全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 13 期 2013 年 7 月

·1738·
• 药剂与工艺 •
人参皂苷 Rg1人工抗原的合成及免疫原性鉴定
刘 洋 3, 4，屈会化 2, 4*，任 燕 3, 4，吴婷婷 1, 4，薛 瑾 1, 4，孙 晔 1, 4，赵 琰 1, 4*，王庆国 1, 4*
1. 北京中医药大学基础医学院，北京 100029
2. 北京中医药大学 科研实验中心，北京 100029
3. 北京中医药大学中药学院，北京 100102
4. 北京中医药大学“经典方剂的应用基础研究”创新团队，北京 100029
摘 要：目的 合成人参皂苷 Rg1的人工免疫原和包被原，为后续制备人参皂苷 Rg1的单克隆抗体及建立相应的免疫分析方
法奠定基础。方法 采用 NaIO4氧化法分别合成人参皂苷 Rg1免疫抗原（Rg1-BSA）和包被抗原（Rg1-PLL）；紫外光谱和薄
层色谱法鉴定人工抗原偶联是否成功；用间接 ELISA 方法检测免疫小鼠血清中抗体效价，用间接竞争 ELISA 检测抗体特异
性。结果 经紫外光谱和薄层色谱法检测，人参皂苷 Rg1与 BSA/PLL 偶联成功；免疫小鼠后 Rg1-BSA 可以使小鼠体内产生
抗 Rg1 抗体；利用合成的偶联物成功建立间接 ELISA 和间接竞争 ELISA 方法，测得小鼠血清抗体效价在 1∶80 000 以上，
并且所得抗体能特异性结合人参皂苷 Rg1。结论 成功合成了人参皂苷 Rg1人工免疫原和包被原，可用于下一步的人参皂苷
Rg1单克隆抗体制备及建立相应免疫分析方法。
关键词：人参皂苷 Rg1；人工抗原；NaIO4氧化法；单克隆抗体；免疫分析
中图分类号：R284.3 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)13 - 1738 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.13.008
Synthesis and immunogenicity indentification of artificial antigen
of ginsenoside Rg1
LIU Yang3, 4, QU Hui-hua2, 4, REN Yan3, 4, WU Ting-ting1, 4, XUE Jin1, 4, SUN Ye1, 4, ZHAO Yan1, 4, WANG
Qing-guo1, 4
1. School of Preclinical Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
2. Center of Scientific Research, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
3. College of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China
4. “Classical Prescription Application Foundation Research” Innovation Team, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing
100029, China
Abstract: Objective To synthesize the artificial antigen of ginsenoside Rg1-bovine serum albumin (Rg1-BSA) and the artificial
coated antigen of ginsenoside Rg1-polylysine (Rg1-PLL), and to provide the basis for the preparation of monoclonal antibody (MAb)
and the establishment of immunoassay method. Methods Rg1-BSA and Rg1-PLL were synthesized by sodium periodate oxidation
method. The characterization of the synthesis was examined by UV spectrometry and TLC method. The titer and specificity of the
antibody in serum of immunised mice were detected by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (I-ELISA) and indirect
competitive enzyme-linked immunosorbent assay (I-CELISA), respectively. Results According to the UV and TLC, the Rg1 was
successfully conjugated with BSA and PLL. I-ELISA and IC-ELISA methods were developed using Rg1-PLL. The anti-Rg1 antibody

收稿日期：2012-12-18
基金项目：国家自然科学基金资助（30973709，81274043）；教育部留学回国人员科研启动基金
作者简介：刘 洋（1988—），女，硕士研究生。Tel: (010)64286705 E-mail: ly_8812@126.com
*通信作者 赵 琰 Tel: (010)64286705 E-mail: zhaoyandr@gmail.com
王庆国 Tel: (010)64286727 E-mail: wangqg8558@sina.com
屈会化 Tel: (010)64286705 E-mail: quhuihua@gmail.com
网络出版时间：2013-04-17 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20130417.0835.001.html
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 13 期 2013 年 7 月

·1739·
obtained from immunized mice could bind to Rg1 specially and the titer was up to 1∶80 000. Conclusion The artificial immunogen
Rg1-BSA and coated antigen Rg1-PLL are successfully synthesized, which could be used to prepare the MAb of Rg1 and establish the
immunoassay method.
Key words: ginsenoside Rg1; artificial antigen; sodium periodate oxidation; monoclonal antibody; immune analysis

人参皂苷（ginsenoside，GS）是人参的主要有
效成分，由于其影响了多重代谢通路，药理作用十
分广泛，近 20 年来一直是研究的热点。以“人参皂
苷”为关键词，检索 CNKI 数据库发现收录文章近
3 000 篇，2006 年度发表文章超过 200 篇，之后每
年度呈持续增长趋势，2011年度收录文献达 406篇。
现已明确知道的 GS 单体约有 40 余种，它们具有相
似的基本结构，其中人参皂苷 Rg1（Rg1）的主要作
用靶器官为中枢神经系统，诸多研究从不同角度证
实了其具有神经营养和神经保护作用[1-3]，最近还发
现 Rg1 有抗肝纤维化的作用[4]，因此 Rg1 具有重要
的临床应用前景。
对 Rg1 进行深入研究，迫切需要建立快速、灵
敏、高效的定量方法。目前传统检测方法为 HPLC
法，近年来建立和改进的方法有高分离度快速液相
色谱（RRLC）法、高效液相色谱-蒸发光散射检测
（HPLC-ELSD）法、反相高效液相色谱-蒸发光散射
检测（RP-HPLC-ELSD）法、高效液相二极管阵列
检测（HPLC-DAD）法等[5-9]。但这些方法样品前处
理复杂，当待测样品中 Rg1 的量很低时，或者待测
样本数量很大时具有局限性，很难满足研究需要。
基于中药小分子单克隆抗体的免疫学分析方法，具
有灵敏度高、特异性强的特点，并且由于样品中的
其他物质对测定结果的干扰很小，不需要复杂的前
处理过程，所用实验试剂、仪器及操作也十分简单，
而且还可进行高通量检测[10-11]。因此，建立用于 Rg1
定性定量分析的免疫学分析方法，具有十分广阔的
应用前景。
免疫分析方法建立的前提是抗体制备，Rg1 属
于小分子化合物，相对分子质量为 801.01，只具有
反应原性而不具有免疫原性，作为半抗原必须和载
体蛋白偶联，才能作为免疫原免疫动物产生特异性
抗体。为建立 Rg1 的免疫分析方法，本研究首先对
Rg1 的人工完全抗原进行了合成与鉴定。
1 材料
雄性 BALB/c 小鼠 5 只，体质量 18～20 g，维
通利华实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK-
（京）2007-004，实验动物质量合格证号：NO
0029729。
Rg1，HPLC 测定质量分数为 98%，南京泽朗医
药科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA），美国 Roche
公司；多聚赖氨酸（PLL）、弗式完全佐剂（F5881）、
弗式不完全佐剂（F5506），美国 Sigma 公司；NaIO4，
分析纯，国药集团化学试剂北京有限公司；酶标二
抗（HRP-标记羊抗鼠 IgG），Gene-Script 公司；磷
酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）；碳酸盐缓冲液（CBS，
pH 9.6，0.05 mmol/L）；洗涤缓冲液（PBST，pH 7.4）；
终止液（2 mmol/L H2SO4）；底物缓冲液（pH 5.0，
磷酸柠檬酸配制）；底物显色液（TMB）。
96 孔酶标板，Corning 公司；Beckman Coulter
DU 800 紫外-可见分光光度计，德国 Beckman 公司；
Tecan Safire2 全波长多功能酶标仪，瑞士 Tecan 公
司；84—1A 磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司。
2 方法与结果
2.1 Rg1 人工抗原的合成
本研究采用 NaIO4法，参考文献方法[12]并改进，
将 Rg1 分别与 BSA 偶联成人工免疫原，与 PLL 偶
联成包被原。准确称取 Rg1 10.0 mg 充分溶于 1 mL
80%甲醇中，NaIO4 10.0 mg 充分溶于 1 mL 蒸馏水
中，将二者混合，放入磁力搅拌器转子，密封并用
锡箔纸包裹避光，室温下搅拌反应 5 h，得到 Rg1
氧化后产物，成为 A 液。准确称取 BSA、PLL 各
10.0 mg，分别充分溶于 1 mL CBS 中，成为 B 液。
然后将 A 液逐滴加入 B 液中，封闭并避光，在 4 ℃
下搅拌过夜。待上述反应完成后，将反应液转移至
用蒸馏水预处理的透析袋中，搅拌下用蒸馏水透析
72 h，中间多次换液。透析后的产物分装，于−20 ℃
保存，待用。
2.2 Rg1 人工抗原和包被原的鉴定
2.2.1 紫外扫描法 用蒸馏水精确配制 500 mg/mL
的 Rg1 与 BSA 标准溶液，将待测样品 Rg1-BSA 用
蒸馏水稀释到 10 倍，用紫外分光光度计测出 Rg1、
BSA、Rg1-BSA 的全波长图谱（图 1）。结果在 277 nm
处可见紫外最大吸收峰，Rg1-BSA、BSA 的紫外吸收
值分别为 0.211 7、0.595 1，而 Rg1几乎无紫外吸收
（0.004 5）。Rg1、BSA 紫外吸收特征具有明显差异，
而 Rg1-BSA 偶联物的紫外吸收兼具 Rg1、BSA 的特
征，据此可以判断偶联成功。由于 PLL 与 Rg1 均无
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 13 期 2013 年 7 月

·1740·



图 1 Rg1、BSA 和 Rg1-BSA 的全波长图谱
Fig. 1 Spectrum of full wavelength for Rg1,
BSA, and Rg1-BSA

最大紫外吸收，只在末端存在微弱的吸收，紫外扫
描图谱无明显差异。
2.2.2 薄层色谱法 用蒸馏水配制 1 mg/mL 的
Rg1、BSA、PLL 标准溶液，将待测样品 Rg1-BSA
和 Rg1-PLL 用蒸馏水稀释到 1 mg/mL。将 5 个样品
分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以醋酸乙酯-甲醇-
水（8∶2∶1）为展开剂，展开后晾干，用 10%硫
酸-乙醇溶液显色。
从薄层结果（图 2）中可以看出，在该展开条
件下，Rg1 会移动到特定位置，并在显色剂作用下，
显示出紫红色斑点；BSA、PLL 在此条件下并不会
展开，且不会显色。Rg1-BSA 和 Rg1-PLL 在相同条
件下并未展开到 Rg1 的特定位置，说明二者具备了
载体蛋白的特点，二者在点样原点显色，说明其具
备了Rg1的特点，以上结果显示Rg1-BSA和Rg1-PLL
偶联成功。

1-Rg1 2-Rg1-BSA 3-BSA 4-Rg1-PLL 5-PLL

图 2 Rg1-BSA 和 Rg1-PLL 的薄层色谱图
Fig. 2 TLC results of Rg1-BSA and Rg1-PLL
2.2.3 小鼠免疫 用 Rg1-BSA 免疫原以背部皮下
多点注射的方法免疫 5 只雄性 BALB/c 小鼠。初次
免疫用等量的弗式完全佐剂充分乳化抗原，免疫剂
量为 100 μg/只，以后每两周加强免疫 1 次，改用弗
式不完全佐剂乳化抗原，免疫剂量不变。第 4 次加
强免疫后 1 周断尾取血，3 000 r/min 离心 5 min，分
离血清。
2.2.4 间接 ELISA 法测定血清中的抗体效价 以
Rg1-PLL 作为包被原，用 CBS 稀释至 1∶4 000，在
96 孔板上每孔加 100 μL，37 ℃孵育 2 h。以 PBST
洗板，每次 5 min，共 4 次。以 50 mg/mL 脱脂奶粉
为封闭液，每孔加 200 μL，37 ℃孵育 2 h，洗板。
抗血清稀释倍数分别为 1 000、2 000、4 000、8 000、
10 000、20 000、40 000、80 000 倍。以空白小鼠的
血清作为阴性对照，37 ℃孵育 1 h，洗板。每孔加
入 100 μL 酶标二抗（1∶10 000），37 ℃孵育 1 h，
洗板。每孔加入 TMB 工作液 100 μL，37 ℃孵育显
色 15 min 后，每孔加 2 mmol/L 硫酸 50 μL 终止反
应，测定 450 nm 处吸光度（A450）值。以同一稀释
倍数下抗血清与阴性血清 A450 比值大于 2.1 时血清
的最大稀释度定为抗体效价，结果见图 3。经过多
次免疫后的 5 只小鼠血清均有抗体产生，效价均在
1∶80 000 以上。




图 3 间接 ELISA 法检测血清抗体效价
Fig. 3 Determination for antiserum titer by indirect-ELISA

2.2.5 间接竞争ELISA 法测定血清中的抗体特异性
以 Rg1-PLL 作为包被原，用 CBS 稀释至 1∶8 000，
在 96 孔板上每孔加 100 μL，37 ℃孵育 2 h。以 PBST
洗板，每次 5 min，共 4 次。以 50 mg/mL 脱脂奶粉
为封闭液，每孔加 200 μL，37 ℃孵育 2 h，洗板。
小鼠抗血清稀释倍数为 1 000，Rg1 小分子稀释为 6
个质量浓度，设置对照孔质量浓度为 0 μg/mL，每
A 4
50

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0
1 号小鼠血清
2 号小鼠血清
3 号小鼠血清
4 号小鼠血清
5 号小鼠血清
阴性血清
1 000
2 000
4 000
8 000
10 000
20 000
40 000
80 000
103 104 105
血清稀释倍数
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
A
200 240 280 320 360 400
λ / nm
BSA
Rg1
Rg1-
BSA
1 2 3 4 5
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 13 期 2013 年 7 月

·1741·
孔分别加入不同质量浓度的 Rg1 和抗血清各 50 μL，
37 ℃孵育 1 h，洗板。每孔加入 100 μL HRP-羊抗
鼠酶标二抗（1∶10 000），37 ℃孵育 1 h，洗板。
每孔加入 TMB 工作液 100 μL，37 ℃孵育显色 15
min 后，每孔加 2 mmol/L 硫酸 50 μL 终止反应，测
定 A450 值。
经检测，Rg1 对 5 只免疫小鼠的抗血清均具有
竞争抑制，表明免疫小鼠血清中产生的抗体具有
Rg1 特异性。以对照孔的 A450 值为 A0，浓度对应的
A450 值为 A，计算小鼠抗血清间接竞争抑制曲线的
线性方程和 R2，以及灵敏度（抑制率为 50%时 Rg1
的质量浓度），结果见表 1。
抑制率＝1－A / A0
灵敏度最高（27 μg/mL）的 1 号小鼠抗血清竞
争抑制曲线见图 4。

表 1 Rg1-BSA 免疫小鼠抗血清的间接竞争试验结果
Table 1 Results of indirect competitive ELISA for
antiserum of Rg1-BSA immunised mice
n 线性方程 R2 灵敏度 / (μg·mL−1)
1 Y＝6.563 lnX＋28.27 0.963 27
2 Y＝5.285 lnX＋20.96 0.932 36
3 Y＝6.093 lnX＋22.00 0.980 97
4 Y＝3.372 lnX＋30.56 0.892 318
5 Y＝6.874 lnX＋19.87 0.901 80




图 4 Rg1-1 号小鼠抗血清竞争抑制曲线
Fig. 4 Inhibition curve of antiserum competition
in Rg1-1 immunised mice

3 讨论
人工抗原合成是制备小分子单克隆抗体的关键
步骤。依据小分子结构特征的不同，人工抗原的合
成有多种方法，需要全面衡量各方面条件选择具体
人工抗原的合成方法[13]。其中 NaIO4 氧化法可以将
小分子半抗原中苯环结构的邻羟基氧化为双醛基，
继而进一步方便其与大分子载体蛋白相偶联，合成
方法较为简便，并且可在对小分子半抗原结构改变
最小下完成合成过程，能够最大限度地保护小分子
半抗原中的有效基团。用该合成方法制备的人工抗
原免疫动物，往往可以得到效价较高、亲和性良好
的稳定细胞株。本研究即采用高碘酸钠氧化法制备
Rg1 人工抗原，对今后相似结构的其他半抗原合成
提供了技术经验。
目前鉴别人工抗原合成成功与否的常规方法有
紫外光谱和飞行质谱法等。本实验在研究过程中发
现这两种方法均存在一定的局限性：（1）紫外光谱
是利用最大吸收值的变化进行鉴别，仅适用于有紫
外吸收的化合物，而对于甾类和萜类等无紫外吸收
的化合物，此方法则无能为力。如本研究中 Rg1 虽
在 203 nm 处检测到最大紫外吸收，但该处过于靠
近紫外扫描的低端检测线，因此用该方法对人工抗
原进行检测，并不能得到较为理想的实验结果。（2）
不是所有的化合物都能用飞行质谱鉴别出来，由于
人工抗原的合成需要经历一系列的氧化-还原、加热
等处理方法，所以合成的偶联率比较小，后期纯化
工序难度大，所以给鉴别带来很大困难。另外用飞
行质谱鉴别的价格也是非常昂贵的，特别是在合成
条件需要优化的情况下，如对每次合成的人工抗原
都采用飞行质谱进行鉴别是不现实的。因此，虽然
飞行质谱是鉴别人工抗原合成的较好方法，但在实
际研究过程中亦存在一定的局限性。
虽然在天然药物领域利用薄层色谱进行鉴别是
非常普遍的方法，但是该方法应用于人工抗原的鉴
定目前还未见报道。薄层色谱鉴别合成抗原的优势
在于：小分子在展开剂作用下可以展开，在显色剂
作用下可显色；BSA、PLL 等载体蛋白不能展开只
能吸附在原点，不会显色；而小分子与载体蛋白偶
联之后也被吸附在原点不能展开，但因偶联了小分
子在显色剂作用下亦可显色。本研究在 Rg1 人工抗
原合成过程中，将多个样品在同一硅胶薄层板上点
样，采用《中国药典》2010 年版记载的展开条件[醋
酸乙酯-甲醇-水（8∶2∶1）]，采用通用的显色剂
（10%硫酸-乙醇）显色，结果表明，Rg1、BSA、PLL、
Rg1-BSA、Rg1-PLL 的薄层特征具有显著差异，结
果易于判断，准确率 100%。此方法简便、快捷、成
本低，且样品使用量非常小，几乎适用于所有化合
物，可以有效提高人工抗原合成方法研究的效率。
小分子人工抗原合成成功与否，最有力的证据
是能否产生特异性抗体。采用本研究合成的 Rg1 人
80

60

40

20

0
抑
制
率
/
%

0.1 1 10 100 1 000
Rg1 / (μg·mL−1)
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 13 期 2013 年 7 月

·1742·
工抗原免疫小鼠后，间接竞争 ELISA 检测结果表明
所合成的 Rg1-BSA 可以使小鼠体内产生抗 Rg1 抗
体，效价在 1∶80 000 以上；而 Rg1-PLL 亦可以用
作间接竞争 ELISA 法的包被原，检测结果显示抗体
具有 Rg1 特异性。此结果也有力佐证了本实验建立
的人工抗原薄层色谱鉴定方法是成功可靠的。
参考文献
[1] 包翠芬. 人参皂苷 Rg1 对抗抗脑缺血再灌注细胞凋亡
及 p-JNK 表达的实验研究 [D]. 沈阳: 辽宁中医药大
学, 2009.
[2] 包翠芬, 刘 霞, 魏 嘉, 等. 人参皂甙 Rg1对脑缺血-
再灌注大鼠基质金属蛋白酶 2 和 9 表达的影响 [J]. 中
国脑血管病杂志, 2009, 6(2): 88-92.
[3] 安 明, 赵国君, 韦新成. 人参皂苷 Rg1 保护心血管和
中枢神经系统的药理活性研究进展 [J]. 中国临床药理
学杂志, 2012, 28(1): 75-77.
[4] 董向前, 段丽平, 梁 兵, 等. 人参皂苷 Rg1 和 Rb1 抗
肝纤维化的体视学研究 [J]. 山东大学学报: 医学版,
2012, 50(1): 85-88.
[5] 洪秀云, 吴晓英. 高效液相色谱-蒸发光检测法检测绞
股蓝皂苷大孔树脂纯化产物 [J]. 食品科学 , 2012,
33(14): 251-254.
[6] 王艳杰, 越 皓, 王淑敏, 等. 高分离度快速液相色谱
法检测人参皂苷的研究 [J]. 长春中医药大学学报 ,
2010, 26(6): 824-826.
[7] 石 威, 王玉堂, 权新军, 等. 高效液相色谱-蒸发光散
射检测法测定人参根中人参皂苷的含量 [J]. 分析化
学, 2006, 34(2): 243-246.
[8] 赵 岩, 刘金平, 卢 丹, 等. 反相高效液相色谱-蒸发
光散射检测法测定西洋参和西洋红参中人参皂苷的含
量 [J]. 时珍国医国药, 2006, 17(10): 1956-1958.
[9] 韦英杰, 李 萍, 李松林. 高效液相二极管阵列检测法
同时测定复方丹参制剂中 7 个成分的含量 [J]. 分析化
学, 2006, 34(12): 1702-1706.
[10] Chuang J C, Van Emon J M, Jones R, et al. Development
and application of immunoaffinity column
chromatography for atrazine in complex sample media
[J]. Anal Chim Acta, 2007, 583(1): 32-39.
[11] 屈会化, 赵 琰, 王庆国. 利用免疫芯片技术筛查中药
注射剂致敏成分 [J]. 北京中医药大学学报 , 2008,
31(1): 23-25.
[12] 赵寿经, 侯春喜, 钱延春, 等. 人参皂苷 Rb1 单克隆抗
体的制备与鉴定 [J]. 吉林大学学报: 工学版, 2007,
37(1): 245-248.
[13] 屈会化, 赵 琰, 李翼飞, 等. 中药活性小分子人工抗
原合成的技术要点 [J]. 中草药 , 2012, 43(10):
1880-1885.