引种驯化的
重要性状指标。然而，由于药用植物次生代谢产物不
仅受到生态环境、栽培技术和加工条件等因素的影
响，而且还受到不同种质资源的影响。当前，由于分
子生物学的快速发展，分子鉴定技术越来越广泛应用
于植物筛选种质资源[8-12]，但利用差异蛋白质组学在
药用植物种质鉴定上鲜有报道。因此，本研究通过筛
选次生代谢产物量高的优质种质资源，同时，采用蛋
白质双向电泳技术，分析不同种质资源蛇足石杉差异
蛋白，以期建立优质种质的分子鉴别方法，为确保优
质种质资源质量稳定提供依据。
1 材料与仪器
1.1 材料
不同种质蛇足石杉植株于当年 4 月上旬分别引
种自福建大田县（以下简称大田）、三明市郊（以下
简称三明）和漳州南靖县（以下简称南靖）海拔
400～1 100 m 的林下。选择株高基本一致的种苗，
引种到福建农林大学设施网室中，当年 10 月中旬分
析不同种质蛇足石杉茎叶 Hup A 量和差异蛋白。
1.2 主要仪器
5804 R 台式高速冷冻离心机（德国 Eppendorf
公司）；酶标仪（BioTek 公司）；PROTEAN IEF 等
电聚焦槽和 Protean II XL cell（美国 Bio-Rad 公司）；
KQ—100 型超声波清洗器（昆山市超声食品有限公
司）；AL204 型电子天平（Mettler 公司）；2695 高
效液相色谱仪（美国 Waters 公司）；211 型 pH 值调
节仪（Hanna 公司）。
1.3 试剂
Hup A 对照品（质量分数＞99%，上海融禾
有限公司），色谱纯甲醇（Merk 公司），两性电解
质、IPG 胶条、矿物油（美国 Bio-Rad 公司），CHAPS
（Amresco 公司），低溶点琼脂糖、尿素、丙烯酰
胺、过硫酸胺、碘乙酰胺、DTT、甘油、R-250、
SDS（加拿大 BBI 公司），Bradford 蛋白质定量试
剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）。其
余药品为国产分析纯试剂。
2 方法
2.1 栽培方法
土质：山地黄土质或水田沙壤土。光照：遮阳
和未遮阳处理。样品性状调查：不同种质资源蛇足
石杉的成活率、孢子生长情况、生长状况。田间管
理：定植时浇透水，以后每半月浇 1 次薄水，定植
时增加有机肥。
2.2 不同种质资源蛇足石杉中 Hup A 的测定
2.2.1 总生物碱的提取 从山地黄土质的遮阴栽培
地，分别随机取大田、三明、南靖 3 个不同种质资
源蛇足石杉各 5 株，分离其不同药用部位（茎、叶），
立即放入 60 ℃烘箱里烘干，粉碎，过 20 目筛。按
文献方法[5]进行 Hup A 的提取。
2.2.2 高效液相色谱条件 Waters C18 色谱柱（150
mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.08 mol/L 醋酸
铵缓冲液（30∶70，调 pH 至 6.0 左右）；体积流量 1
mL/min；检测波长 310 nm；柱温 30 ℃；进样量 10 μL。
2.2.3 标准曲线的建立 在此色谱条件下，不同
Hup A 质量浓度与色谱峰有很好的线性关系，Hup A
的出峰时间为 7.245 min，并且在 4.96～39.68 μg 与
峰面积呈良好的线性关系，线性关系为 Y＝2×106
X－4 140.2，r＝0.999 8。
2.2.4 对照品溶液制备 取 Hup A 对照品 1.24 mg，
用甲醇定溶至 25 mL，质量浓度为 49.6 mg/L，再取
出 1 mL，用甲醇定溶至 10 mL，配制成二级溶液质
量浓度为 4.96 mg/L 的对照品溶液。
2.2.5 精密度试验 取 4.96 mg/L Hup A 对照品溶
液，在色谱条件下重复进样 6 次，Hup A 峰面积的
RSD 值为 0.57%。
2.2.6 稳定性试验 取供试品溶液，每隔 2 h 测定
1 次，连续进样 6 次，记录 Hup A 的质量分数的变
化，Hup A 质量分数的 RSD 为 0.40%。
2.2.7 加样回收率试验 精密称取千层塔药材（蛇
足石杉全草）细粉6份，每份0.5 g，分别加入6 μg/mL
对照品溶液 60 mL，按样品制备方法和色谱条件进
行测定，计算回收率。Hup A 加样回收率为 99.94%，
RSD 为 1.46%。
2.3 双向电泳分析不同种质资源蛇足石杉的蛋白质
2.3.1 蛋白质蛇足石杉提取 茎和叶鲜品 100 mg，
剪碎后加入 10 mg 聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40）及少
量石英砂，用液氮研磨成粉。加入样品体积 3 倍的
10%三氯乙酸（丙酮配制，含 10 mmol/L 即 0.07% β-
巯基乙醇），混匀，−20 ℃沉淀过夜，4 ℃，15 000
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r/min 离心 15 min，弃上清。沉淀复溶于等体积的冷
丙酮（含 10 mmol/L β-巯基乙醇），−20 ℃沉淀 1 h，
4 ℃，15 000 r/min 离心 15 min，弃上清。沉淀复溶
于 80%丙酮（含 10 mmol/L β-巯基乙醇），离心所得
沉淀低温冷冻真空抽干。
2.3.2 蛋白质裂解 每毫克干粉加入 20 μL 裂解液
（7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，4% 3-[(3-胆酰胺丙
基)-二乙胺]-丙磺酸，50 mmol/L 二巯基苏糖醇，
0.2% Bio-Rad 载体两性电解质），37 ℃温育 30
min，期间搅动几次，28 ℃ 16 000 r/min 离心 15
min，上清用 Brandford 法定量后−70 ℃保存。
2.3.3 蛋白质定量 按照生工 Bradford 法蛋白定量
试剂盒说明书进行蛋白质定量。取 4 μL 蛋白对照品
加 PBS 稀释至 100 μL，使终质量浓度为 200 μg/mL；
将稀释后的对照品按 0、1、2、4、6、8、10、15 μL
分别加到 96 孔板中，加 PBS 补足到 20 μL，每孔蛋
白量分别为 0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0 μg；
加适当体积样品到 96 孔板的样品孔中，加 PBS 使
总体积达 20 μL；各孔加入 200 μL Bradford 试剂，
混匀，室温放置 5 min；用预热的酶标仪测定 595 nm
处吸光度（A595）值；绘制标准曲线，计算样品中
的蛋白浓度。双向电泳：按文献方法[7]进行操作。
3 结果与分析
3.1 引种适应性研究
3.1.1 不同种质资源蛇足石杉引种移栽成活率 蛇
足石杉对生长环境条件要求比较严格，不同引种地区
蛇足石杉植株移栽成活率有较显著的差异，其中以大
田蛇足石杉移栽成活率最高，达 65.5%。而南靖蛇足
石杉移栽成活率最低，仅达 14.3%，且长势不良。原
因可能是南靖蛇足石杉生长条件偏更潮湿温暖，大田
与三明引种地的条件相对比较干燥冷凉。成活率与移
植地的纬度也可能有关，大田的纬度（北纬 25°29′～
26°09′）与福州（北纬 25°15′～26°39′）最接近。
3.1.2 蛇足石杉引种移栽遮阳效果 蛇足石杉植株
于当年 4 月移栽于福建农林大学设施基地网室内，
用双层遮阳网分遮阳与未遮阳处理。结果表明，遮
阳处理的蛇足石杉成活率高达 77.8%，而未遮阳的
成活率只有 7.1%，相差 10 倍多。表明蛇足石杉是
喜阴的药用植物，人工栽培时，应该给予蛇足石杉
野生环境——足够的荫蔽程度。
3.1.3 不同土壤对蛇足石杉的移栽效果 蛇足石杉
引种在不同的土壤中，结果可见，黄土地栽培成活
率高，为 75.0%，长势良好；水田沙壤成活率为
18.8%，长势不良。因此，人工栽培时，土壤选择
以黄土为佳，并需要给予必要的遮阳；种质来自福
建大田的蛇足石杉引种适应性更强。
3.2 蛇足石杉中 Hup A 的测定结果
不同种质资源蛇足石杉茎、叶中 Hup A 的量结
果见表 1。3 个不同种质资源蛇足石杉茎中的 Hup A
量均大于叶片中的量，几乎为叶的 3 倍，而且叶片
和茎的量都是大田＞三明＞南靖，相互之间都达到
了极显著差异水平。种质来自南靖的植株，其 Hup A
量小于其他来源地植株，原因可能是植株引种后生
长不良，植株长势不佳影响了 Hup A 的量。
表 1 不同种质资源蛇足石杉叶和茎中 Hup A
的质量分数 (n＝6)
Table 1 Hup A content in stems and leaves of H. serrata
from different germplasm resources (n＝6)
来源 叶片 / (μg·g−1) 茎 / (μg·g−1)
大田 87.54±1.51 aA 197.80±2.34 aA
三明 58.52±1.01 bB 185.14±2.21 bB
南靖 55.76±0.98 cC 148.58±2.06 cC
小写字母为显著水平（P＜0.05），大写字母为极显著水平（P＜0.01）
Lowercase letters mean significant difference (P ＜ 0.05) and
uppercase letters means very significant diferences (P＜0.01)
3.3 不同种质蛇足石杉蛋白表达差异分析
3.3.1 不同种质蛇足石杉的蛋白质双向电泳图谱分
析 利用蛋白质双向电泳分析了不同种质蛇足石杉
的蛋白质表达谱，获得了 3 个蛇足石杉双向电泳图谱
（图 1～3）。利用 Imagemaser 2D Elite 5.0 图像分析软
件对这3个不同产地蛇足石杉植株的电泳图谱进行分
析，经软件自动检测结合人工去除，分别保留 267、
258、473 个高清晰且重复性强的蛋白质点，同时对 3
个不同种质资源蛇足石杉蛋白质点的表达丰度（由软
件根据蛋白质点的相对体积自动生成的数量值）进行
差异检测，共得到 15 个差异蛋白质点（图 1 和图 4），

图 1 采自大田蛇足石杉植株的蛋白质表达电泳图谱
Fig. 1 2-DE gel electrophoresis of protein expression
in H. serrata from Datian germplasm rescource
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图 2 采自三明蛇足石杉植株的蛋白质表达电泳图谱
Fig. 2 2-DE gel electrophoresis of protein expression in H.
serrata from Sanming germplasm rescource

图 3 采自南靖蛇足石杉植株的蛋白质表达电泳图谱
Fig. 3 2-DE gel electrophoresis of protein expression in H.
serrata from Nanjing germplasm rescource

图 4 不同种质资源蛇足石杉差异蛋白质点
Fig. 4 Differential protein spots in H. serrata
from different germplasm rescources
并对差异蛋白质点进行标注。
3.3.2 不同种质资源蛇足石杉差异表达蛋白质点表
达丰度 从 3 个不同种质资源蛇足石杉差异表达蛋
白质点表达丰度来看（图 5），在 15 个差异蛋白质
点中，2、4、7、11 在大田植株的表达丰度最高；3、
5、8、14、15 在三明植株中的表达丰度最高；而其
他 6 个点在南靖植株中的表达丰度最高。可见，生
长在不同产地的蛇足石杉，其蛋白质表达量存在着
一定的差异。
4 讨论
蛇足石杉是珍稀的名贵药材，具有多种药用功

图 5 不同种质资源蛇足石杉差异表达蛋白质点表达丰度
Fig. 5 Expression abundance of differential proteins in H.
serrata from different germplasm rescources
效，可用来治疗阿尔茨海默症、治疗重症肌无力和
小儿麻痹症，有提高青春期学生的记忆和学习成绩
等功效。但是蛇足石杉不易引种栽培，本研究通过
对采自福建大田县、三明市郊和南靖县 3 个不同种
质资源的蛇足石杉的适应性栽培和引种驯化，结果
指出，因蛇足石杉为喜阴、喜湿植物，较高的荫蔽
度和较高的湿度环境有利于期生长。湿度较高，植
株长势健壮，株高 20 cm 以上，生长发育快、小孢
子数多，而湿度较低，则长势较弱，株高约 10～15
cm，生长发育迟缓、小孢子数稀少。腐殖层较厚的
沙壤较有利于蛇足石杉的生长。人工引种栽培时，
土壤选择以黄土质为佳，并需要给予必要的遮阳；
种质资源来自大田的蛇足石杉适应性较强，植株长
势好，且 Hup A 量也较高。以上方法可以为蛇足石
杉产业化引种栽培奠定技术基础。
差异蛋白质组学在药用植物种质鉴定鲜有报
道，利用双向凝胶电泳技术对 3 个不同种质资源的
蛇足石杉进行了差异蛋白表达分析，共得到 15 个差
异蛋白质点，不同种质资源蛇足石杉的差异蛋白质
点丰度差异较大，可用于不同种质资源蛇足石杉种
质鉴别。
从蛇足石杉叶和茎中Hup A量分析与差异蛋白
质组学来看，种质资源的产地生态条件影响了 Hup
A 的量，同时这种影响表现在蛋白质分子水平上的
差异。本研究指出，引自福建省大田县的蛇足石杉
Hup A 的量相比最高，而表现在 2、4、7、11 4 个
蛋白差异点表达丰度最高。进一步对蛇足石杉蛋白
差异点研究，将对揭示蛇足石杉 Hup A 量的基因调
控奠定基础。
参考文献
[1] Ma L, Wu F A. Chinese traditional drug which can
enhance the memory retention Huperzia serrata [J].

1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
表
达
丰
度

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
差异蛋白点
大田植株
三明植株
南靖植株

大田
三明
南靖
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