全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 6 期 2011 年 6 月

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脱水穿心莲内酯在 Caco-2 细胞单层模型中的吸收机制
姚 媛 1, 2，廖琼峰 1*，谢智勇 3，曾元儿 1，马 燕 1
1. 广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006
2. 广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405
3. 中山大学药学院，广东 广州 510006
摘 要：目的 研究脱水穿心莲内酯（DAL）在 Caco-2 细胞单层模型中的吸收机制。方法 观察 DAL 在 Caco-2 细胞单层
模型中的双向转运，考察时间、DAL 浓度、温度和 P-糖蛋白（P-gp）抑制剂维拉帕米对 DAL 吸收的影响。采用 LC/MS/MS
方法检测 DAL 浓度，计算其表观渗透系数（Papp）。结果 DAL 在 Caco-2 细胞模型中的双向转运，随时间和浓度的增加，
DAL 的吸收具有时间、浓度依赖性，未出现饱和趋势；不受温度和 P-gp 抑制剂维拉帕米的影响。结论 DAL 在 Caco-2 细
胞模型中的吸收主要是靠浓度扩散的被动转运。
关键词：脱水穿心莲内酯；Caco-2 细胞模型；被动转运；维拉帕米；LC/MS/MS
中图分类号：R285.61 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)06 - 1154 - 04
Absorption mechamism of dehydroandrographolide in human Caco-2 cell
monolayer model
YAO Yuan1, 2, LIAO Qiong-feng1, XIE Zhi-yong3, ZENG Yuan-er1, MA Yan1
1. College of Chinese Traditional Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China
2. The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China
3. School of Pharmaceutical Science, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China
Abstract: Objective To study the absorption mechanism of dehydroandrographolide (DAL) in human Caco-2 cell monolayer
model. Methods Caco-2 cell monolayer model was applied to investigate the bidirectional transport of DAL. The effects of time,
drug concentration, temperature, and P-gp inhibitor (Verapamil) on the absorption of DAL were observed. Drug concentration was
measured by LC/MS/MS and the apparent permeability coefficients (Papp) were calculated. Results With the time and concentration
increasing, the bidirection transport of DAL in Caco-2 cell monolayer model was of time and concentration dependence, without
saturation. And it was not influenced by the change of temperature and the presence of Verapamil. Conclusion The absorption and
transport of DAL are passive diffusion as the dominating process in Caco-2 cell monolayer model.
Key word: dehydroandrographolide (DAL); Caco-2 cell monolayer model; passive diffusion; Verapamil; LC/MS/MS

脱水穿心莲内酯（ dehydroandrographolide，
DAL）是常用中药穿心莲 Andrographis paniculata
(Burm. f.) Nees 的主要有效成分。现代药理研究表
明[1-2]，DAL 及其衍生物具有抗炎、抗菌、抗心血
管疾病等药理作用。但目前有关 DAL 药动学的报
道大多是关于药材或制剂中 DAL 药动学的，结果
不尽相同[3-6]，有文献报道指出 DAL 单体在大鼠体
内比穿心莲片中 DAL 的吸收慢、消除快、生物利
用度低。而关于 DAL 的吸收机制研究并未见报道，
在一定程度上限制了 DAL 的开发。Caco-2（human
colon androcarcinoma cell line）细胞单层模型是目前
国内外广泛应用的体外吸收模型，已迅速发展成为
研究药物吸收的可靠手段[7-10]，并已获美国 FDA 批
准用作药物吸收筛选模型。本实验用 Caco-2 细胞单
层模型研究 DAL 的吸收机制，考察时间、DAL 浓
度、双向转运、温度和 P-糖蛋白（P-gp）抑制剂维
拉帕米对 DAL 转运的影响，旨在为穿心莲二萜内
酯类成分的药动学研究提供参考。

收稿日期：2010-10-26
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30600823）
作者简介：姚 媛（1984—），女，广东汕头人，硕士，研究方向为中药质量标准研究及中药药动学。E-mail: flyaoyuan_1984@126.com
*通讯作者 廖琼峰 Tel: (020)39358081 E-mail: liaoqf2075@yahoo.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 6 期 2011 年 6 月

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1 材料
1.1 药品与试剂
DAL（中国药品生物制品检定所，批号 110854-
200306，质量分数大于 98%），甲醇（色谱纯，Merck
公司），DMEM 培养基（Gibico 公司），胎牛血清
（Excell），非必需氨基酸（Hyclone）、L-谷氨酰胺
（MBchem 公司），胰蛋白酶-0.25% EDTA（Sigma
公司），水为 Milli-Q 超纯水，其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器
96 孔普通培养板、12 孔 Transwell 板（Corning
公司）。TGL—16B 飞鸽高速离心机（上海安亭科学
仪器厂），CU—600 电热恒温水槽（上海齐欣科学
仪器有限公司），CO—150 型 INNOVA CO2 培养箱
（美国 NBS 公司），Millicell-ERS 跨膜电阻仪（美国
Millipore 公司），IX51 型倒置显微镜（日本 Olympus
公司），LC-MS 系统（美国 Finnigan 公司）：Surveyor
MS Pump 液相色谱输液泵、Surveyor Autosampler
自动进样器、Xcalibur 1.3 数据采集软件。
2 方法
2.1 细胞培养
Caco-2 细胞（美国 ATCC）培养于 DMEM 培
养液中，培养基含 10%胎牛血清、1%非必需氨基酸
及 100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素双抗液，
于 37 ℃、5% CO2 环境中培养。细胞接种在 12 孔
Transwell 板上，接种密度为每孔 1×105 个/mL，培
养约 21 d 后，细胞形成紧密单层，可用于实验[11]。
2.2 MTT 法检测 DAL 对 Caco-2 细胞的抑制作用
取对数生长期的 Caco-2 细胞，调整细胞密度至
1×105 个/mL，每孔加 200 μL 细胞悬液接种于 96
孔培养板，培养 24 h 后换液，实验组加入含 DAL
（浓度分别为 6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L）
的培养液，对照组以及空白组只加培养液，每组设
4 个复孔，继续培养 24 h 后每孔加入 20 μL MTT（5
mg/mL），再培养 4 h 后吸弃孔内培养液，每孔加 150 μL
DMSO 溶液，将 96 孔板置于双层空气恒温振荡器
中，以转速 50 r/min 振荡 10 min，使结晶物 Formazan
充分溶解，在酶标仪上选择波长 570 nm 处，空白孔
调零，测定吸光度（A）值。计算细胞存活率（细胞
存活率＝实验组 A 值/对照组 A 值）。
2.3 转运试验
用 pH 6.5 HBSS 溶液配制浓度为 25、50、75、
100 μmol/L 的 DAL 溶液，滤过除菌，取符合转运
条件且细胞生长形态完好的 Transwell 孔，用 37 ℃
空白 pH 7.4 HBSS 溶液冲洗 3 遍，最后一次于 37 ℃
培养箱中孵育 30 min。对于从顶端（apical side，
AP 侧）到底端（basolateral side，BL 侧）转运：将
DAL 溶液 0.5 mL 加到 AP 侧作为供给池，同时 BL
侧加入空白 pH 7.4 HBSS 1.5 mL 作为接收池；对于
从 BL 到 AP 转运：将 DAL 溶液 1.5 mL 加到 BL 侧
作为供给池，空白 HBSS 0.5 mL 加到 AP 侧作为接
收池。分别在 30、60、90、120 min 吸取接收液 0.1 mL，
同时补加 37 ℃空白 pH 7.4 HBSS 0.1 mL。每组平行
3 个孔。
2.4 分析方法
2.4.1 色谱条件 预柱为 C18 保护柱（2.0 mm×4
mm，美国 Phenomenex 公司），分析柱为 Aquasil-C18
柱（150 mm×2.1 mm，5 μm，美国热电公司），流
动相为甲醇 -1%甲酸（70∶30），体积流量 0.5
mL/min，进样量 10 μL，柱温为室温。
2.4.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子源（ESI
源），喷雾电压为 4 000 V，加热毛细管温度为 350 ℃，
鞘气（N2）压力 3.45×105 Pa，辅助气（N2）压力
8.27×104 Pa；正离子方式检测，扫描方式为选择反
应监测（SRM），用于定量分析的离子为 DAL m/z
355.2。
2.4.3 样品处理 样品 30 μL，加入甲醇 60 μL，涡
流 1 min，静置 10 min，5 000 r/min 离心 3 min，吸
取上清液进样。
2.5 数据分析
DAL 透过 Caco-2 细胞单层的表观渗透系数
Papp（apparent permeability coefficients）值作为参考，
进行数据处理。两组间比较采用 t 检验，数据均以
sx ± 表示。
Papp=ΔQ/(Δt×A×C0)
其中 ΔQ（μmo1）为 Δt（s）内的转运量，A（cm2）为转运
孔膜表面积，C0（μmol/L）为在 Caco-2 单层细胞的 AP 或
BL 侧 DAL 的初始浓度
3 结果
3.1 DAL 对 Caco-2 细胞的抑制作用
MTT 检测结果表明 DAL 浓度在 6.25～200
μmol/L 时，细胞存活率未出现突然下降的情况，细
胞存活率均在 80%以上，对于 Caco-2 细胞而言是安
全浓度范围，结果见图 1。
3.2 双向转运
DAL 从 AP 到 BL 及从 BL 到 AP 的转运量随时
间的变化趋势见图 2、3。实验结果表明，25、50、
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图 1 DAL 对 Caco-2 细胞存活率的影响 ( 4=± n , sx )
Fig. 1 Effect of DAL on survival rate of Caco-2
cell ( 4=± n , sx )

图 2 DAL 从 AP 到 BL 的跨膜转运量 ( 3=± n , sx )
Fig. 2 Caco-2 cell transport of DAL
from AP to BL ( 3=± n , sx )

图 3 DAL 从 BL 到 AP 的跨膜转运量 ( 3=± n , sx )
Fig. 3 Caco-2 cell transport of DAL
from BL to AP ( 3=± n , sx )
75、100 μmol/L 的 DAL 从 AP 到 BL 的转运量及从
BL 到 AP 的转运量在 2 h 内都随着时间的增加呈近
线性增长。随着 DAL 浓度的增加，DAL 的 Papp值
变化不大，差异无统计学意义，见表 1。
3.3 温度对 DAL 转运的影响
固定 DAL 浓度为 50 μmol/L，分别在 4、25、
37 ℃条件下考察 DAL 的从 AP 到 BL 的转运，结
果见图 4。结果表明 4、25、37 ℃下，DAL 的 Papp
值无统计学意义，说明 DAL 的转运不受温度影响。
表 1 不同浓度 DAL 的双向 Papp 值 ( 3=± n , sx )
Table 1 Papp values of DAL from bidirections
at different concentions ( 3=± n , sx )
C/ Papp/(×10−6cm·s−1)
(μmol·L−1) AP→BL BL→AP
Papp BL→AP /
Papp AP→BL
100 7.71±0.22 6.06±0.60 0.79
75 7.70±0.56 6.01±0.05 0.78
50 7.45±0.38 6.69±0.96 0.90
25 7.27±0.53 6.85±0.69 0.94

图 4 温度对 DAL 转运的影响 ( 3=± n , sx )
Fig. 4 Effect of temperature on Caco-2 cell
transport of DAL ( 3=± n , sx )
3.4 维拉帕米对 DAL 转运的影响
Caco-2 细胞单层顶侧膜上有丰富的 P-gp 表达，
P-gp 可以把药物从细胞中外排至细胞外，而维拉帕
米是 P-gp 抑制剂。在浓度为 50 μmol/L 的 DAL 溶
液中加入 50 μmol/L 的维拉帕米后，DAL 的转运量
与未加维拉帕米的对照组比较，并没有显著差异，
说明 DAL 的转运不受 P-gp 影响，结果见图 5。

图 5 维拉帕米对 DAL 转运的影响 ( 3=± n , sx )
Fig. 5 Effect of Verapamil on Caco-2 cell
transport of DAL ( 3=± n , sx )
4 讨论
DAL 是穿心莲的主要有效成分之一，具有多种
药理活性，为了对其更好地开发利用，本研究通过
Caco-2 细胞模型，研究 DAL 跨膜转运机制，从而
30 60 90 120
6
5
4
3
2
1
0
t / min
Δ
Q
/
μm
ol

脱水穿心莲内酯 50 μmol·L−1
脱水穿心莲内酯 50 μmol·L−1＋
维拉帕米 50 μmol·L−1
1.0×10–5
8.0×10–6
6.0×10–6
4.0×10–6
2.0×10–6
0
4 25 37
温度/℃
P a
pp
/
(c
m
·s−
1 )

0
2
4
6
8
10
12
0 20 40 60 80 100 120
t / min
Δ
Q
/
μm
ol

100 μmol·L–1
75 μmol·L–1
50 μmol·L–1
25 μmol·L–1
0
1
2
3
4
5
6
0 20 40 60 80 100 120
t / min
Δ
Q
/
μm
ol

100 μmol·L−1
75 μmol·L–1
50 μmol·L–1
25 μmol·L–1
0
20
40
60
80
100
6.25 12.5 25 50 100 200
C / (μmol·L–1)
存
活
率
/%

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探讨其小肠吸收转运的机制，为今后临床研究提供
参考依据。
在本实验中，25、50、75、100 μmol/L 的 DAL
从 AP 到 BL 及从 BL 到 AP 的转运量随时间增加而
近线性增长，且随浓度的增加，DAL 的 Papp 值变化
不大，可以推断 DAL 主要是通过被动扩散吸收转
运。此外，对温度敏感是载体介导转运的共同特征[12]。
当温度下降时，载体活性逐渐减弱或者失活。实验
中发现温度的改变对 DAL 的 Papp 并没有显著影响，
说明 DAL 的吸收转运没有载体介导。在转运机制
探讨方面，已知维拉帕米抑制由 P-gp 介导的药物外
排作用，本实验观察了维拉帕米对 DAL 转运的影
响，结果发现在维拉帕米存在下，DAL 的转运量与
未加维拉帕米的对照组比较，没有显著不同。综上，
提示本研究中的 DAL 的转运主要靠浓度驱动的被
动扩散。
实验结果表明 DAL 的 Papp 在 1.0×10−6～1.0×
10−5，属于中等吸收的化合物，推断其在人体的吸
收率为 20%～70%[13]。
肠吸收实验方法主要有在体灌注法、在体回流
法、在体肠断结扎法和离体 Ussing chamber 体系法、
外翻肠囊法，以及 Caco-2 细胞模型[14-16]。与动物实
验相比，Caco-2 细胞模型有着显著的优点：同源性
好，培养省时经济，可以从不同方向进行转运实验，
提供细胞水平的肠吸收和代谢信息，观察药物对肠
黏膜的毒性作用。Caco-2 细胞模型在中药吸收研究
中的应用近年才见报道。由于大部分中药成分的吸
收过程和机制还未明确，因此 Caco-2 细胞模型在中
药口服吸收研究方面具有广泛应用。
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