全 文 ：·综述·
水蛭素的生理处置及药动学研究现状
韩国柱
(大连医科大学 药理教研室 ,辽宁 大连 116027)
摘 要: 水蛭素为活血化瘀中药水蛭的重要成分 ,现已通过基因重组技术大量制备 ,具有强大的抗凝抗栓作用。 现
对水蛭素的生理处置、临床前药动学和临床药动学及其血药浓度测定的研究进展进行综述 ,为水蛭素的进一步研
究和临床应用提供科学依据。
关键词: 水蛭素 ;药动学 ;生理处置 ;测定方法
中图分类号: R285. 61 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2003) 08 附 6 03
Current status of studies on physiological disposition and pharmacokinetics of hirudin
HAN Guo-zhu
( Depar tment o f Pharmaco lo g y, Da lian Medica l Univ ersity, Dalian 116027, China)
Key words: hirudin; pharmacokinetics; physiological disposition; assay method
水蛭素 ( hir udin)是活血化瘀中药水蛭中含有的一种重
要有效成分 ,系由 65个氨基酸残基组成的单链多肽。现已通
过基因工程技术成功地获得重组水蛭素 ( r-Hirudin, rH) ,
r H的氨基酸序列和构型与天然水蛭素相似 ,仅在 63位的酪
氨酸缺少硫酸基 ,药理和临床表明重组和天然水蛭素在药理
活性和药动学 ( PK)方面十分相近 ,统称水蛭素 [1]。水蛭素是
迄今最强的特异性凝血酶抑制剂 ,具有很强的抗凝和抗栓作
用 ,对血栓性疾病显示出卓越的临床疗效 ,其治疗价值优于
传统抗凝药肝素 ,从而在国内外引起极大重视 [2]。近年 ,国内
外对水蛭素 PK进行了广泛研究 ,由于天然水蛭素来源有
限 ,文献报道的有关水蛭素 PK多数得自 rH的研究结果。
1 水蛭素的生理处置
1. 1 吸收与分布: 本品口服吸收差 ,但 sc吸收良好 ( >
75% ) ,注射后 1～ 2 h血药浓度达峰值 ;气管内灌注仅少许
吸收 [3]。国内学者研究发现 ,大鼠十二指肠给予 rH 50～ 200
mg /kg后 1. 5 h即有明显抗凝作用 ,在小鼠 30 min后即有
明显抗栓作用 ,且具剂量依赖关系 ,提示 rH在肠道有一定
吸收 ,并认为这与水蛭素不易破胰蛋白酶水解 ,对糜蛋白酶
也有一定耐受性 ,其分子中存在一个由 3个二硫键组成的不
易被降解的仍有抗凝活性的 N 端核心结构有关 [4]。 但所用
剂量大大超过静脉剂量 ,亦说明肠道给药生物利用度低。
水蛭素为水溶性 ,脂溶性差 ,主要分布于细胞外液 ,不易
透过血脑屏障 ,不与血浆蛋白结合 [5]。 大鼠 iv rH后用
ELISA法测得各脏器药物含量远低于血液 , iv给药于 15
min rH含量顺序为血浆> 肺> 心脏 > 脂肪> 骨骼肌> 肾>
肝> 脾> 脑。
1. 2 消除: 水蛭素主要经肾排泄 ,在人体尿中排出剂量的
75% ,在犬几乎完全经肾小球滤过而清除 ,在其他不同种属
动物经肾排出量为: 40% (狒狒 ) , 20% (猪 )和 10% (大鼠 ) [3]。
该药经肾排泄迅速 ,犬单次 iv天然水蛭素 0. 5 mg /kg后 1
h , 50%以上的给药剂量从尿中排出 [5 ]。 研究表明对于人、犬
和兔 ,水蛭素在血中稳定 ,且较少被组织器官代谢 [3, 5] ,尿中
排出的药物主要是其非代谢形式 ,但大鼠却显示完全不同的
特点。 近年日本学者 Komatsu等的研究表明 ,大鼠 iv rH后
尿中测不出非代谢型 r H,尿中排出至少 6种 C-末端被截除
的肽类代谢物 ,分别为 rH( 1-49) , r H( 1-50) , r H( 1-51) , rH
( 1-52) , rH( 1-54)及 r H( 1-55) ,其比例约为: 11% , 51% , 3% ,
11% , 19%和 5% [6 ]。有报道 ,狒狒 iv 131Ⅰ -rH后胆汁中回收的
131Ⅰ -rH达给药剂量的 51% ,说明肝脏对 rH的消除起到了一
定作用 ,免疫组化研究显示 rH存在于狒狒肝细胞以及胆管
周围组织 [7 ]。
2 水蛭素临床前 PK
水蛭素从血浆消除较快 ,其消除半衰期在多数动物种属
不到 1 h, r H在犬体内的动力学行为与人相似。 Nowak和
Markw ardt等对 rH和天然水蛭素在犬体内的 PK进行了较
全面的研究 [3, 8] ,血中水蛭素采用凝血酶时间法和生色底物
法进行测定 ,结果表明单次静脉推注 rH 0. 5 mg /kg 后 2
min,血浆浓度 7μg /m L,其后血药水平迅速下降 , 60 min后
降至初始水平的 10%以下 ,其动力学行为可用二室模型描
述 ; 该药半衰期短 ,消除快速 (t1 /2α0. 25 h, t1/2β , 1. 22 h) ;其
分布容积约为体重的 1 /3,说明仅分布至细胞外液 ,肾清除
率接近总体清除率 ,说明 r H在犬的清除机制主要是肾清
除。犬尿回收试验表明 90% ～ 95%的给药剂量以活性 rH形
式从尿排出 ,仅少量 rH可能被降解或在体内储存 [8]。尿排泄
·6附· 中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 第 34卷第 8期 2003年 8月
收稿日期: 2002-04-02作者简介:韩国柱 ( 1943— ) ,男 ,江苏省泰州市人 ,现为大连医科大学药理学教授 ,主要从事药动学和抗血栓药理学研究。
速率对取样时间中点作图 ,其曲线形状与血药浓度时间曲线
一致 ,说明肾清除是血药浓度的线性函数 [8]。肾切除犬 iv同
样剂量 rH后 ,血药水平较肾功能正常犬大为上升 , 1 h后约
75% ～ 85%的给药剂量被分布至血管外室 , 2 h后血药水平
几乎恒定且处于较高水平 [3, 8 ]。 犬 sc同等剂量 ( 0. 5 mg /kg )
r H后 90 min血药浓度达峰值 ( 0. 3μg /m L) , 8 h后血药水平
为 0. 15μg /m L,其药动学行为可用血管外给药一室模型予
以描述 ,其表现消除半衰期为 5. 75 h,较静注时长。 sc的
AUC0→ 6 h为 1. 71 h· μg /m L,而 iv 时的 AUC0→ 6 h为 1. 54
h· μg /mL ,说明 rH sc生物利用度高。
天然水蛭素以上述两种途径给予相同剂量后血中药物
浓度与 r H几乎相同 ,其差别仅在于 rH的肾清除率较天然
水蛭素高 20% ～ 25% ,推测可能是 rH分子中第 63位赖氨
酸残基脱硫酸基所致 [3, 8 ]。
Rich ter等应用 125Ⅰ同位素标记示踪法进行了研究 [9] ,借
助于凝血酶结合检测法测定体液中未改变的 125Ⅰ -rH。给大鼠
和犬分别 iv 125Ⅰ -rH 1和 0. 5 mg /kg后 , 125Ⅰ -rH的动力学行
为亦遵循一级动力学二室模型 ,其消除半衰期较短 ,为 65
(大鼠 )和 56. 6 min(犬 ) ,稳态表观分布容积 Vdss为 0. 222
(大鼠 )和 4. 55 L (犬 ) ,清除率为 0. 17 (大鼠 )和 7. 06(犬 )
L /h。 sc 125Ⅰ -rH后消除半衰期较 iv长得多 ,分别为 2 h (大
鼠 )和 5 h(犬 )。 Mering等应用 131Ⅰ同位素标记示踪法和蝰蛇
毒凝结时间法测得 rH在狒狒体内的 t1/2β 分别为 24和 23
min,两种方法均说明其消除甚快 [7]。
应用双抗体夹心 ELIS A法测得国产 r H在大鼠体内消
除半衰期亦较短 ( 45～ 50 min) ,并表明当剂量为 0. 5～ 2. 0
mg /kg时 t1 /2β不随剂量而改变 , AUC随剂量增加而成比例
增加 ,说明此剂量范围内 rH表现为线性动力学 [10 ];国内新
近研制的新型重组水蛭素变异体 -2( rHV-2)给猴 iv 1, 3, 6
mg /kg后测得 t1 /2 1. 53～ 1. 85 h , M RT 0. 30～ 0. 32 h, Vdss
0. 19～ 0. 25 L /kg , CL 0. 54～ 0. 7 L /( h· kg ) , AUC随剂量
线性增加 , t1/2等参数不随剂量而改变。 连续 7 d iv相同剂量
未见蓄积现象 [11]。
由于水蛭素半衰期短 ,近年长效水蛭素的研发备受重视。
当以生物大分子或其他生物可降解高分子物质作为水蛭素载
体 ,本品从血浆的清除可被延缓 ,例如葡聚糖或聚乙二醇结合
水蛭素后 ,半衰期可分别延长至 7 h和 5～ 9 h [12, 13 ]。
水蛭素的抗凝作用完全取决于其血浆水平 ,因为其不仅
在血液转运 ,而且作用部位也仅在血循环系统 [1]。 PK-PD关
系研究表明其血浆浓度与其抗凝作用的相关性在 iv明显优
于 sc[14];另外 , rH血药浓度与凝血时间参数 APT T延长的
相关性优于与 TT延长的相关性。 APT T显示了较宽的线性
范围 ,上限高至 0. 5μg /m L ,而 T T的线性仅为 0. 05～ 0. 15
μg /mL [5]。研究还表明血药浓度与抗凝作用的相关关系明显
优于血药浓度与抗栓作用的相关关系 ,有报道在几种动物模
型中 rH的抗栓持续时间长于按血浆半衰期计算应持续的
时间 ,当 rH的血浆浓度已减少至检测限或已从血浆清除
后 ,其抗栓作用仍很明显 [15 ]。
3 水蛭素临床 PK
临床Ⅰ期的 PK资料表明 [3] ,健康人 iv水蛭素后的动力
学遵循开放二室模型一级动物力学 , t1 /2α和 t1/2β 分别为
10～ 15 min和 60～ 100 min,说明 rH消除较快 ,本品表现分
布容积较小 ,约 0. 28 L /kg ,相当于细胞外液体积 ,总体清除
率和肾清除率分别为 170和 130 m L /min,肾清除率为总体
清除率的 80% ,说明肾清除是其从人体内清除的主要途径。
连续 sc可使水蛭素血药浓度相对稳定在一段较长时间内。
治疗中每 8 h用药一次 ,未引起蓄积。 水蛭素的肾清除率与
肌酐清除率具有明显的线性相关 ,肾功能不全病人 ,水蛭素
清除相对延长。双侧肾切除病人 ,本品的半衰期延长至 10 d。
肾病患者因其肾清除延长 ,其 AUC值可较健康自愿者高约
30倍。对于临床中进行血液透析的病人 ,水蛭素的肾清除率
具有特殊重要性 ,其血循环中的消除速率取决于透析膜孔径
的大小。例如 ,采用极限点为 15 kD的血液透析膜时 ,水蛭素
的半衰期为 6～ 8 h [3]。 Bichler用一种特殊 RIA测定法研究
了天然水蛭素在健康人体的 PK , iv属典型的二室模型 , sc
属血管外给药一室模型。测得 t1 /2β 65 min, Vd 17. 2 L ,尿累
积排泄量为剂量的 56% , sc给药的生物利用度为 85% [16]。
一项有 47名健康人参加的多中心研究表明 [17] ,在静脉
推注 rH 0. 1, 0. 3, 0. 5和 1. 0 mg /kg后用 ELISA法测得平
均峰浓度分别为 154, 443, 764和 1 691 mo l /L;其 PK参数
为: Cl t 2. 20 m L /( min· kg ) , MRT 2. 12 h, Vdss 0. 27 L /kg。
说明血药浓度与剂量成比例 , PK参数为剂量非依赖性 ,静脉
滴注不同剂量所得 PK参数与静脉推注结果一致 ,这些说明
rH属线性动力学。 血药浓度和药效关系的研究表明 ,在 rH
为 100和 1 000 nmol /L血浆时 ,激活的部分凝血活酶时间
( APT Tt )分别为基础值 APTT0的 2倍和 4倍 ,遵循抛物线
函数 ,其 APTTt /APT T0比值对 rH血药浓度的平方根作图
呈线性相关 [17]。
4 水蛭素在生物样品中的测定
通常的 HPLC法不适用 ,因水蛭素分子中缺少生色基
团 ,紫外检测灵敏度很低 ,加之水蛭素缺少脂溶性 ,难以通过
有机溶媒萃取富集。
4. 1 生物测定法
4. 1. 1 凝血酶时间测定法: 水蛭素可引起凝血酶时间 ( TT )
的延长 ,并与 rH血药浓度具有相关性。 0. 2 m L血样加入
0. 05 m L凝血酶溶液 ( 20 N IH-u /m L )后测定血凝时间 ,根据
T T延长并借助标准曲线计算本品浓度 [18, 19 ]。
4. 1. 2 生色底物法: 该法系利用生色底物测定系统中剩余
凝血酶的酰胺水解活性 ,从而定量血浆中水蛭素。 通常采用
chr omozym TH( To s-Gly-Pro-A rg-PN A)为生色底物。 凝血
酶能使该生色底物的酰胺键水解从而释放出生色物质 4-硝
基苯胺。 后者可于 405 nm处测定吸光度。 水蛭素能抑制凝
血酶的上述反应 ,并具有定量关系 [8, 19, 20]。
4. 1. 3 蝰蛇毒凝血时间测定法 ( ECT ): 蝰蛇毒 ( eca rin)是自
Echis Carinatus蛇毒中提取纯化的一种酶 ,能直接激活凝血
酶原 ,导致中间体 meizo thrombin生成 ,后者与通常的凝血
·7附·中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 第 34卷第 8期 2003年 8月
酶原 -凝血酶转化中间体不同 ,本身具备蛋白水解活性 ,可使
纤维蛋白原生成纤维蛋白 ,水蛭素能与 meizo th rombin结
合 ,并抑制其活性 ,从而引起 ECT延长。 样品中加入水蛭素
和蝰蛇毒后 ,未与水蛭素结合的中间体可将纤维蛋白原转化
为纤维蛋白 ,其 ECT的延长与水蛭素具有极好相关性。且线
性范围很宽 ( 20～ 4 000 ng /m L )。该法简单、快速、可靠 ,且不
受肝素干扰 ,不仅适用于动物实验研究 ,尤其适于临床
TDM [5, 21]。
4. 2 免疫测定法
4. 2. 1 放射免疫测定法 ( RIA ):该法系将恒定量的 125Ⅰ -标记
水蛭素与含有未知量水蛭素的试样混合 ,在加入凝血酶后 ,
标记及未标记水蛭素彼此竞争与凝血酶结合 ,然后将结合型
与未结合型水蛭素通过双抗体技术加以分离 ,第一抗体为抗
凝血酶 IgG,它与水蛭素 -凝血酶复合物结合 ,第二抗体为针
对第一抗体的抗体 ,用于沉淀上述复合物。 Bichler将这种
RIA称为放射免疫生物测定法 ( radioimmunobioa ssay , RIB-
A)。 该法灵敏度高 ,最低检出限为 10 ng /mL。
4. 2. 2 酶联免疫吸附测定法 ( ELISA):该法已成为水蛭素
PK研究的优选方法 ,现今已有多种专用于水蛭素测定的试
剂盒 ,不同公司出品的试剂盒的抗体和生色系统有所不同。
美国 ADI公司生产的试剂盒其包被抗体为兔抗水蛭素多克
隆抗体 ,酶标抗体为 HRP-鼠抗水蛭素单克隆抗体 ,四甲联
苯胺 ( TM B)为酶底物。 本法特异性高 ,最低检出限为 0. 1
ng /mL。国内学者应用该法研究了国产 rH在大鼠和猴体内
的 PK ,获得了满意结果 [10, 11 ]。
4. 3 同位素标记示踪法: Richte r等研究了 125Ⅰ -水蛭素在大
鼠和狗体内的 PK[9] ,结果表明采用测定总放射活性的方法
缺乏特异性 ,不能代表水蛭素在血样中的浓度。 必须联合其
他分离手段如凝血酶结合测定法方可提高其特异性。
5 结语
水蛭素为直接作用的凝血酶抑制剂 ,其抗凝作用不依赖
于辅因子 AT-Ⅲ ,较间接作用抗凝药肝素为优 ,但缺点是半
衰期短 ,且必须注射给药。目前 ,国外长效水蛭素已进入临床
试验阶段 ,国内已有几家从事 rH的研发。 积极开展水蛭素
PK研究 ,特别是水蛭素临床 PK研究以及 PK-PD关系和
TDM的研究对其临床合理使用及新剂型研发具有重要意
义。
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