全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 11 期 2013 年 6 月
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桂枝挥发油及桂皮醛抗流感病毒的机制研究
刘 蓉 1,何 婷 1,曾 南 1*,陈 恬 2,苟 玲 1,刘金伟 1
1. 成都中医药大学药学院 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地,四川 成都 611137
2. 成都医学院 病原生物学教研室,四川 成都 610083
摘 要:目的 考察桂枝挥发油及其主要成分桂皮醛体外对甲型流感病毒鼠肺适应株 A/PR/8/34(H1N1)的直接杀灭作用,
探讨其抗流感病毒作用机制中 Toll 样受体 7(TLR7)信号通路的作用。方法 以流感病毒感染的狗肾传代细胞(MDCK)
为载体,测定桂枝挥发油及桂皮醛体外抑制流感病毒增殖的半数抑制浓度(IC50)和治疗指数(TI);ELISA 法检测 MDCK
细胞干扰素-β(IFN-β)的分泌;RT-PCR 法考察 MDCK 细胞中 Toll 样受体 3(TLR3)、TLR7、肿瘤坏死因子受体相关因子
3(TRAF-3)、白介素-1 受体相关激酶 4(IRAK-4)、IFN-β基因的表达。结果 桂枝挥发油及桂皮醛对流感病毒有明显的直
接杀灭作用,IC50分别为 1.85×10−7、5.77×10−7 g/mL,TI 分别为 27.04、9.51。与病毒组比较,桂枝挥发油和桂皮醛 0.25×
10−5 g/mL 显著升高感染甲型流感病毒的 MDCK 细胞上清液中 IFN-β的量(P<0.05),显著上调细胞中 TLR7、IRAK-4、IFN-β
mRNA 表达水平(P<0.05)。结论 桂枝挥发油及桂皮醛对流感病毒 H1N1 的增殖有显著抑制作用,作用机制可能与其激活
TLR7 信号通路、活化 IRAK-4、诱导 IFN-β高表达有关。
关键词:桂枝挥发油;桂皮醛;流感病毒 H1N1;TLR7 信号通路;干扰素-β;白介素-1 受体相关激酶 4
中图分类号:R282.710.5;R978.7 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2013)11 - 1460 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.11.019
Mechanism of anti-influenza virus of volatile oil in Cinnamomi Ramulus
and cinnamaldehyde
LIU Rong1, HE Ting1, ZENG Nan1, CHEN Tian2, GOU Ling1, LIU Jin-wei1
1. State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources,
Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China
2. Department of Pathogenic Biology, Chengdu Medical College, Chengdu 610083, China
Abstract: Objective To study the anti-influenza virus A/PR/8/34 (H1N1) activity of the volatile oil in Cinnamomi Ramulus (VOCR)
and cinnamaldehyde in vitro, and to reveal the effect of TLR7 signaling pathway in anti-influenza. Methods The IC50 and therapeutic
index (TI) of VOCR and cinnamaldehyde in vitro were determined using influenza virus-infected Madin-Darby canine kidney (MDCK)
cell line. ELISA was conducted to determine the level of interferon-β (IFN-β) in MDCK cells. The real-time RT-PCR was used to
determine the mRNA expresstion of TLR3, TLR7, TRAF-3, interleukin-1 related acceptor kinase-4 (IRAK-4), and IFN-β. Results Both
VOCR and cinnamaldehyde had the direct virucidal activities on influenza virus; The IC50 values were 1.85 × 10−7 and 5.77 × 10−7 g/mL,
respectively. The TI values were 27.04 and 9.51, respectively. Compared with the virus group, VOCR and cinnamaldehyde (0.25 × 10−5
g/mL) had the significant effects on increasing the serum level of IFN-β in infected MDCK cells (P < 0.05) and the mRNA expression of
TLR7, IRAK-4, and IFN-β (P < 0.05). Conclusion VOCR and cinnamaldehyde have good anti-influenza virus activities in the cellular
level. The mechanisms are related to the activiation of TLR7 signaling pathway and IRAK-4, and leading to the high expression of IFN-β.
Key words: volatile oil of Cinnamomi Ramulus; cinnamaldehyde; influenza virus H1N1; TLR7 signaling pathway; interferon-β;
interleukin-1 related acceptor kinase-4
桂枝为樟科乔木植物肉桂 Cinnamomum cassia
Presl 的干燥嫩枝,有发汗解肌、温经通阳之功效;
药理研究表明,桂枝具有解热、镇痛、镇静、抗惊
厥、抗炎、抗过敏、抗菌、抗病毒等作用[1]。桂枝
收稿日期:2012-08-28
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30973923,8173637);“2010 年度高层次留学人才回国资助人选”项目(国家人社部人社厅函[2010] 411
号);2010 年度留学回国人员科技活动项目择优资助项目(国家人社部人社厅函[2010]412 号);四川省教育厅培育项目(12ZB037)
作者简介:刘 蓉(1979—),女,讲师,博士,研究方向为抗感染免疫。Tel: 13880765230 E-mail: liurong_1116@126.com
*通信作者 曾 南 Tel: 13198502352 E-mail: zengnan966@126.com
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的主要有效组分之一是挥发油,挥发油中主要含有
桂皮醛。前期研究表明,桂枝挥发油和桂皮醛体外
能明显抑制 H1N1 甲型流感病毒在 MDCK 细胞中
的增殖[2],在此基础上,本实验进一步考察桂枝挥
发油和桂皮醛对流感病毒的直接杀灭作用,以及对
感染流感病毒的 MDCK 细胞 Toll 样受体 3
(TLR3)、Toll 样受体 7(TLR7)、肿瘤坏死因子受
体相关因子 3(TRAF-3)、白介素-1 受体相关激酶
4(IRAK-4)、干扰素-β(IFN-β)基因表达的影响,
以期阐释桂枝抗流感病毒的物质基础及 TLR/IFN
信号通路机制。
1 材料
1.1 药物与试剂
桂枝原药材购于成都荷花池中药材市场,产地
广西,经成都中医药大中药鉴定教研室严铸云教授
鉴定为樟科植物肉桂 Cinnamomum cassia Presl 的
干燥嫩枝,质量符合《中国药典》2010 年版标准;
采用《中国药典》2010 年版附录挥发油提取法乙法
提取桂枝挥发油(淡黄色油状液体),无水硫酸钠脱
水后避光密闭保存,其中桂皮醛质量分数 66.85%。
桂皮醛对照品质量分数≥93%,百灵威科技有限公
司,批号 MKBB245。将桂枝挥发油及桂皮醛 50 μL
加入 950 μL 二甲基亚砜(DMSO)溶液,配制成含
桂皮醛 0.05 g/mL 的母液备用。临用时用培养液稀
释至所需质量浓度。利巴韦林,10 mg/瓶,Sigma
公司,批号 020M4003。各药物临用时用培养液稀
释至所需质量浓度。
DMEM 培养基、青霉素和链霉素母液、7.5%
牛血清白蛋白组分 V、 4-羟乙基哌嗪乙磺酸
(HEPES)、胎牛血清、0.25% EDTA-胰酶,均购自
Invitrogen 公司;TPCK-胰酶、4, 5-二甲基噻唑-2, 5-
二苯基四唑溴化物(MTT)、DMSO,Sigma 公司;
磷酸盐缓冲溶液(PBS),Thermo Scientific 公司;
逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq 试剂盒,TaKaRa
公司。琼脂糖、DNA Marker、Trizol,大连宝生物
工程有限公司;Canine IFN-β ELISA 试剂盒,R&D
公司。
1.2 病毒与细胞
甲型流感病毒鼠肺适应株 A/PR/8/34(H1N1),
四川大学华西医学中心提供,−80 ℃保存备用。使
用前于 9 日龄鸡胚尿囊腔连续传代 2 次后,测血凝
滴度为 1∶512。MDCK 细胞,四川省疾病预防控
制中心惠赠,细胞复苏传代后使用。
1.3 仪器
SW—CJ—IF 超净工作台,苏州净化设备有限公
司;GHP—9270 恒温培养箱,上海齐欣科学仪器有限
公司;ND1000 核酸蛋白测定仪,Nano Drop 公司;IQ5
Optical module 实时荧光定量 RT-PCR 仪,Bio-RAD
公司;Multiskan MK3 酶标仪,美国 Thermo 公司。
2 方法
2.1 对流感病毒的直接杀灭作用
前期实验显示,甲型流感病毒对 MDCK 细胞的
半数感染量(TCID50)为 1×10−7 mL,桂枝挥发油
及桂皮醛对 MDCK 细胞的最大无毒浓度(TC0)均
为 0.25×10−5 g/mL,半数中毒浓度(TC50)为 5.0×
10−6 g/mL[2]。将桂枝挥发油或桂皮醛从 2 倍 TC0 开
始进行对倍稀释,并分别与 20 TCID50 病毒液等体
积混合,配制试药-病毒混合溶液(试药质量浓度为
0.25×10−5~39×10−9 g/mL,病毒液终浓度均为 10
TCID50),置于 37 ℃、5% CO2 培养箱中 1 h。待 96
孔板中细胞长成单层后,弃上清液,PBS 洗涤细胞
3 次,按 150 μL/孔加入上述不同质量浓度的桂枝挥
发油或桂皮醛-病毒混合液,同时设置对照组、病毒
组和阳性对照组。对照组不加病毒,每孔只加细胞
培养液 150 μL;病毒组每孔加病毒生长液 150 μL;
阳性对照组每孔加入 TC0(15 μg/mL)利巴韦林与
病毒的混合液 150 μL。每个组平行做 6 复孔,33.5 ℃、
5% CO2 培养箱中继续培养,每日观察细胞病变
(CPE),根据文献方法对 CPE 分级、记录[2]。当病
毒组细胞 CPE 达+++~++++,采用 MTT(终
浓度 0.5 g/L)比色法检测 492 nm 处吸光度(A)值,
计算流感病毒的抑制率,按 Reed-Muench 法计算试
药的半数有效浓度(IC50)和治疗指数(TI)。
TI=TC50 / IC50
2.2 ELISA 法检测 IFN-β分泌量
96 孔板中常规培养 MDCK 细胞,待细胞形成
薄单层后弃上清,PBS 液洗细胞 3 次,每孔加入 10
倍 TCID50 流感病毒 100 μL,细胞对照组正常细胞
每孔加入 PBS 液 100 μL,在 37 ℃、5% CO2 培养
箱中吸附 1 h。吸弃上清液,PBS 液洗细胞 3 次,
除细胞对照组外,将感染流感病毒的细胞分成桂枝
挥发油组、桂皮醛组、病毒组、阳性对照组,每组
设 8 个复孔。对照组加入无血清培养液,桂枝挥发
油和桂皮醛组分别加入桂枝挥发油-病毒混合液和
桂皮醛-病毒混合液(药物终质量浓度均为 2.5×10−6
g/mL),病毒组加入病毒生长液,阳性对照组加入利
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巴韦林-病毒混合液(利巴韦林终质量浓度为 1×10−3
g/mL),体积均为 150 μL,33.5 ℃、5% CO2 培养
箱中继续培养 7 h。用无菌管收集各组细胞上清液,
3 000 r/min 离心 20 min,仔细收集上清,按照试剂
盒说明书操作加入 IFN-β 对照品,制备标准曲线,
加入待测样品,完成 IFN-β 的结合,再加入酶标抗
体后显色,酶标仪测定 450 nm 处 A 值。
2.3 RT-PCR 法检测相关基因表达
2.3.1 样本制备 T25细胞瓶中常规培养MDCK细
胞,待细胞形成薄单层后弃上清,PBS 液轻柔洗细
胞 3 次,每瓶加入 10 TCID50 病毒液 0.5 mL,细胞
对照组正常细胞加入 PBS 液 0.5 mL,各组细胞于
37 ℃、5% CO2 培养箱中吸附 1 h,吸出上清液,
PBS 液轻柔洗涤细胞 3 次。除细胞对照组外,感染
流感病毒的细胞分成桂枝挥发油组、桂皮醛组、病
毒组、阳性对照组。对照组加入无血清培养液,桂
枝挥发油和桂皮醛组分别加入桂枝挥发油-病毒混
合液和桂皮醛-病毒混合液,病毒组加入病毒生长
液,阳性对照组加入利巴韦林-病毒混合液,各组药
物质量浓度同“2.2”项,均 6 mL/瓶,每组 4 个样
本,33.5 ℃、5% CO2 培养箱中继续培养 7 h。消化、
收集细胞,3 000 r/min 离心 5 min,弃上清,收集沉
淀,−80 ℃保存备用。
2.3.2 总 RNA 提取和 cDNA 逆转录合成 采用
Trizol 法提取所收集的细胞总 RNA,核酸蛋白测定
仪测定 A260 值,计算 RNA 的量,并将各组细胞用
双蒸水稀释成相同浓度,按照试剂盒说明书进行逆
转录。逆转录反应体系为:0.1% DEPC 55 μL,50
μmol/L Oligo dT Primer 5 μL,100 μmol/L Random 6
mers 5 μL,总 RNA10 μL。漩涡混匀后 65 ℃水浴 5
min,立即置冰上,再加入 5×primescript 缓冲液 20
μL,PrimeScript RT Enzyme Mix I 5 μL,漩涡混匀,
进行逆转录反应,条件为 37 ℃、17 min,85 ℃、5 s。
2.3.3 RT-PCR 检测 RT-PCR 反应体系:SYBR
Premix Ex Taq 12.5 μL,上下游引物混合物 1 μL,
cDNA 模板 1 μL,双蒸水 10.5 μL。漩涡混匀后置
RT-PCR 仪上进行反应:第 1 步预变性,反应条件
95 ℃、3 min;第 2 步 PCR 反应,反应条件 40 ℃、
95 ℃、10 s,60 ℃、30 s。各引物均由大连宝生物
工程有限公司设计合成,引物序列见表 1。分析得
出各个样品量的 Ct 值,所有样品基因均经内参 18S
RNA 的均一化处理,用 2−△△Ct 公式[3]计算 mRNA
的相对表达量。
ΔΔCt=(Ct 目的基因-Ct 内参)实验组-(Ct 目的基因-Ct 内参)对照组
2.4 统计学处理
数据均用 ±x s 表示,各组数据呈正态性分布时
应用 SPSS 1.0 统计软件进行单因素方差分析,不符
合正态性分布时采用 K-W 检验。
3 结果
3.1 对流感病毒的直接杀灭作用
感染流感病毒的 MDCK 细胞皱缩、变圆、脱
落。桂枝挥发油和桂皮醛对流感病毒具有抑制作用,
且抑制作用随质量浓度的升高而逐渐增强,CPE 逐
渐减轻。桂枝挥发油在 TC0(2.5×10−6 g/mL)对流感
病毒的直接杀灭率为 81.8%,在 1.25×10−6~3.13×
10−7 g/mL 时,对流感病毒的杀灭率均高于 50%。桂
表 1 基因引物序列及产物片段
Table 1 Sequences of gene primers and fragments of products
目的基因 引物序列 (5’-3’) 产物片段 / bp
正向:CGGACAGGATTGACAGATT 18S RNA
反向:CAAATCGCTCCACCAACTAA
109
正向:CCTGGTTTGTTAATTGGATTAACAG TLR3
反向:TGAGGTGGAGTGTTGCAGAGG
144
正向:TTTATCTGGATGGAAACCAG TLR7
反向:AAGATACTGTTGGCTTCGAGGCT
138
正向:TAGGGCATTCGTTGAACTTTGGA TRAF-3
反向:TGTCCCAGGTGAAGTTTTCC
111
正向:GGCAAAGACAGGACATTTGTGT IRAK-4
反向:TTTTCTGGACTTGAGGAGTCAGG
80
正向:CCAGTTCCAGAAGGAGGACA IFN-β
反向:TGTCCCAGGTGAAGTTTTCC
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皮醛在 TC0对流感病毒的杀灭率为 65.5%,在 1.25×
10−6~6.25×10−7 g/mL 时对流感病毒杀灭率>
50%。利巴韦林在 TC0(1.5×10−5 g/mL)时对流感
病毒杀灭低于 50%。桂枝挥发油、桂皮醛对流感病
毒的 IC50、TC50和 TI 见表 2。
表 2 桂枝挥发油和桂皮醛对流感病毒的 IC50、TC50和 TI
Table 2 IC50, TC50, and TI of VOCR and cinnamaldehyde
on influenza virus
组 别 TC50 / (g·mL−1) IC50 / (g·mL−1) TI
桂枝挥发油 5.0×10−6 1.85×10−7 27.04
桂皮醛 5.0×10−6 5.77×10−7 9.51
利巴韦林 >1.0×10−3 - -
因利巴韦林在 TC0对流感病毒的抑制率<50%,无法计算 IC50 及 TI
IC50 and TI of ribavirin could not be calculated in direct virucidal
experiment because viral inhibitory ratio is less than 50%
3.2 对感染流感病毒的 MDCK 细胞 IFN-β分泌的
影响
根据 IFN-β对照品拟合回归方程为Y=0.004 772
X+0.035 957,按此方程换算待测样品的 IFN-β的量。
与对照组比较,病毒组 IFN-β分泌量无显著差异。
与病毒组比较,桂枝挥发油和桂皮醛能显著增加感
染流感病毒的 MDCK 细胞 IFN-β 的分泌量(P<
0.05);利巴韦林组有促进 IFN-β分泌的趋势,但与
病毒组相比无显著差异,可能与其测定时间及抗病
毒机制有关。结果见表 3。
表 3 桂枝挥发油及桂皮醛对感染流感病毒的 MDCK 细胞
IFN-β分泌的影响 ( 8=± n , sx )
Table 3 Effects of VOCR and cinnamaldehyde on IFN-β
secretion in H1N1-infected MDCK cells
( 8=± n , sx )
组 别 ρ / (g·mL−1) IFN-β / (ng·L−1)
对照 - 228.592±17.501
病毒 - 228.723±27.200
桂枝挥发油 2.5×10−6 285.958±58.872*
桂皮醛 2.5×10−6 261.859±30.872*
利巴韦林 1.0×10−3 233.045±27.817
与病毒组比较:*P<0.05
*P < 0.05 vs virus group
3.3 对感染流感病毒的 MDCK 细胞相关基因表达
的影响
与对照组相比,病毒组 MDCK 细胞 TLR7、
IRAK-4、IFN-β基因表达明显上调(P<0.05、0.01),
TLR3、TRAF-3 基因表达未见明显改变,提示流感
病毒可激活 TLR7 信号通路的转导,而对 TLR3 信号
通路则无明显影响。与病毒组比较,桂枝挥发油和
桂皮醛组 MDCK 细胞 TLR7、IRAK-4、IFN-β 基因
表达也明显上调(P<0.05、0.01),但桂枝挥发油组
TLR3 基因表达明显低于病毒组(P<0.01),桂皮醛
对 TLR3 基因表达则无明显影响,桂枝挥发油和桂皮
醛对 TRAF-3 基因表达无显著差异。结果见表 4。
表 4 桂枝挥发油及桂皮醛对感染流感病毒的 MDCK 细胞相关基因表达的影响 ( 4=± n , sx )
Table 4 Effects of VOCR and cinnamaldehyde on mRNA expresstion of related genes
in H1N1-infected MDCK cells ( 4=± n , sx )
2−ΔΔCt
组 别 ρ / (g·mL−1)
TLR3 TLR7 TRAF-3 IRAK-4 IFN-β
对照 - 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
病毒 - 1.58±0.41 1.74±0.48▲ 0.73±0.12 1.42±0.59▲ 6.53±0.89▲▲
桂枝挥发油 2.5×10−6 0.53±0.20** 11.92±3.23** 0.58±0.06 3.46±0.46** 24.21±9.72**
桂皮醛 2.5×10−6 1.13±0.22 7.95±2.45** 0.70±0.17 3.06±0.59* 24.26±2.50**
利巴韦林 1.0×10−3 2.10±0.89 1.82±0.41 0.43±0.10* 1.45±0.06 8.09±2.20
与对照组比较:▲P<0.05 ▲▲P<0.01;与病毒组比较:*P<0.05 **P<0.01
▲P < 0.05 ▲▲P < 0.01 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs virus group
4 讨论
流感属中医学“时行感冒”范畴,或称“重伤
风”,流感病毒则是引起其“表证”的主要外邪之一,
故治疗多采用解表之法[2]。桂枝作为辛温解表药的
代表,临床配伍应用广泛,主治外感表证,挥发油
是其“辛散解表”的重要物质基础之一[4]。在前期
研究基础上,本实验进一步证实桂枝挥发油和桂皮
醛在 TC0 下对流感病毒具有直接杀灭作用,对感染
流感病毒的 MDCK 细胞具有保护效应。
IFN 系统在非特异性免疫和特异性免疫之间起
桥梁作用。正常情况下,机体内 IFN 水平较低,当
机体受到病毒感染后,IFN 表达增多,从而防止病
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毒的扩散和蔓延。IFN 不能直接灭活病毒,对病毒
的抑制作用是通过与干扰素受体结合,经过一系列
的信号转导过程,激活细胞基因,诱导细胞合成抗
病毒蛋白(AVP)而发挥效应。同时,IFN 作为一
类重要细胞因子,也参与机体的免疫调节,增强自
然杀伤细胞(NK 细胞)、巨噬细胞和 T 淋巴细胞的
活力,以增强机体抗病毒能力[5]。
TLRs 是一类最具代表性的模式识别受体(PRRs),
能够识别病原微生物中的特异性保守成分,即病原
相关分子模式(PAMPs),与病毒识别关系最为密
切的 TLRs 是 TLR3、TLR7[6-7]。TLRs 信号转导途
径分为 MyD88 依赖性和非 MyD88 依赖性两种,
TLR3 的信号转导是 MyD88 非依赖性的,其通过
Toll 样受体相关干扰素活化子(TRIF)诱导 IFN 和
磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)完成下游信息传递,最
终信息转导以 IFN 活化为特征[8]。其中,TRAF-3
是非 MyD88 依赖性信号转导途径的重要接头分子,
主要参与 TRIF 依赖性通路当中的信号转导 [9]。
TLR7 信号转导为 MyD88 依赖性,当 TLR7 与配体
结合后促使其本身二聚化,并通过 TIR 区域传递信
号和激发下游效应,启动 MyD88 依赖性通路活化。
活化后的MyD88在重要的接头分子 IRAK-4的作用
下使 IRAK-1 发生自身磷酸化,继而引起 TRAF-6、
转化生长因子-β活化激酶(TAK1)的活化及 NF-κB
抑制因子 I-κB 的磷酸化和泛素化,从而解除了对与
之结合的 NF-κB 的抑制作用,游离的 NF-κB 转位
入核,使特定基因活化转录生成细胞因子 TNF-α、
IL-1β和 IFN-β,进而发挥抗病毒感染作用[10-11]。
利巴韦林作为一种广谱抗病毒药物,对多种
RNA 和 DNA 病毒有效,其中对甲型、乙型流感病
毒有较为明确的抑制作用。然而本实验结果发现,
其在体外对 Toll 信号通路中关键分子的表达并无显
著影响。分析原因,认为可能与其抗病毒机制有关。
本实验结果表明,桂枝挥发油和桂皮醛作用于
感染流感病毒的 MDCK 细胞后,细胞上清液中
IFN-β水平以及 IFN-β、TLR7、IRAK-4 基因表达水
平均明显上调,而对 TLR3、TRAF-3 基因表达无明
显影响,提示桂枝挥发油及桂皮醛抗甲型流感病毒
的作用机制与其诱导 IFN-β的高表达有关;而激活
TLR7 信号通路,诱导通路中重要蛋白 IRAK-4 表达
上调,是桂枝挥发油与桂皮醛使感染流感病毒的细
胞 IFN-β 表达增强的重要途径之一。然而,TLRs
亚型较多,桂枝挥发油与桂皮醛是否会通过影响其
他通路的调馈来协同发挥抗病毒效应,实验中桂枝
挥发油降低感染流感病毒的 MDCK 细胞中 TLR3
基因表达的表现,是否与桂枝挥发油中其他化学成
分发挥负反馈调节作用,或者是因为 TLR 通路激
活,下游炎性因子释放增多,在感染和炎症的平衡
过程当中,细胞受到相关调节因子刺激发挥的负反
馈调节方式有关,还有待深入研究。
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中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 11 期 2013 年 6 月
·1465·
蝎毒多肽增强 5-氟尿嘧啶对 H22肝癌抑制作用的机制研究
郑安红,张维东*,王兆朋,王朝霞,贾 青,张月英,武利存
山东省医学科学院基础医学研究所 山东省罕见病重点实验室,济南大学 山东省医学科学院 医学与生命科学学院,山东
济南 250062
摘 要:目的 探讨蝎毒多肽增强 5-氟尿嘧啶(5-Fu)对肝癌 H22抑制作用的机制。方法 以接种 H22 肝癌小鼠腹水方法建
立小鼠荷瘤模型,在接种后第 7 天将荷瘤小鼠随机分为模型组、蝎毒多肽(20 mg/kg)组、5-Fu(15 mg/kg)组、低剂量蝎
毒多肽(5 mg/kg)+5-Fu 组、高剂量蝎毒多肽(20 mg/kg)+5-Fu 组,每组 10 只,连续给药 21 d。绘制肿瘤体积增长曲线
并计算抑瘤率;CD34 标记肿瘤微血管;免疫组织化学法检测核因子-κB(NF-κB)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和血管内
皮生长因子(VEGF)蛋白表达。结果 与模型组相比,联合给药组 H22 肝癌移植瘤的生长受到明显抑制(P<0.01),微血
管密度(MVD)及 NF-κB、MMP-9、VEGF 蛋白表达均明显降低(P<0.01);与 5-Fu 组相比,高剂量蝎毒多肽+5-Fu 组的
MVD 及 NF-κB、MMP-9、VEGF 蛋白表达也显著降低(P<0.01),而低剂量蝎毒多肽+5-Fu 组则无显著改变。结论 蝎毒
多肽可增加 5-Fu 对肿瘤组织的抑制作用,其机制可能与抑制 H22肝癌组织 NF-κB 通路及 MMP-9、VEGF 的表达,从而抑制
新生血管形成有关。
关键词:蝎毒多肽;肝癌 H22;核因子-κB;血管内皮生长因子;基质金属蛋白酶
中图分类号:R282.710.5;R979.19 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2013)11 - 1465 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.11.020
Mechanism of polypeptide from scorpion venom increasing inhibition
of 5-fluorouacil on H22 hepatoma
ZHENG An-hong, ZHANG Wei-dong, WANG Zhao-peng, WANG Zhao-xia, JIA Qing, ZHANG Yue-ying,
WU Li-cun
Key Laboratory for Rare & Uncommon Diseases of Shandong Province, Institute of Basic Medicine, School of Medical and Life
Science, Jinan University, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062, China
Abstract: Objective To explore the mechanism of polypeptide from scorpion venom (PSV) on increasing the inhibition of
5-fluorouacil (5-Fu) on H22 hepatoma. Methods H22 hepatoma model was established through sc inoculating H22 cells suspension
into 40 mice in right armpits. Then tumor-bearing mice were divided into five groups randomly on the day 7 after inoculating: model,
PSV (20 mg/kg), 5-Fu (15 mg/kg), low-dose PSV (5 mg/kg) + 5-Fu, and high-dose PSV (20 mg/kg) + 5-Fu groups, 10 mice in each
group, continuously admininstered for 21 d. Tumor volumes were measured once every other day, then the curves of tumor growth
were drawn and the tumor inhibitory rate was calculated; CD34 was used to mark capillary; Immunohistochemical assay was used to
detect the protein expression changes of nuclear factor-kappa B (NF-κB), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), and vascular
endothelial growth factor (VEGF). Results Compared with the model group, the growth of H22 hepatoma transplantation tumor in the
combinational groups was obviously inhibited (P < 0.01); The microvessel density (MVD) and the protein expression of NF-κB,
MMP-9, and VEGF in the two PSV groups were all decreased significantly (P < 0.01); Compared with 5-Fu group, the MVD and the
protein expression of NF-κB, MMP-9, and VEGF in the high-dose PSV + 5-Fu group were also decreased (P < 0.01), while there was
no significant difference between the low-dose PSV + 5-Fu group. Conclusion PSV may increase the inhibition of 5-Fu on H22
收稿日期:2012-09-03
基金项目:国家自然科学基金资助项目(81073102,30873408);山东省自然科学基金资助项目(ZR2010HQ003);济南市科学技术发展计划
(201004012)
作者简介:郑安红(1987—),女,硕士研究生,研究方向为实验肿瘤病理学。Tel: 18264170193 (0531)82919939 E-mail: ahzheng2008123@126.com
*通信作者 张维东 Tel: (0531)82919939 E-mail: zhangweidongkui@163.com