全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 1 期 2012 年 1 月 ·94·
HPLC 法制备巫山淫羊藿中的淫羊藿属苷 A 和朝藿定 C 对照品
谢娟平 1，王浩东 1，孙文基 2
1. 安康学院 化学化工系，陕西 安康 725000
2. 陕西省生物医药重点实验室，陕西 西安 710069
摘 要：目的 研究制备型高效液相分离纯化巫山淫羊藿中淫羊藿属苷 A 和朝藿定 C 的条件。方法 巫山淫羊藿粗提物经大
孔吸附树脂和硅胶柱色谱得朝藿定 C 与淫羊藿属苷 A 的混合物，进行 HPLC 制备色谱分离，以乙腈-水（24∶76）为流动相，
收集相应流分浓缩至干，甲醇溶解，滤过，滤液蒸干即得。结果 该法所得产品极易结晶，用面积归一化法定量，质量分数
大于 98.0%，经紫外、红外、核磁共振确定结构，与文献数据基本一致。结论 本法简便快捷，可获得高纯度的淫羊藿属苷
A 和朝藿定 C，解决在常规柱色谱法制备朝藿定 C 对照品中存在的不易结晶和纯度不够的问题，产品可用作分析用对照品。
关键词：巫山淫羊藿；朝藿定 C；淫羊藿属苷 A；制备高效液相色谱；对照品
中图分类号：R283.6 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)01 - 0094 - 03
Preparation of epimedoside A and epimedin C reference substance
from Epimedium wushanense by HPLC
XIE Juan-ping1, WANG Hao-dong1, SUN Wen-ji2
1. Department of Chemistry and Chemical Engineering, Ankang University, Ankang 725000, China
2. Shaanxi Province Key Laboratory of Biology and Medicine, Xi’an 710069, China
Key words: Epimedium wushanense T. S. Ying; epimedin C; epimedoside A; preparative high performance liquid chromatography
(pre-HPLC); reference substance

巫山淫羊藿为小檗科淫羊藿属植物巫山淫羊藿
Epimedium wushanense T.S.Ying 的干燥叶[1-2]。研
究表明，巫山淫羊藿中的主要活性成分是黄酮类化
合物朝藿定 C 而非淫羊藿苷[3-6]，因此，《中国药典》
2010 年版将其单列。在对照品分离中，常见的是经
典柱色谱[7]，但是在朝藿定 C 对照品分离中，由于
朝藿定C和淫羊藿属苷A两者结构相似、极性相近，
即使采用经典硅胶柱色谱联合凝胶分离，经重结晶
后，在薄层色谱检查中，仍然可以看到淫羊藿属苷
A 的微小斑点，柱色谱很难得到高纯度的朝藿定 C，
朝藿定C在结晶时也很难结晶。为了解决这一问题，
提供符合标准的朝藿定 C 对照品，本实验采用制备
型高效液相色谱（preparative high performance liquid
chromatography，pre-HPLC）[8-9]从巫山淫羊藿中分
离制备得到淫羊藿属苷 A 和朝藿定 C 单体。方法简
单、可行，产品可用作样品分析的对照品。
1 仪器与材料
Amersham 制备型液相色谱仪（瑞典 Amersham
公司），包括 UV—900 紫外检测器、3 mL 进样环、
Frac—900 型流分收集器、P—900 泵；Waters
Alliance 2695-2487 分析型液相色谱仪（Waters 公
司），包括 Waters2695 分离单元、Waters 2487 双
波长检测器、Empower 工作站；Nicolet IR100 型红
外仪（Thermo Nicolet 公司），Bruker Avance DRX—
500 型核磁共振仪（瑞士 Bruker）。乙腈为色谱纯，
其余试剂均为分析纯，水为双蒸水，D-101 型大孔
吸附树脂（西安蓝深公司）；柱色谱用硅胶 G（100～
200 目，青岛海洋化工有限公司）。
2 方法与结果
2.1 样品溶液的制备
取巫山淫羊藿 1 kg，切碎，8 倍量 75%乙醇渗
漉至无色，收集渗漉液，减压浓缩，回收乙醇，得

收稿日期：2011-05-08
基金项目：《中国药典》2010 版修订项目（国家药典中发 [2008] 99 号）；陕西省教育厅基金项目（09JK319，2010JS098）；安康学院科研资助
项目（AYQDZR200801）
作者简介：谢娟平（1972—），女，副教授，硕士，研究方向为天然产物分离分析与开发。Tel: 15877352906 E-mail: xjp_731205@163.com
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浸膏 80 g。取上述浸膏，用 500 mL 水溶解，离心，
上清液上 D-101 型大孔吸附树脂，吸附过夜，用蒸
馏水洗脱杂质，用乙醇梯度洗脱，取 50%乙醇洗脱
部分，回收乙醇，浓缩，用硅胶拌样，上硅胶 G 柱，
用氯仿-甲醇-水（3∶1∶0.1）洗脱，配合同体系溶
剂薄层检测，得单点部分 A 和混合部分 B。单点部
分 A 洗脱液浓缩，得黄色固体粉末 30 mg，即化合
物 1。混合部分 B 洗脱液，减压浓缩至干，得淡黄
色粉末约 12 g，用甲醇溶解，作为制备色谱用样品
溶液。
2.2 制备色谱分离
2.2.1 制备色谱条件 色谱柱为Spherigel 100A C18
柱（300 mm×15.0 mm，5 μm，大连中汇达科学仪
器公司），流动相为乙腈-水（24∶76），体积流量 3
mL/min，检测波长 270 nm，柱温为室温。进样量
2.5 mL，流份收集器步速为 15 mL/管。
2.2.2 色谱制备 将所得样品溶液每次进样 2.5
mL，流分收集为 15 mL/管，根据紫外检测，收集
相应峰对应的试管流出液，得到样品 1 和样品 2 两
部分。减压回收溶剂，甲醇溶解，滤过，滤液减压
回收后得到制备目标产物化合物 1 和化合物 2，制
备色谱图见图 1-I（流动相为 24%乙腈，体积流量
2.5 mL/min），同时进行薄层色谱检测，展开剂为氯
仿-甲醇-水（3∶1∶0.1），薄层色谱图均为单点。




1-淫羊藿属苷 A 2-朝藿定 C
1-epimedoside A 2-epimedin C

图 1 淫羊藿属苷 A 和朝藿定 C 的制备 HPLC 谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of epimedoside A
and epimedin C

2.3 结构鉴定
化合物 1：黄色固体粉末，mp 210～211 ℃，
HCl-Mg 反应呈红色，Molish 反应呈阳性，喷 1%
AlCl3 乙醇溶液后显黄色荧光。薄层水解反应鉴定糖
为葡萄糖及鼠李糖，ESI m/z: 661 [M－H]－，分子式
C32H38O15。 KBrmaxIR ν (cm−1): 3 524, 3 454, 3 321 (-OH),
3 050 (CH＝), 2 904 (-CH-), 1 652 (C＝O), 1 600,
1 556, 1 507 (苯环)；1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)
δ: 12.59 (1H, s, 5-OH), 10.22 (1H, s, 4′-OH), 7.79
(2H, d, J = 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.92 (2H, d, J = 8.5 Hz,
H-3′, 5′), 6.62 (1H, s, H-6), 5.29 (1H, s, Rha-H-1),
5.15 (1H, t, J = 6.5 Hz, H-2″), 4.99 (1H, d, J = 6.0 Hz,
Glu-H-1), 1.68 (3H, s, H-5″), 1.59 (3H, s, H-4″), 0.79
(3H, d, J = 5 Hz, Rha-H-6)；13C-NMR (500 MHz,
DMSO-d6) δ: 157.6 (C-2), 134.3 (C-3), 178.1 (C-4),
159.0 (C-5), 98.0 (C-6), 160.4 (C-7), 108.2 (C-8),
152.9 (C-9), 105.5 (C-10), 120.5 (C-1′), 130.5 (C-2′,
6′), 115.3 (C-3′, 5′), 160.0 (C-4′), 21.3 (C-1″), 122.1
(C-2″), 130.9 (C-3″), 25.3 (C-4″), 17.7 (C-5″)。以上数
据与文献报道[10]的淫羊藿属苷 A 氢谱、碳谱数据基
本一致。
化合物 2：黄色颗粒状结晶，mp 198～200 ℃，
HCl-Mg 反应红色，Molish 反应阳性，喷 1% AlCl3
乙醇溶液后显黄色荧光。薄层水解反应鉴定糖为葡
萄糖及鼠李糖，ESI m/z: 845 [M＋Na]+，分子式
C39H50O19。 KBrmaxIR ν (cm−1): 3 403 (-OH), 3 050 (CH＝),
2 913(-CH-), 1 650 (C＝O), 1 597, 1 510 (苯环)。
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 12.60 (1H, s,
5-OH), 7.94 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-2′, 6′), 7.17 (2H, d,
J = 8.9 Hz, H-3′, 5′), 6.68 (1H, s, H-6), 5.43 (1H, brs,
Rha-H-1), 5.20 (1H, t, J = 7.0 Hz, H-2″), 5.05 (1H, d,
J = 7.4 Hz, Glu-H-1), 4.92 (1H, brs, Rha′-H-1), 3.90
(3H, s, -OMe), 1.73 (3H, s, H-5″), 1.64 (3H, s, H-4″),
1.14 (3H, d, J = 6.1 Hz, Rha′-H-6), 0.86 (3H, d, J =
5.5 Hz, Rha-H-6)；13C-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ:
157.3 (C-2), 134.6 (C-3), 178.3 (C-4), 159.1 (C-5),
98.2 (C-6), 160.6 (C-7), 108.4 (C-8), 153.0 (C-9),
105.6 (C-10), 122.2 (C-1′), 130.6 (C-2′, 6′), 114.1
(C-3′, 5′), 161.5 (C-4′), 21.4 (C-1″), 122.1 (C-2″),
131.2 (C-3″), 25.5 (C-4″), 17.9 (C-5″), 55.5 (-OMe)。
以上数据与文献报道[11]的朝藿定 C 氢谱、碳谱数据
基本一致。
2.4 纯度检测
2.4.1 分析色谱条件 色谱柱为 Waters SunfireTM-
C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），流动相为乙腈-
水（25∶75），体积流量 1 mL/min，检测波长 270 nm，
柱温为室温。
2.4.2 色谱分析 取适量目标产物淫羊藿属苷A和
朝藿定 C，用甲醇溶解，按分析色谱条件进样测定，
面积归一化法计算两者的质量分数分别为 98.9%和
99.1%，分析色谱图见图 2[3, 5]。
1 2 1
2
0 150 300 450 0 150 300 450
t / min
I II
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1-淫羊藿属苷 A 2-朝藿定 C
1-epimedoside A 2-epimedin C

图 2 混合对照品 (A) 和样品 (B 和 C) 的 HPLC 色谱图
Fig. 2 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A) and samples (B and C)

3 讨论
3.1 样品液的制备
制备色谱分离时样品溶液中目标产物的质量分
数对制备效率影响很大，为了获得较高的制备效率，
需对样品进行预处理，本实验采用大孔树脂梯度洗
脱和柱色谱 G 硅胶对样品进行前处理，去除了大部
分杂质，并取其 50%乙醇洗脱部分，使两个目标产
物得到富集，同时也延长了制备色谱柱的使用寿命。
3.2 流动相的选择
从分析色谱条件可知，乙腈-水（25∶75）即可
将两者很好分离。在制备液相色谱中，曾利用梯度
洗脱（0 min，35%乙腈；5 min，30%乙腈；50 min，
40%乙腈；体积流量 2 mL/min），制备色谱见图 1-II
（梯度洗脱：0～5 min，35%～30%乙腈；5～50 min，
30%～40%乙腈），一次性得到质量分数大于 99%的
朝藿定 C，但此时另一化合物淫羊藿属苷 A 质量分
数不能达到要求，考虑到制备液相进样量大，体积
流量高，故将流动相中乙腈-水比例降为（24∶76），
结果两者在制备柱上一次性达到良好分离（图 1-I）。
3.3 进样量与体积流量的选择
每次进样 3 mL 以上时，分离时间明显延长，分
离效果较差；体积流量增加至 3 mL/min 以上，朝藿
定 C 和淫羊藿属苷 A 的质量分数都有所降低，但只
要在 5 mL/min 以内，均可以得到符合质量要求（质
量分数大于 98%，HPLC）的产物，考虑到对色谱柱
的保护，选用 3 mL/min 的体积流量进行制备分离。
3.4 产品纯度分析及收率
1 g 制备色谱用样品可制备约 40 mg 淫羊藿属
苷 A 和 200 mg 朝藿定 C，其中朝藿定 C 在溶剂回
收（重结晶）中黏度明显降低，容易得到黄色颗粒
状结晶，面积归一化计算淫羊藿属苷 A 和朝藿定 C
产品质量分数分别为 98.9%和 99.1%，外标法定量
确定产品质量分数分别为 99.8%和 100.5%，收率分
别达到了 65%以上，可以作为《中国药典》2010 年
版新增单列品种——巫山淫羊藿项下新的检测指标
朝藿定 C 对照品的制备方法。
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