全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 5 期 2011 年 5 月 ·886·
酶法辅助提取绞股蓝中总黄酮工艺优化
欧阳辉 1, 2，田启建 1，余 佶 1，李顺祥 2*
1. 吉首大学 植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南 吉首 416000
2. 湖南中医药大学 中药现代化研究湖南省高校重点实验室，湖南 长沙 410208
摘 要：目的 优化酶法辅助提取绞股蓝中总黄酮工艺。方法 采用响应面法优化工艺，绞股蓝经纤维素酶处理后用 95%
乙醇提取总黄酮，研究酶用量、酶解温度、酶解时间和酶解 pH 值对总黄酮得率的影响。结果 酶法提取的最佳工艺条件：
酶用量 120 U/mL，酶解温度 49 ℃，酶解时间 150 min，酶解 pH 值 3.9，总黄酮得率可达 0.357%。结论 纤维素酶辅助提
取绞股蓝中总黄酮工艺稳定可行。
关键词：绞股蓝；总黄酮；提取；纤维素酶；响应面法
中图分类号：R284.2；R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)05 - 0886 - 04
Technology optimization for extracting total favonoids from Gynostemma
pentaphyllum by cellulase
OUYANG Hui1, 2, TIAN Qi-jian1, YU Ji1, LI Shun-xiang2
1. Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Utilization, Jishou University, Jishou 416000, China
2. Key Laboratory of Modernization of Chinese Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China
Abstract: Objective To optimize the extracting process of total flavonoids from Gynostemma pentaphyllum. Methods The total
flavonoids were extracted with ethanol 95% after the cellulose treatment to G. pentaphyllum, and the effects of enzyme dosage,
enzymatic treatment temperature, enzymatic treatment time, and pH value on the total flavonoids yield was studied with response
surface method. Results The optimal enzymatic extracting process of total flavonoids was as follows: enzyme dosage 120 U/mL,
enzymatic temperature 49 ℃, enzymatic time 150 min, and pH value 3.9, and the total flavonoids yield reached 0.357%. Conclusion
Cellulase is suitable for the total flavonoid extraction from G. pentaphyllum.
Key words: Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino; total flavonoids; extraction; cellulase; response surface method (RSM)

绞股蓝又名七叶胆，是葫芦科绞股蓝属植物绞
股蓝 Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino 的
全草，为多年蔓生草本，主要分布在东南亚及我国
长江以南的广大地区，含有丰富的黄酮类化合物（芦
丁、槲皮素等）[1-2]，具有抗疲劳、调血脂、降血压、
促进细胞新陈代谢、抗衰老、增强免疫功能、抑制
肿瘤、祛痰利尿等作用以及临床治疗气管炎、传染
性肝炎等[3-5]。
目前黄酮类化合物的提取方法主要有水提取、
碱提酸沉、乙醇提取、微波辅助提取、超临界萃取
等方法。酶解法为天然产物提取中的新兴技术，利
用酶制剂可以降解植物细胞壁，使胞内有效成分最
大限度溶出，同时酶解可以较温和地将植物组织分
解，保证了提取物的性质和结构的稳定[6-11]。绞股
蓝植物细胞壁的主要成分为纤维素、半纤维素，选
用纤维素酶作为实验用酶制剂。
响应面分析法（response surface method，RSM）
是一种优化工艺条件的有效方法，广泛应用于化学
化工、生物工程、食品工业等方面[12-13]。它与正交
试验设计法不同，它通常是利用中心组合试验拟合
出一个完整的二次多项式模型，在试验设计与结果
表述方面更加优良，已广泛地应用于各类条件优化
实践中 [14-15]。本实验采用响应曲面法中的 Box-
Behnken 设计优化酶法辅助提取绞股蓝中总黄酮的
工艺参数。
1 仪器与材料

收稿日期：2010-08-19
基金项目：湖南省科技计划项目（2009FJ3028）
作者简介：欧阳辉（1979—），男，湖南省衡阳人，实验师，理学学士，主要从事天然生物活性成分研究。
Tel: 13117439981 E-mail: oyhmail@163.com
*通讯作者 李顺祥 Tel: (0731)88458229 E-mail: lishunxg@yahoo.com.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 5 期 2011 年 5 月 ·887·
UV—2450 紫外可见分光光度计（日本岛津公
司）、HH—2 数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）、
精密 pH 计（上海精密科学仪器有限公司）、ZK—
82A 型电热真空干燥箱（上海市实验仪器总厂）、
Es—10K 电子天平（长沙湘平科技发展有限公司）、
FA2004 型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。
绞股蓝产于湖南省湘西古丈县高峰乡，由吉
首大学生物资源与环境科学学院刘世彪教授鉴定
为 绞 股 蓝 Gynostemma pentaphyllum (Thunb.)
Makino 的全草。芦丁对照品（质量分数≥97%，批
号 1000802-200829）购于中国药品生物制品检定所；
纤维素酶（20 000 U/g，批号 200806）购于湖南尤
特尔有限公司；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 提取工艺
准确称取粉碎好、干燥至恒定质量的绞股蓝 5 g，
加纤维素酶和 95%乙醇 250 mL，在不同酶用量、酶
解温度、酶解时间和酶解 pH 值条件下处理后，调
pH 值至 9.0，升温至 90 ℃提取 1 h，离心去沉淀得
提取液，减压回收乙醇，浓缩成稠膏状，置真空干
燥箱干燥至恒定质量，得提取物。
2.2 总黄酮的测定
2.2.1 对照品溶液的制备 将芦丁对照品于 120
℃烘箱中烘至恒定质量，于干燥器中冷却后称取 10
mg 用 95%乙醇溶解，定容至 100 mL，得 0.100
mg/mL 芦丁对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取干燥至恒定质
量的提取物 5 mg，置 100 mL 量瓶中，用 95%乙醇
定容，摇匀，待测。
2.2.3 线性关系考察 准确吸取芦丁对照品溶液
0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL 于 25 mL 量瓶中，
加 5%亚硝酸钠 0.3 mL，放置 6 min，再加入 10%硝
酸铝 0.3 mL，放置 6 min 后加入 4% NaOH 溶液 10.0
mL，再用 95%乙醇定容，摇匀，以 95%乙醇为空
白参比，测定 510 nm 处吸光度值；以质量浓度对
吸光度值进行线性回归，得回归方程 Y＝0.097 X－
0.001，R2＝0.997，表明芦丁在 0.1～0.4 mg/mL 线
性关系良好。
2.2.4 样品总黄酮的测定 按“2.2.3”项下方法处
理供试品溶液，测定吸光度值，计算总黄酮质量分
数及总黄酮得率（总黄酮得率＝总黄酮的质量分数×
提取物的质量/绞股蓝质量）。
2.3 响应曲面优化试验设计及其结果
根据单因素试验确定的初步结果，采用响应面
法中的 Box-Behnken 设计，以酶用量（X1）、酶解温
度（X2）、酶解时间（X3）和酶解 pH 值（X4）4 个
因素为自变量，每个因素取 3 水平，分别以－1、0、
＋1 编码，以总黄酮得率为响应值，进行 4 因素 3
水平试验。因素与水平见表 1，结果见表 2。

表 1 因素与水平
Table 1 Factors and levers
因 素 水 平
X1/(U·mL−1) X2/℃ X3/ min X4
＋1 120 55 150 5.5
0 100 45 120 4.5
－1 80 35 90 3.5

表 2 Box-Behnken 设计及结果
Table 2 Design and results of Box-Behnken test
试验号 X1 X2 X3 X4 总黄酮得率/%
1 −1 −1 0 0 0.269
2 1 −1 0 0 0.275
3 −1 1 0 0 0.278
4 1 1 0 0 0.301
5 0 0 −1 −1 0.327
6 0 0 1 −1 0.332
7 0 0 −1 1 0.319
8 0 0 1 1 0.321
9 −1 0 0 −1 0.301
10 1 0 0 −1 0.327
11 −1 0 0 1 0.283
12 1 0 0 1 0.304
13 0 −1 −1 0 0.291
14 0 1 −1 0 0.321
15 0 −1 1 0 0.308
16 0 1 1 0 0.346
17 −1 0 −1 0 0.311
18 1 0 −1 0 0.332
19 −1 0 1 0 0.328
20 1 0 1 0 0.348
21 0 −1 0 −1 0.265
22 0 1 0 −1 0.290
23 0 −1 0 1 0.268
24 0 1 0 1 0.273
25 0 0 0 0 0.310
26 0 0 0 0 0.312
27 0 0 0 0 0.304
28 0 0 0 0 0.309
29 0 0 0 0 0.313
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使用统计软件Design Expert 7.16对表 2中总黄
酮得率数据进行多元回归拟合，得到总黄酮得率对
编码自变量 X1、X2、X3 和 X4 的二次多项回归方程
Y＝0.31＋0.009 75 X1＋0.011 X2＋0.006 8 X3－0.006 2
X4＋0.004 25 X1X2－0.000 25 X1X3－0.001 25 X1X4＋
0.002 X2X3－0.005 X2X4－0.000 75 X3X4－0.002 6 X12－
0.024 X22＋0.026 X32－0.008 467 X42。方差分析及回
归系数显著性检验结果见表 3。所建立的二次多项
模型具有高度的显著性（P＜0.00 1），模型决定系数
R2＝0.940 8，表明模型拟合度良好。

表 3 回归方程方差分析表
Table 3 Variance analysis of regression equation
方差来源 总 和 自由度 均 方 F 值 P 值 显著性
模型 0.014 333 14 0.001 024 15.902 34 ＜0.000 1 P＜0.001
X1 0.001 141 1 0.001 141 17.719 73 0.000 9 P＜0.001
X2 0.001 474 1 0.001 474 22.897 53 0.000 3 P＜0.001
X3 0.000 56 1 0.000 56 8.703 885 0.010 5 P＜0.05
X4 0.000 456 1 0.000 456 7.088 411 0.018 6 P＜0.05
X1X2 0.000 072 1 0.000 072 3 1.122 289 0.307 4
X1X3 0.000 000 25 1 0.000 000 25 0.003 883 0.951 2
X1X4 0.000 006 1 0.000 006 25 0.097 084 0.759 9
X2X3 0.000 016 1 0.000 016 0.248 534 0.625 8
X2X4 0.000 1 1 0.000 1 1.553 341 0.233 1
X3X4 0.000 002 25 1 0.000 002 25 0.034 95 0.854 4
X12 0.000 043 6 1 0.000 043 6 0.676 76 0.424 5
X22 0.003 765 1 0.003 765 58.480 34 ＜0.000 1 P＜0.001
X32 0.004 312 1 0.004 312 66.981 42 ＜0.000 1 P＜0.001
X42 0.000 465 1 0.000 465 7.222 726 0.017 7
残差 0.000 901 14 0.000 064 4
失拟项 0.000 852 10 0.000 085 2 6.927 507 0.038 6
纯误差 0.000 049 2 4 0.000 012 3
总和 0.015 234 28
R2＝0.940 8

通过求解回归方程，得到绞股蓝中总黄酮的最
佳提取工艺条件：酶用量 120 U/mL，酶解温度 49
℃，酶解时间 150 min，酶解 pH 值 3.9。由回归方
程预测总黄酮理论得率可达 0.355%。
2.4 验证试验
在上述响应面分析结果确定的最佳工艺条件下
进行 3 次提取试验，得到绞股蓝总黄酮的平均得率
为 0.357%（RSD＝1.13%），与预测值 0.355%吻合
良好。
2.5 酶法辅助提取与传统溶剂浸提法的比较
用确定的最佳工艺条件对绞股蓝中总黄酮进行
酶法辅助提取，同时采用传统溶剂浸提法对绞股蓝
中总黄酮进行提取。结果传统溶剂浸提法的总黄酮
得率为 0.266%，比酶法辅助提取的低 0.091%，绞
股蓝中总黄酮提取采用酶法辅助提取法要优于传统
溶剂浸提法。
3 讨论
本实验采用 Box-Behnken 试验设计法对纤维素
酶辅助提取绞股蓝总黄酮的工艺进行优化，并建立
了二次多项回归模型。通过对回归方程进行方差分
析表明，酶用量和酶解温度对绞股蓝总黄酮得率的
线性效应极显著，酶解时间和酶解 pH 值对绞股蓝
总黄酮得率的线性效应显著。但 4 因素之间交互效
应影响都不显著。优化后确定的酶法提取绞股蓝总
黄酮的最佳工艺条件为酶用量 120 U/mL，酶解温度
49 ℃，酶解时间 150 min，酶解 pH 值 3.9，此工艺
条件下的绞股蓝总黄酮得率为 0.357%。与传统溶剂
浸提法相比，酶法辅助提取绞股蓝中总黄酮的得率
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高约 25%。酶法辅助提取操作过程简单方便、提取
效果好，是一种高效提取方法。本研究为绞股蓝总
黄酮提取的工业化生产提供了理论基础，具有实际
的指导意义。
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《中国药学杂志》岛津杯第十届全国药物分析优秀论文评选交流会征文通知（第一轮）
为推动我国药物分析事业的发展，促进药物分析技术的交流，由中国药学会药物分析专业委员会主办、《中国药学杂志》
社承办、岛津国际贸易（上海）有限公司协办的《中国药学杂志》岛津杯第十届全国药物分析优秀论文评选交流会定于 2011
年 9 月下旬在上海举行。本届大会主题为:药物分析在药品质量、用药安全及新药研发中的应用。届时将邀请中国药学会领
导，药物分析专业委员会历届正、副主任委员及新一届全体药物分析专业委员会委员和有关专家参会。
1 征文内容
（1）近几年来国内外药物分析新理论、新技术、新方法；（2）现代分析手段和检测技术在药物分析中的应用；（3）中药
注射剂的质控和安全性研究;（4）化学药物、抗生素药品质量分析及研究；（5）中药、天然药物及制剂质量分析及研究；（6）
生物技术药品、生化药品质量分析及研究；（7）药用辅料、包装材料与药品质量分析研究；（8）药物血药浓度监测和药代动
力学；（9）药物生物利用度和溶出度的研究；（10）药物快速分析检定新方法、新技术；（11）毒物快速分析检定；（12）组
学（蛋白、代谢、细胞）分析检测方法研究；（13）计算机和数学在药物分析领域中的应用。
2 征文要求
（1）未公开发表及未在全国性会议上交流过，有一定的创新性。（2）论文体例、格式请参见《中国药学杂志》2011 年
第 1 期稿约。（3）应征论文被录用后，将通知作者，论文录用与否，一律不退稿，请自留底稿。（4）征文截止时间：2011
年 7 月 30 日（以邮戳为准）。稿件及信封请注明 “岛津杯征文 ”字样并附单位介绍信。同时将电子文件发至
daojinbei@yahoo.com.cn；zgyxzz@cpa.org.cn（标题请注明岛津杯征文）。
3 会议时间及地点
时间：2011 年 9 月下旬（暂定） 地点：上海（具体详见第二轮通知）
4 论文评奖
在本次会上对交流的论文将组织国内著名药物分析专家进行评奖，评选出优秀论文一等奖 3 名（3 000 元/名）、二等奖 6
名（2 000 元/名）、三等奖 10 名（1 000 元/名）。获得一、二等奖的论文在征得作者同意后将在《中国药学杂志》上发表。
5 联系地址及联系方式
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