全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 14 期 2013 年 7 月

·1974·
• 药材与资源 •
金荞麦黄酮醇合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
蒋 洁，白悦辰，李成磊，陈 惠，吴 琦*
四川农业大学生命科学与理学院，四川 雅安 625014
摘 要：目的 克隆金荞麦黄酮醇合酶（FdFLS）基因的编码序列，并对该基因进行序列分析、原核表达及其活性研究。方
法 采用同源克隆技术获得 FdFLS 基因 cDNA 序列，并对其进行生物信息学分析；构建 FdFLS 原核表达载体 pET-30b
(＋)-FdFLS，在大肠杆菌 BL21（DE3）中诱导表达，并测定目标蛋白的酶学活性。结果 FdFLS 基因开放阅读框（ORF）
全长 1 008 bp，编码 334 个氨基酸；FdFLS 基因在大肠杆菌中可表达出相对分子量约 4×104的蛋白，并具有将二氢槲皮素和
二氢山柰酚转化为槲皮素和山柰酚的催化活性。结论 首次克隆到 FdFLS 基因，并实现该基因在大肠杆菌中有活性的表达。
关键词：金荞麦；黄酮醇合酶；基因克隆；原核表达；序列分析
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)14 - 1974 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.14.020
Cloning of flavonol synthase gene from Fagopyum dibotrys and its expression
in Escherichia coli
JIANG Jie, BAI Yue-chen, LI Cheng-lei, CHEN Hui, WU Qi
College of Life Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China
Abstract: Objective To clone the coding sequence of flavonol synthase gene from Fagopyum dibotrys (FdFLS) and to analyze its
sequence, prokaryotic expression, and activity. Methods The cDNA sequence of FdFLS gene was obtained by homology cloning and
analyzed by bioinformatic method; The FdFLS prokaryotic expression vector pET-30b (+)-FdFLS was established and induced to
express in Escherichia coli BL21 (DE3), as well as the enzymatic activity of the target protein was measured. Results The full length
of open reading frame (ORF) of FdFLS gene was 1 008 bp that encoded a protein of 334 amino acids; The recombinant FdFLS protein
had a relative molecular mass of 40 000. It also has a catalytic activity, which could make dihydroquercetin and dihydrokaempferol into
quercetin and kaempferol, respectively. Conclusion The FdFLS gene is successfully cloned and reported for the first time, which has
an active expression in E. coli.
Key words: Fagopyum dibotrys (D. Don) Hara; flavonol synthase; gene cloning; prokaryotic expression; sequence analysis

多年生草本植物金荞麦 Fagopyum dibotrys (D.
Don) Hara 属双子叶蓼科（Polygonaceae）荞麦属
Fagopyum Mill，又名野荞麦、荞麦当归等，主要分
布于我国西南地区、湖北及江苏等地[1]。《本草纲目》
中记载金荞麦，性寒、味苦、酸涩。金荞麦块根入
药能祛风利湿、清热解毒、止泻健脾、补肾润肺[2]，
其主要药用化学成分有黄酮类、甾类、萜类和苷类
等[3]。作为黄酮类化合物最具代表性之一的芦丁（槲
皮素 3-O-芸香糖苷），不仅在抗炎、抗癌和保护血
管等方面起重要作用[4]，还具有如抗 UV-B、抗氧化
性和抗病性等生理功能[5]。
黄酮醇中的槲皮素和山柰酚经类黄酮-3′-羟化
酶（F3′H）和类黄酮-3′, 5′-羟化酶（F3′5′H）在黄酮
B 环不同位置羟化而得到[6]。黄酮醇合酶（FLS）则
与 F3′5′H 和 F3′H 共同竞争二氢黄酮醇作为底物，
通过氧化反应形成槲皮素和山柰酚，槲皮素和山柰
酚进一步糖基化形成芦丁[7-8]。FLS 基因首先发现于
欧芹中并鉴定为 2-ODD 家族[9]。随后，又在不同的
植物体中克隆得到了 FLS 的 cDNA。研究表明，FLS
是由多拷贝基因编码而且在不同植物中其拷贝数不
同[10-13]。
基于FLS在黄酮类化合物生物合成中所起的重

收稿日期：2013-02-23
作者简介：蒋 洁（1991—），女，生物工程专业学生。E-mail: jiangjiejj@yahoo.cn
*通信作者 吴 琦 E-mail: wuqiwq@yahoo.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 14 期 2013 年 7 月

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要作用，本实验采用同源克隆方法克隆了金荞麦黄酮
醇合酶（FdFLS）基因的全长 cDNA 编码序列，并实
现其在大肠杆菌中有活性的表达。这将有助于对金荞
麦黄酮类物质生物合成途径分子基础的深入了解。
1 材料与试剂
金荞麦 Fagopyum dibotrys (D. Don) Hara 于 2012
年 10 月采自四川雅安老板山，大肠杆菌 DH5α、原核
表达载体 pET-30b (＋) 和大肠杆菌 BL21（DE3）由
本实验室保存。RNA 提取试剂植物 RNAout 试剂盒购
自天泽基因工程有限公司；逆转录试剂盒RevertAidTM
First Strand cDNA Synthesis Kit 购自 Fermentas 公司；
pMD 20-T Simple Vector 克隆载体、Taq DNA 聚合酶、
T4 DNA 连接酶和限制性内切酶均购自大连宝生物公
司（Takara）；其他化学药品为进口或国产分析纯试剂。
2 方法
2.1 FdFLS 基因 cDNA 完整开放阅读框（ORF）序
列的克隆
采用植物 RNAout 试剂盒提取金荞麦新鲜花期
总RNA。然后以其为模板，多聚胸腺嘧啶（Oligo-dT）
为引物，通过 RevertAidTM First Strand cDNA
Synthesis Kit 逆转录试剂盒制备 cDNA 第一链。采
用同源克隆的方法，参照苦荞 FtFLS（ID JF274262）
基因序列设计一对引物 FdFLSf：5’-ATGGAGGTA
GAGAGAGTGCAAGCTATT-3’，FdFLSr：5’-TTACT
GGGGTAGTTTGTTGAGCTTGCA-3’。以金荞麦总
cDNA 为模板，进行 PCR。PCR 反应体系总体积为
50 μL，含 cDNA 模板 2.5 μL、10 mmol/L 引物各 4
μL、dNTP Mix 4 μL、5×Buffer 10 μL、高保真酶
（PrimeSTAR HS Polymerase）0.5 μL 和无菌去离子
水 25 μL。反应参数：94 ℃ 50 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 50
s，30 个循环；72 ℃ 10 min。产物经琼脂糖凝胶电
泳回收，按照 DNA A-Tailing Kit 试剂盒说明书对
PCR 产物进行加 A，然后克隆到 pMD 20-T Simple
Vector，筛选阳性克隆送英骏公司测序。
2.2 FdFLS 生物信息学分析
采用NCBI在线工具Blast和DNAman对FdFLS
核苷酸序列和蛋白质序列的同源性进行分析，氨基
酸序列二级结构采用 SOMPA 进行预测，采用
Swiss-Model 建立蛋白质三级结构， Swiss-Pdb
Viewer 4.0 软件进行图像处理，采用 MEGA4.1 经邻
接法构建系统发育进化树。
2.3 FdFLS 在大肠杆菌中的表达
根据 FdFLS 基因序列和原核表达载体
pET-30b (＋) 多克隆位点序列，设计一对引物：Ff
5’-TCCATATGGAGGTAGAGAGAGTGCAAGCT-3’
（含 NdeⅠ酶切位点），Fr 5’-CCAAGCTTCTGGG
GTAGTTTGTTGAGCTT-3’（含 Hind III 酶切位点）。
以 FdFLS cDNA 为模板进行 PCR，扩增产物经 Nde
I 和 Hind III 酶切后，连接到 pET-30b (＋) 载体并
转化大肠杆菌，重组质粒经鉴定后命名为 pET-30b
(＋)-FdFLS。重组质粒 pET-30b (＋)-FdFLS 转化
大肠杆菌 BL21（DE3），挑取阳性克隆单菌落接
种到 LB 液体培养基中（卡那霉素 50 mg/L），37
℃振荡培养过夜。按 2%的接种量接种到 50 mL LB
液体培养基中（卡那霉素 50 mg/L），37 ℃振荡培
养至 A600 达到 0.6，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半
乳糖苷（IPTG）至终浓度为 1 mmol/L，25 ℃诱导
8 h。收集诱导 0、1、2、4、6、8 h 菌液进行 SDS-PAGE
电泳分析。
2.4 FdFLS 活性测定
将不同质量浓度（0.5、1、2、3、5、7、9、12、
15 μg/mL）的山柰酚和槲皮素溶于反应缓冲液中（含
111 mmol/L 乙酸钠，83 μmol/L 2-酮戊二酸，42
μmol/L 硫酸亚铁，2.5 mmol/L 维生素 C），使用紫
外可见分光光度计（Shimadz，日本）以 0.5 cm 的
光径进行全波段扫描测得山柰酚和槲皮素的最佳特
征吸收峰分别为 367 nm 和 365.5 nm[14]。以山柰酚
或槲皮素的不同质量浓度为横坐标，最佳特征吸收
峰吸光度（A）值为纵坐标，建立标准曲线。FdFLS
活性测定反应体系如下：以 100 μmol/L 二氢槲皮素
或二氢山柰酚作为底物，50 μL 粗酶液，111 mmol/L
乙酸钠，83 μmol/L 2-酮戊二酸，42 μmol/L 硫酸亚
铁，2.5 mmol/L 维生素 C，总反应体系为 500 μL，
37 ℃反应 20 min。酶活力单位采用国际酶单位
（IU），既以每分钟生成 1 μmol 槲皮素或山柰酚的酶
量为 1 个国际单位[15]。
3 结果与分析
3.1 FdFLS cDNA 的克隆
提取的金荞麦花总 RNA 经 2%琼脂糖凝胶电
泳，结果显示所得 RNA 质量较高，28S∶18S 接近
2∶1，无降解与总 DNA 污染。以金荞麦 cDNA 为
模板，特异引物 FdFLSf 和 FdFLSr 进行 PCR 扩增，
得到约 1 000 bp 的特异条带（图 1）。
3.2 FdFLS 序列分析
FdFLS基因 cDNA序列含1个1 008 bp的ORF，
编码 335 个氨基酸构成的蛋白质。经 Blast 分析表
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M-Maker III 1-PCR 扩增产物
图 1 FdFLS ORF 扩增琼脂糖凝胶电泳结果
Fig. 1 Agrarose gel electrophoresis of ORF
amplification in FdFLS
明，FdFLS 核苷酸序列与苦荞和甜荞相似率最高均
为 98% ， 与 拟 南 芥 （ AM887658.1 ）、 葡 萄
（AB213565.1）、草莓（DQ834905.1）等的相似率在
75%以上，而与其他植物的相似率较低。表明成功
获得 FdFLS ORF 序列。
FdFLS 蛋白分子式为 C1734H2696N446O501S12，理
论相对分子质量为 3.819×104，等电点值为 5.70。
二级结构预测结果表明，FdFLS 含 31.73%的 α-螺
旋，18.56%的 β-转角，49.70%的不规则卷曲。选取
与金荞麦同属的苦荞麦 FtFLS、甜荞麦 FeFLS，双
子叶模式植物拟南芥 AtFLS 以及单子叶植物葡萄
VvFLS 进行基于 FdFLS 氨基酸序列的多重序列比
对（图 2），FdFLS 与其他 4 个 FLS 相比其氨基酸
序列较为保守，未在氨基酸序列的 C 端和 N 端发

直线-不规则卷曲 箭头-β片层 矩形条带- α-螺旋 实线框-conserved domain A 虚线框-conserved domain B
Straight line-irregular curl Arrow-extended-β layer Rectangular strip-α-helix Solid box-conserved domain A Dashed box-conserved domain B
图 2 金荞麦 FdFLS 多重序列比对
Fig. 2 Sequence multi-alignment of FdFLS
现较大变异区域。同时，作为 2-ODD 家族的 FdFLS
也含有保守区 A 和 B 2 个保守的功能区域。此外，
His221、Asp223和 His277 是典型的 Fe2+离子结合位点，
Arg287 和 Ser289 为 2-酮戊二酸结合位点。采用
Swiss-Model 对 FdFLS 蛋白质三维结构进行同源建
模，以拟南芥花青素合酶结晶结构为模型建立三维
结构，两者相似度为 43%。
3.3 FdFLS 系统进化树的构建
采用 MEGA 5.0 软件构建基于植物 FLS 氨基酸
序列的系统进化树（图 3）。结果表明，该进化树分

M 1
4 500 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 200 bp
800 bp
500 bp
200 bp
FdFLS
FtFLS
FeFLS
VvFLS
AtFLS

FdFLS
FtFLS
FeFLS
VvFLS
AtFLS

FdFLS
FtFLS
FeFLS
VvFLS
AtFLS

FdFLS
FtFLS
FeFLS
VvFLS
AtFLS

FdFLS
FtFLS
FeFLS
VvFLS
AtFLS
70
70
70
70
70
140
140
140
140
140
210
210
210
210
210
280
280
280
280
280
335
335
335
335
335
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图 3 FdFLS 与其他植物 FLS 氨基酸序列的系统进化树
Fig. 3 Phylogenetic tree of FdFLS and FLS of other amino acids
为 2 个主要的簇 I 和 II。簇 I 由不同的双子叶植物
FLS 组成，其中矮牵牛、香芹、金鱼草、苦荞、大
豆等的 FLS 的生物学功能得到验证。同是来自蓼科
荞麦属的 FtFLS、FeFLS 和 FdFLS 高度同源。簇 II
由模式植物拟南芥、裸茎条果芥、紫罗兰和部分单
子叶植物以及少量裸子植物的 FLS 组成，FLS 在不
同的植物中的同源性较低，进化模式也不确定，所
以推测其在这些物种中有种属特异性存在。分析表
明大多数双子叶植物的FLS在氨基酸序列上有较高
的同源性，一些物种其复制和演变可能发生在双子
叶植物进一步分化之前。
3.4 FdFLS 的诱导表达
将酶切鉴定和序列测定后的重组质粒 pET-30b
(＋)-FdFLS 转化大肠杆菌 BL21（DE3），经 IPTG 的
诱导表达后进行 SDS-PAGE 分析。结果表明，重组
质粒 pET-30b (＋)-FdFLS 新生成了一条相对分子质
量约 4.0×104 的新生条带，与理论相对分子质量一
致；目的蛋白的表达量随诱导时间，逐渐增加（图 4）。
3.5 FdFLS 活性的测定
山柰酚的回归方程为 A＝0.027 4 C（A 表示光
吸收值，C 表示浓度，μg/mL），R2＝0.996 8；槲皮
素的回归方程为 A＝0.030 0 C，R2＝0.997 6。测定
结果表明，FdFLS 以二氢山柰酚和二氢槲皮素为底
物，其酶活力分别为 6.86×10−5 IU/μL和 7.12×10−5
IU/μL。

M-蛋白 Marker N1、N2-pET-30b (＋) 空载体诱导前后
1～6-pET-30b (＋)-FdFLS 经诱导 0、1、2、4、6 和 8 h
M-protein Marker N1 and N2-before and after induction of
pET-30b (+) zero loading vectors 1－6- 0, 1, 2, 4, 6, and 8 h after
pET-30b (+)-FdFLS induction
图 4 FdFLS 在大肠杆菌中的诱导表达
Fig. 4 Induced expression of FdFLS in E. coli
4 讨论
作为 2-ODD 家族的 FLS、黄烷酮-3-羟化酶
（F3H）、黄酮合酶（FNS）、花青素合酶（ANS），此
4 个结构基因参与了黄酮类化合物的生物合成[8]。通
过与其他生物的 FLS 比较，FdFLS 具有典型的保守
活性位点，且位于保守区A的His75具有边际效应[16]，
若位于保守区 B 的 Pro75突变成 Ala 或 Gly 将引起酶
活的降低[17]。在其三维结构中 N 端第一个 α-螺旋的
缺失可能会引起其活性的丢失，在拟南芥
AtFLS1-AtFLS6 中，此部位的突变或缺失将会造成
表达产物的失活[18]。可见，FdFLS 中所有的分子特征
皆表明其为一可催化二氢黄酮醇生成黄酮醇的酶。
Wellmann 等[19]研究表明，柑橘中 FLS 对二氢
山柰酚（Km 45 μmol/L）的底物亲和力大于二氢槲
皮素（Km 272 μmol/L）；玉米中 ZmFLS1 则更趋向
于二氢山柰酚（Km 58 μmol/L）为底物而不是二氢
槲皮素（Km 151 μmol/L） [20]；而来自拟南芥的
AtFLS 却更加偏爱二氢山柰酚[21]。本研究表明，
FdFLS 对二氢槲皮素的催化活力略大于二氢山柰
酚，表明金荞麦中芦丁的合成可能是通过二氢山
柰酚经 F3′H 羟基化为二氢槲皮素，再由二氢槲皮
素氧化为槲皮素，最后糖基化成芦丁。这一通路
与苦荞一致，但 FdFLS 对二氢黄酮醇的催化活性
明显低于苦荞麦 FtFLS，故其具体机制有待进一
步研究。
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赛亚麻
矮牵牛
烟草
马铃薯
三花龙胆
香芹
金花茶
金鱼草
金荞
苦荞
甜荞
大豆
蝶豆
西洋梨
蓖麻
三枝九叶草
日本蜜柑
杨毛果
高粱
水稻
紫罗兰
裸茎条果芥
拟南芥
葡萄
银杏
北美云杉
大麦
玉米
58
81
100
61
46
33
83
98
58
96
65
88
100
87
100
77
49
59
97
100
97
100
40
100
100
9.40×104
6.62×104
4.50×104
3.30×104
2.60×104
2.00×104
1.44×104
FdFLS
M N1 N2 1 2 3 4 5 6
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