全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 9 期 2012 年 9 月

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牡荆苷对人食管癌 EC-109 细胞生长及凋亡的影响
朱登祥，安 芳，王书华*
河北北方学院 药学系，河北 张家口 075000
摘 要：目的 观察金莲花中提取的牡荆苷体外对人食管癌 EC-109 细胞生长及诱导 EC-109 细胞凋亡的作用，探讨 p53 及
bcl-2 蛋白表达在牡荆苷抗肿瘤细胞机制中的作用。方法 用不同浓度牡荆苷作用于对数生长期的 EC-109 细胞，通过 CCK-8
法检测其对 EC-109 细胞体外生长、增殖的抑制作用；Hoechst33258 荧光染色观察细胞形态的变化；琼脂糖凝胶电泳检测
DNA 条带；AnnexinV-FITC/PI 双标法流式细胞术观察牡荆苷对 EC-109 细胞凋亡的诱导作用；流式细胞术检测 EC-109 细胞
中抑癌基因 p53和促癌基因 bcl-2蛋白的表达。结果 牡荆苷对EC-109细胞生长、增殖具有明显的抑制作用，能够诱导EC-109
细胞凋亡，且作用与牡荆苷浓度、作用时间呈正相关，可上调 p53 蛋白表达，下调 bcl-2 蛋白表达。结论 牡荆苷可能通过
上调 p53 蛋白和下调 bcl-2 蛋白的表达，促进 EC-109 细胞凋亡，抑制 EC-109 细胞生长。
关键词：金莲花；牡荆苷；人食管癌 EC-109 细胞；细胞凋亡；p53；bcl-2
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)09 - 1781 - 04
Effects of vitexin on cell growth and apoptosis of human esophageal cancer
EC-109 cells
ZHU Deng-xiang, AN Fang, WANG Shu-hua
Department of Pharmacy, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China
Abstract: Objective To observe the effects of vitexin extracted from the flowers and flower buds of Trollius chinensis on the cell
growth and apoptosis of human esophageal cancer EC-109 cells, and to investigate the effect of p53 and bcl-2 protein expression in
antitumor mechanism. Methods EC-109 cells in logarithmic growth phase were treated by vitexin at different concentration. The
inhibitory effects on the growth and proliferation of EC-109 cells in vitro were detected by CCK-8 method. The morphological
changes of cell nucleus were assayed by the cell death detection kit Hoechst33258, DNA bands were detected by agarose gel
electrophoresis, and the apoptosis rate of EC-109 cells induced by vitexin was examined using flow cytometry (FCM) with
AnnexinV-FITC/PI double-labled technique. The protein expression of p53 and bcl-2 of EC-109 cells was detected by FCM. Results
Vitexin had markedly inhibitory effect on the growth and proliferation of EC-109 cells, and the inhibitory rate increased with the
concentration increasing and reaction time prolonging. Vitexin could induce the apoptosis of EC-109 cells and the protein expression
of p53 was up-regulated while that of bcl-2 was down-regulated. Conclusion Vitexin could induce the apoptosis of EC-109 cells by
up-regulating the expression of p53 and down-regulating that of bcl-2.
Key words: Trollius chinensis Bunge; vitexin; human esophageal cancer EC-109 cells; apoptosis; p53; bcl-2

金莲花是毛茛科植物金莲花 Trollius chinensis
Bunge 的干燥花及花蕾，在临床上主要用于抗菌、
抗病毒。现代药理研究表明，金莲花总黄酮及其单
体牡荆苷具有抗氧化[1-2]、抗肿瘤等作用[3-5]。牡荆
苷在金莲花中的量较高[6]，与抗肿瘤作用较强的芹
菜素[7]具有相似的化学结构，然而金莲花中牡荆苷
抗肿瘤作用的研究鲜见报道。本研究观察牡荆苷对
人食管癌 EC-109 细胞的作用，探讨其作用机制，
为确定金莲花总黄酮抗肿瘤药效物质基础提供实验
依据。
1 材料
1.1 药品与试剂
牡荆苷，自制，经中国科学院核磁共振所化学
组进行结构鉴定，质量分数为 98.8%。RPMI 1640

收稿日期：2011-11-25
基金项目：张家口市科技局资助项目（11110015D）
作者简介：朱登祥（1966—），男，副教授，研究方向为中药有效成分提取及其抗肿瘤研究。Tel: 18932637829 E-mail: zhudx1966@163.com
*通讯作者 王书华 Tel: (0313)4029558 E-mail: shwang1988@yahoo.com.cn
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培养基，美国 Gibico 公司；胎牛血清（FCS），杭
州四季青生物工程材料有限公司；CCK-8 试剂盒，
上海玛芝佳公司；细胞凋亡 Hoechst33258 染色试剂
盒，晶美生物工程有限公司；Annexin V-FITC/PI 试
剂盒，碧云天试剂公司；胰蛋白酶，华北制药集团；
二甲基亚砜（DMSO），北京化学试剂厂；琼脂糖、
100 bp DNA Marker，北京六和同公司；FITC-p53、
PE-bcl-2，美国 BD 公司。
1.2 仪器
Spectra Max 全自动荧光酶标仪，美国分子仪器
有限公司；BioSpectrumAC System 凝胶成像系统，
美国 UVP 公司；FACS-Aria 流式细胞仪，美国 BD
公司；ECLIPSE Ti—U 荧光倒置显微镜，日本 Nikon
公司；3319型CO2培养箱，美国Forma公司；ME235S
电子天平，德国赛多利斯公司；SW—CJ—2FD 型
超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；TDL—
40B 型离心机，上海安亭科学仪器厂；DK—8A 型
电热恒温水浴槽，上海精宏实验设备有限公司；DH
4000A 型电热恒温箱，天津市泰斯特仪器有限公司。
1.3 细胞
人食管癌 EC-109 细胞株，购自北京肿瘤研究所
遗传室，经河北北方学院实验中心细胞室传代冻存。
2 方法
2.1 细胞培养
RPMI 1640 培养液用前加入 10% FCS、庆大霉
素 100 U/mL，碳酸氢钠调 pH 值至 7.2～7.4，加消
化液（0.25%胰酶-0.02% EDTA 1∶3）混合。人食
管癌 EC-109 细胞用含 10% FCS 的 RPMI 1640 培养
基于 37 ℃饱和湿度、5% CO2 条件下培养，取对数
生长期细胞进行实验。
2.2 CCK-8 法检测细胞增殖
实验设空白对照组、溶剂（0.2% DMSO）对照
组、牡荆苷（溶于 0.2% DMSO）5 个浓度组，每组
均设 5 个复孔。对数生长期的 EC-109 细胞消化、
计数，取 100 μL 单细胞悬液加入 96 孔板，每孔细
胞 1×105 个。细胞贴壁后吸去上清，牡荆苷各浓度
组加入 100 μL 培养液稀释后的牡荆苷，使其终浓度
分别为 5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L，空白
对照组加等量培养液，溶剂对照组加入等量 DMSO
（终体积分数 0.2%）培养液。分别培养 24、48、72 h，
每孔加入 CCK-8 液 10 μL，继续培养 4 h，采用全
自动酶联免疫检测仪在 450 nm 波长处测定吸光度
（A）值，计算细胞增殖抑制率。
抑制率＝1－药物组A值／空白对照组A 值
2.3 Hoechst33258 染色法观察 EC-109 细胞形态
实验设对照组，牡荆苷 5.0、20.0、80.0 μmol/L
组。EC-109 细胞以每孔 900 μL（含 5×103 细胞）
接种于 24 孔培养板培养 6 h，细胞贴壁后 3 个给药
组加入不同浓度的牡荆苷 100 μL，使其终浓度分别
为 5.0、20.0、80.0 μmol/L，对照组加等量空白培养
液。培养 48 h 后 Hoechst33258 染色，紫外光激发
波长 340 nm，荧光显微镜（×400）下观察、拍照。
2.4 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 条带
实验分组同“2.3”项。EC-109 细胞以 1×106/mL
接种于 20 mL 培养瓶中，每瓶 2.5 mL，待细胞贴壁
后，3 个给药组加入牡荆苷，使其终浓度分别为 5.0、
20.0、80.0 μmol/L，对照组加等量空白培养液。培
养 48 h 后收集细胞，用 PBS 洗 3 次，此后细胞移
入 1.5 mL EP 管中，加裂解液 615 μL，70 ℃水浴振
荡 15 min，操作重复 2 次。离心取上清液 500 μL，
加无水乙醇 1 000 μL 使 DNA 析出，离心后用 TE
缓冲液（pH 7.4）20 μL 溶解 DNA，按照试剂盒操
作说明进行琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像系统观
察并拍照。
2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡
分组、给药与细胞培养时间同“2.4”项，每组
设 5 个复孔。各组收集 EC-109 细胞 1×106个，离
心，弃上清，用冷 PBS 洗涤 2 次，按照 Annexin
V-FITC/PI 染色试剂盒说明操作，分别加入缓冲液
185 μL、Annexin V 10 μL、PI 5 μL，混匀，避光 20
min，离心后弃去上清液，再加入冷 PBS 洗涤 1 次，
用 PBS 400 μL 悬浮细胞，流式细胞仪检测细胞早期
凋亡率。
2.6 流式细胞仪检测 p53 和 bcl-2 蛋白表达
EC-109 细胞按 1×106/mL 接种于 20 mL 培养
瓶，待细胞贴壁后，3 个给药组加入牡荆苷，使其
终浓度分别为 5.0、20.0、80.0 μmol/L，设空白对照
组，每组 5 个复孔。培养 48 h 后收集细胞，分别加
入 FITC-p53 及 PE-bcl-2 各 20 μL，培养 20 min，流
式细胞仪检测。
2.7 统计学处理
数据以 ±x s 表示，应用 SPSS 16.0 统计软件进
行方差分析。
3 结果
3.1 对 EC-109 细胞生长的抑制作用
结果显示，DMSO 对细胞活性及增殖几乎没有
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影响，最大抑制率＜1%，故此后实验不再设溶剂对
照组。在同一检测时相，牡荆苷对 EC-109 细胞生
长的抑制率随药物浓度的增加而增大（P＜0.05）；
在不同检测时相，同一浓度的牡荆苷对 EC-109 细
胞生长的抑制率随时间的延长而增大（P＜0.05）。
牡荆苷 80.0 μmol/L（35.6 mg/L）作用 EC-109 细胞
24 h，对 EC-109 细胞生长的抑制率为 20.08%；而
前期研究显示金莲花总黄酮（793.0 mg/L）作用
EC-109 细胞 24 h，对 EC-109 细胞生长的抑制率为
28.00%[4]，提示牡荆苷可能是金莲花总黄酮抑制
EC-109 细胞生长的药效物质之一，且其抗肿瘤活性
优于金莲花总黄酮。结果见表 1。
3.2 对 EC-109 细胞形态的影响
对照组 EC-109 细胞核大小较均一，呈圆形或
椭圆形，染色质分布均匀，在紫外线下呈均一的蓝
色荧光，可见处于分裂期的细胞。经牡荆苷处理的
EC-109 细胞出现典型的凋亡形态学改变，即胞体缩
小、核染色质染色明亮，核浓缩、分叶、边集、核
染色质碎裂，且随着药物浓度增大，凋亡细胞数逐
渐增多。结果见图 1。
3.3 对 EC-109 细胞 DNA 条带的影响
对照组 EC-109 细胞未出现梯形 DNA 条带；与
对照组相比，牡荆苷 80.0 μmol/L 组 EC-109 细胞出
现明显的 DNA 条带，牡荆苷 20.0、5.0 μmol/L 组的
DNA 条带虽较模糊、变暗，但与对照组相比也有较
明显的差异。结果见图 2。
表 1 牡荆苷对 EC-109 细胞增殖的影响 ( 5=± n , sx )
Table 1 Effects of vitexin on proliferation of EC-109 cells
( 5=± n , sx )
抑制率 / % 组别
C /
(μmol·L−1) 24 h 48 h 72 h
牡荆苷 5.0 2.24±0.11*▲ 4.82±0.33*▲ 8.28±0.36*▲
10.0 3.67±0.26*▲ 8.06±0.32*▲ 14.65±0.56*▲
20.0 8.35±0.44*▲ 15.02±0.30*▲ 26.70±0.52*▲
40.0 13.43±0.51*▲ 21.90±0.60*▲ 33.04±0.63*▲
80.0 20.08±1.16*▲ 31.60±1.45*▲ 38.30±1.24*▲
DMSO － 0.66±0.23 0.58±0.15 0.49±0.44
同一时相不同浓度组间比较：*P＜0.05
不同时相同一浓度间比较：▲P＜0.05
*P < 0.05 vs vitesin groups at different concentration, same phase
▲P < 0.05 vs different phases of same concentration of vitexin

图 1 牡荆苷对 EC-109 细胞形态的影响
Fig. 1 Effects of vitexin on morphological changes of cell nucleus of EC-109 cells

图 2 牡荆苷对 EC-109 细胞 DNA 条带的影响
Fig. 2 Effects of vitexin at different concentration
on DNA bands of EC-109 cells
3.4 对 EC-109 细胞凋亡的影响
AnnexinV-FITC/PI 双标法检测结果显示，不同
浓度的牡荆苷均可诱导 EC-109 细胞凋亡，凋亡率
随牡荆苷浓度的升高而增大，与对照组比较差异显
著（P＜0.05），且牡荆苷不同浓度组间 EC-109 细胞
凋亡率比较也有显著差异（P＜0.05）。结果见表 2
和图 3。
3.5 对 EC-109 细胞 p53 和 bcl-2 蛋白表达的影响
与对照组相比，不同浓度的牡荆苷作用于
EC-109 细胞 48 h 后，EC-109 细胞 p53 蛋白表达显
著增强，bcl-2 蛋白表达明显降低，并呈浓度相关性
（P＜0.05）。结果见表 3。

对照 牡荆苷 5.0 μmol·L−1 牡荆苷 20.0 μmol·L−1 牡荆苷 80.0 μmol·L−1

2 000 bp
1 500 bp
1 200 bp
1 000 bp
300 bp
200 bp
Marker 对照 80.0 20.0 5.0
牡荆苷 / μmol·L−1
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表 2 牡荆苷对 EC-109 细胞凋亡的影响 ( ± = 5x s , n )
Table 2 Effects of vitexin on apoptosis of EC-109 cells
( ± = 5x s , n )
组 别 C / (μmol·L−1) 细胞凋亡率 / %
对照 － 0.64±0.12
牡荆苷 5.0 1.68±0.15*▲
20.0 3.83±0.22*▲
80.0 12.38±0.42*▲
与对照组比较：*P＜0.05；不同浓度牡荆苷比较：▲P＜0.05，下表同
*P < 0.05 vs control group; ▲P < 0.05 vs vitexin groups at different
concentration, same as below
4 讨论
本实验结果表明，牡荆苷浓度为 5.0、20.0、80.0
μmol/L，明显抑制人食管癌 EC-109 细胞生长，药
物浓度越高、培养时间越长，抑制率越高。从时-
效走势看，在同一检测时相，高浓度组给药初期作
用即明显，且随给药浓度的增加，抑制率增大，但
未呈现浓度-效应的线性正比关系，提示理想的药物
浓度为 5.0～80.0 μmol/L。同一浓度的牡荆苷在不同
检测时相对EC-109细胞抑制率由小到大依次为 24
h＜48 h＜72 h，也未呈现线性正比关系，48 h 与 24 h、

图 3 牡荆苷对 EC-109 细胞凋亡的影响
Fig. 3 Effects of vitexin on apoptosis of EC-109 cells
表 3 牡荆苷对 EC-109 细胞 p53 和 bcl-2 蛋白表达的影响
( ± = 5x s , n )
Table 3 Effects of vitexin at different concentration on p53 and
bcl-2 protein expression of EC-109 cells ( ± = 5x s , n )
组 别 C / (μmol·L−1) p53 / % bcl-2 / %
对照 － 1.74±0.11 3.61±0.13
牡荆苷 5.0 2.95±0.14*▲ 3.48±0.07▲
20.0 7.23±0.05*▲ 1.79±0.06*▲
80.0 14.06±0.07*▲ 0.89±0.09*▲
48 h 与 72 h 比较，抑制率均有显著差异，提示研究
EC-109 细胞早期凋亡，在药物作用细胞 48 h 后的
检测结果较好，所以此后牡荆苷对细胞凋亡影响的
实验选择药物作用时间为 48 h。
在细胞早期凋亡发生时，细胞核内 NDA 可控
制降解，形成不同长度的核酸片段，这与细胞坏死、
DNA 降解不同，所以 DNA 条带的出现提示细胞凋
亡发生。本实验结果还表明，牡荆苷具有诱导
EC-109 细胞凋亡的作用且与浓度相关，但流式细胞
仪检测显示，随着凋亡细胞数量的增多，死亡细胞
数目也同步增加，这种现象有待进一步研究。
细胞内与凋亡有关的基因分为诱导凋亡基因和
抑制凋亡基因 2 类，药物诱导肿瘤细胞凋亡和坏死
受一个或多个基因的调控。本实验结果表明，牡荆
苷可上调抑癌基因 p53、下调促癌基因 bcl-2 蛋白的
表达，从而诱导 EC-109 细胞凋亡。
综上，牡荆苷对人食管癌 EC-109 细胞生长具有
抑制作用，诱导其出现早期凋亡。牡荆苷作为新型
抗食管癌候选药物，具有深入研究的价值和较好的
开发前景。
参考文献
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PE

FITC-A
对照组 牡荆苷 5.0 μmol·L−1 牡荆苷 20.0 μmol·L−1 牡荆苷 80.0 μmol·L−1
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Q3 Q4
Q1 Q2
Q3 Q4
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