全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 8 期 2011 年 8 月

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巫山淫羊藿悬浮培养细胞的生长特性研究
韩素菊 1， 黎云祥 2*
1. 绵阳师范学院，四川 绵阳 621000
2. 西华师范大学 西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，四川 南充 637002
摘 要：目的 考察巫山淫羊藿悬浮培养细胞的生长特性，为巫山淫羊藿资源利用提供参考。方法 选用悬浮培养所获得
的均匀悬浮培养细胞为研究对象，在光照条件下进行悬浮培养，每隔 3 d 取样，测定相关的生理生化指标。结果 巫山淫
羊藿悬浮细胞的生长曲线呈“S”型，培养基中蔗糖、磷酸盐、硝酸盐、铵盐量均呈急剧下降趋势，最后变化趋于平缓，
细胞合成黄酮最佳光照时间为每天 12 h，黄酮合成量为 27.854 82 mg/L。结论 巫山淫羊藿细胞生长特性的研究为其大规
模悬浮培养生产天然活性成分奠定了基础。
关键词：巫山淫羊藿；悬浮培养；生长曲线；生长特性；黄酮
中图分类号：R282.21 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)08 - 1609 - 05
Growth characteristics of Epimediun wushanense in cell suspension culture
HAN Su-ju1, LI Yun-xiang2
1. Mianyang Normal University, Mianyang 621000, China
2. Key Laboratory of Southwest China Wildlife Resources Conservation, Ministry of Education, China West Normal University,
Nanchong 637002, China
Abstract: Objective To provide biotechnology reference for the utilization of Epimedium wushanense. Methods Some subculture
conditions were determined and the growth characteristics of suspension cells were observed every 3 d. Results The cell showed
S-shaped growth curve and the content of nitrate, ammonia salt, phosphate, and sucrose all showed sharply decreasing trend during the
initial cell suspension culture of E. wushanense. Then the respective changes slowed down. The optimum illumination duration was 12 h.
The highest output of flavonoids was 27.854 82 mg/L under 12 h illumination. Conclusion The growth characteristics research lays
the foundation of mass natural active ingredient in cell suspension culture production of E. wushanense.
Key words: Epimediun wushanense T. S. Ying; suspension culture; growth curve; growth characteristics; flavonoids

巫山淫羊藿Epimediun wushanense T. S. Ying是
小檗科淫羊藿属的多年生宿根性草本植物。《本草纲
目》中称其有“益精气，坚筋骨，补腰膝，强心力”
之功效。现代药理学研究表明，淫羊藿能增加心脑
血管血流量，促进造血功能、免疫功能及骨代谢，具
有抗衰老、抗肿瘤、补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效，
临床应用十分广泛[1-2]。淫羊藿药用历史悠久，其有效
成分为黄酮类化合物和多糖等次生代谢产物[3-4]。随着
现代中药产业的发展，以淫羊藿为主要原料的中成
药、民族药产品不断问世，市场对淫羊藿需求量愈来
愈大，使其野生资源供不应求[5-6]。国内外淫羊藿细
胞悬浮培养研究较少，而植物细胞悬浮培养的次生
代谢产物具有提高产率、缩短周期、调控其生产过
程、提高产品质量等优点。因此，研究巫山淫羊藿
悬浮细胞的生长特性，为其次生代谢产物的研究提
供基础。
1 材料与仪器
1.1 材料
药材经贵州药用植物——淫羊藿分类专家何顺
志、西华师范大学秦自生、马永红鉴定为巫山淫羊
藿 Epimediun wushanense T. S. Ying，幼叶经诱导得
到愈伤组织，培养数代后得到巫山淫羊藿均匀悬浮
培养细胞。将悬浮培养物用 400 目不锈钢筛网滤过，
收集细胞。在超净工作台上用电子天平称量 2 g

收稿日期：2010-12-18
基金项目：四川省教育厅项目（09ZX011）；四川省科技厅应用基础研究项目（2008JY0158）；四川省重点实验室开放基金项目（XNYB09-04）
作者简介：韩素菊（1976—），女，讲师，研究方向为药用植物生理。
*通讯作者 黎云祥 E-mail: yx_li@263.net
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 8 期 2011 年 8 月

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细胞加入到 B5 培养基中培养。
淫羊藿苷对照品（批号 110737-200415）购自
中国药品生物制品检定所，质量分数＞98%。
1.2 仪器
雷磁 Phs—25 数显 pH 计，上海精密科学仪器
有限公司；LDZX—40BI 型立式自动压力蒸气灭菌
锅，上海申安医疗器械厂；HZQ—QX 全温振荡器，
哈尔滨东联电子技术开发有限公司；GBC—916
紫外-可见分光光度计，澳大利亚 GBC 科学仪器有
限公司。
2 方法
2.1 生长曲线的绘制
以 B5 培养基为基本培养基，附加 1.0 mg/L 2，
4-D、0.2 mg/L BA、30 mg/L 蔗糖配制成生长培养
基，调节 pH 值在 5.8。取 30 mL 培养基装于 100 mL
三角瓶中，每瓶接种继代培养 6 d 后的淫羊藿鲜细
胞 2 g，在 120 r/min，（24±2）℃，每天光照 12 h
条件下培养。培养后，每 3 天取 5 瓶细胞培养物测
定其紧实细胞体积（PCV），再用 400 目不锈钢筛网
滤过，洗涤，称量其鲜质量，60 ℃烘至质量恒定，
称量。绘制细胞干、湿质量生长曲线。
2.2 PCV 的测定
悬浮培养过程中，每 3 天取其培养物，静置，
弃去上清液，将下面沉淀物倒入刻度离心管中，500
r/min 离心 5 min，测定 PCV。然后将其摇匀倒入上
清液中。测细胞的湿质量和干质量。
2.3 培养过程中生长参数的测定
取测生长曲线后的滤液，测其滤液中各营养物
的量。
2.3.1 培养液中 NO3−的测定[7] 分别将 1、2、3、4、
5 mL 标准硝酸盐溶液放入瓷勺中，蒸发至干，加入
2 mL 苯酚二磺酸试剂，以溶解残余固体，用 10 mL
蒸馏水稀释，转移至 50 mL 量瓶，加入约 15 mL 浓
氨水，直至颜色最深，用蒸馏水定容至刻度，测定
吸光度（A）值。以 A 值为纵坐标（Y），质量浓度
为横坐标（X），得到标准曲线为 Y＝0.019 4 X＋
0.026，r＝0.995 0。
将培养液滤过，稀释 10 倍后取 0.05 mL，参照
标准曲线的测定方法，由标准曲线计算培养液中
NO3−的量。
2.3.2 培养液中 NH4+的测定 [8] 分别取 30.0
μg/L NH4NO3 标准溶液 0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL
于 50 mL 量瓶中，加蒸馏水至 30 mL 左右，然后
加入 5 mL 酚溶液、5 mL 次氯酸钠溶液，40 ℃显
色 30 min 后加入 1 mL 掩蔽剂，定容，于 625 nm 下
测定 A 值。
以 A 值为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），
绘制标准曲线：Y＝0.259 3 X－0.029 8；r＝0.995 9。
取 1 mL 培养液于 50 mL 量瓶中，其余操作同标准
曲线。根据测得的 A 值求得相应的 NH4+的量。
2.3.3 培养液中 PO43−的测定[9] 分别取 1、2、3、
4、5 mL 标准磷酸盐溶液至 50 mL 量瓶中，分别加
入 10 mL 的钼酸铵-钒酸铵试剂，定容至刻度，混匀，
在室温下放置 10 min，于 400 nm 处测定其 A 值。
以 A 值为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），绘
制标准曲线 Y＝0.020 1 X－0.002 8，r＝0.999 7。取 1
mL 培养液于 25 mL 量瓶中，其余操作同标准曲线。
根据测得的 A 值求得相应的 PO43−的量。
2.3.4 培养液中蔗糖质量浓度的测定[10] 分别取
标准蔗糖溶液 2 mL 放入带塞试管中，加入 10 mL
蒽酮试剂，立即摇匀，放入冰水浴中。放入沸水浴
10 min，取出迅速冷却，静置 10 min。于 620 nm 处
测定其 A 值。
以 A 值为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），
绘制标准曲线为 Y＝6.364 3 X＋0.004 5，r＝0.999 2。
取 2 mL 培养液于试管中，加入 10 mL 蒽酮溶液，
操作同标准曲线。根据测得的 A 值求得相应的蔗糖
的量。
2.4 悬浮培养细胞黄酮量的测定
总黄酮量采用分光光度法测定。收集悬浮培养
细胞，洗涤，60 ℃烘干至恒定质量，研细，取 0.05
g 粉末至三角瓶中，加入 85%乙醇 10 mL 浸泡，室
温振荡 48 h，滤过得到总黄酮提取液。取滤液 0.5 mL
于试管中，再加入 10 mL 85%乙醇摇匀得到样品液，
在 269.56 nm 处测 A 值。根据标准曲线计算相应的
样品中总黄酮的量。
根据文献方法[11-13]确定淫羊藿苷在紫外区 270
nm 处有最大吸收峰。
淫羊藿苷对照品 105 ℃干燥 4 h 后，精密称取
5 mg，用 85%乙醇溶解，定容于 10 mL 量瓶，质量
浓度为 500 μg/L。精密吸取 500 μg/L 的对照品溶液
0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0、9.0 mL，分别置
10 mL 量瓶中，加 85%乙醇稀释至刻度，摇匀，于
269.56 nm 处测定其 A 值。根据 A 值和质量浓度得
到标准曲线。
以 A 值为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），
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绘制标准曲线为 Y＝25.349 X－0.222 5，r＝0.999 0。
3 结果与分析
3.1 巫山淫羊藿悬浮培养细胞的生长曲线
由图 1 可见巫山淫羊藿悬浮培养细胞的生长曲
线基本呈 S 型，3～6 d 为延滞期，指数增长期在 6～
18 d，之后进入稳定期。糖的利用情况和细胞的生
长情况基本一致，细胞生长最快时，糖利用能力最
强，18 d 后，悬浮培养液中细胞进入了稳定期，在
显微镜下观察细胞团增大，细胞湿质量有所下降，
干质量基本保持不变，但图 2 中显示细胞的 PCV 体
积在 18～21 d 时还在增加，这段时间镜检观察空细
胞增多，细胞的内含物减少。故细胞虽然体积增加，
但细胞的鲜质量和干质量都基本保持不变，所以细
胞的最佳收获期在 20 d 左右。
黄酮的形成积累与细胞生长也有很大关系，图
3 显示淫羊藿悬浮培养细胞在延滞期黄酮量较低，
但在延滞期中间有一个最高值；进入快速生长期后，
淫羊藿黄酮量也逐渐升高，基本与细胞生长

图 1 悬浮培养细胞生长曲线
Fig. 1 Growth curves of suspension cultural cell


图 2 悬浮培养细胞 PCV 变化曲线
Fig. 2 PCV change curve of suspension cultural cell

图 3 悬浮培养细胞黄酮量变化曲线
Fig. 3 Flavonoids change curves of suspension cultural cell
呈正相关；细胞生长进入静止期后淫羊藿黄酮量开
始下降；到达衰亡期时淫羊藿黄酮量下降到最低
值。巫山淫羊藿悬浮培养周期约为 21 d，经过 21 d
达到最大值，为 107.3 mg/L，继续培养细胞黄酮量
下降。考虑到淫羊藿细胞增长倍数和黄酮量两个因
素，在实验中选取生长到第 20 天时收获细胞为宜。
3.2 光照时间对悬浮细胞合成黄酮的影响
光照对许多植物中黄酮类化合物，如黄酮、黄
酮醇和花色素苷的合成，具有诱导作用[11]。大量研
究已证实苯丙氨酸氨基裂解酶（PAL）是植物细胞
中黄酮生物合成途径中的第一关键酶。本研究中探
索了在相同光照强度下不同光照时间对巫山淫羊藿
细胞产黄酮的影响。淫羊藿悬浮细胞在光照和黑暗
条件都产黄酮，但光照时间与黄酮合成量有关（表
1），结果表明，光照对悬浮培养细胞及黄酮量均有
影响，光照时间越长黄酮量越高，产量也越高。光
照 12 h 即能明显促进黄酮的合成，再延长光照时间
却没有明显影响。但全天光照反而抑制巫山淫羊藿
细胞黄酮合成，黄酮量降低，但均高于黑暗条件的
黄酮量。这与光照时间对水母雪莲愈伤组织生长和
黄酮生物合成的影响是一致的[13]。光照时间对巫山
淫羊藿产黄酮有很大影响，黑暗条件下，细胞合成
黄酮量 17.209 9 mg/L。细胞合成黄酮最佳光照时间
为 12 h/d，黄酮合成量为 27.854 8 mg/L。
3.3 培养液中糖的利用动态
培养过程中营养组分的量并不恒定，而是随着
培养过程的进行而下降。糖作为细胞代谢过程中碳
水化合物的主要来源，对细胞的生长有较大的影响。
由图 4 可知，蔗糖的消耗利用是较快的。最初
蔗糖质量浓度为 40 g/L，培养 24 d后，只剩 7.39 g/L，
5.4
5.2
5.0
4.8
4.6
4.4
4.2
4.0
黄
酮
/%

120
100
80
60
40
20
0
质量分数
产量
0 3 6 9 12 15 18 21 24
t / d
黄
酮
产
量
/(m
g·L
−1)
25
20
15
10
5
0
0 3 6 9 12 15 18 21 24
t / d
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
细
胞
干
质
量
/(g·L
−1)
湿质量
干质量 细
胞
湿
质
量
/(g
·L
−1
)
PC
V
/m
L
10
8
6
4
2
0
0 3 6 9 12 15 18 21 24
t / d
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表 1 光照对淫羊藿黄酮合成的影响
Table 1 Effects of different illumination duration
on flavonoids synthesis
光照时间/h 细胞干质量/g 黄酮/% 黄酮量/ (mg·L−1)
0 0.368 8 4.666 8 17.209 9
6 0.513 9 4.989 3 25.640 0
12 0.530 8 5.247 5 27.854 8
16 0.522 3 5.102 4 24.321 1
24 0.556 1 4.828 4 26.852 1


图 4 悬浮培养细胞培养液中残糖量变化曲线
Fig. 4 Change curve of sugar content in media of suspension
cultual cell
蔗糖每天的平均消耗速度是 1.36 g/L。对数生长期
的 6～18 d 蔗糖消耗更快，从 34.75 g/L 降至 10.30
g/L，每天平均消耗 2.04g/L。蔗糖的这种消耗速度
与细胞的生长速度密切相关。培养初期糖的消耗量
小，相应细胞处于延滞期，细胞生长速度慢，生长
量也缓慢，在对数生长期，蔗糖被大量消耗，细胞
生长量也最大。表明碳源是细胞生物量积累的主要
能源。
3.4 培养基中 NO3−和 NH4+的消耗
氮元素是植物细胞的重要组成元素之一，也是
生物碱等次级代谢产物的组成元素。氮源是植物细
胞生长、繁殖和生产生物碱等次级代谢产物所必不
可少的营养物质。植物细胞培养通常采用一定量的
硝酸盐和铵盐作为混合无机氮源，单独以铵盐或者
硝酸盐为氮源，都对细胞的生长和次级代谢产物的
生成不利 [12]。细胞生长一个重要指标是 NO3−和
NH4+的代谢变化。在细胞生长初期 NH4+的消耗比
较快，在生长高峰期，NH4+的消耗并不随细胞生长
的加快而增加。在 B5 培养基中，NH4+与 NO3−的摩
尔比为 2︰25，N 素的总浓度为 27 mmol/L。图 5
显示，在培养前期，铵盐比硝酸盐的利用速度快，
铵盐的摄入对淫羊藿细胞生长所需的蛋白质的合成

图 5 悬浮培养细胞培养液中 NO3−和 NH4+量变化曲线
Fig. 5 Change curves of NO3− and NH4+ contents in media
of suspension cultural cell
十分重要，而硝酸盐的消耗则与黄酮和其他的一些
次级代谢产物合成有关。
3.5 培养液中 PO43+的变化
植物细胞培养需要多种无机元素，其中磷酸盐
的浓度对细胞生长和次级代谢产物生长有很大影
响。磷是细胞生命活动中起重要作用的 DNA、RNA、
ATP 等许多生物活性物质的组成元素，对细胞分裂，
繁殖、生长和新陈代谢有重要意义。图 6 显示淫羊
藿悬浮培养细胞在第 9 天时，约有 60%的磷被消耗，
在第 18 天时基本消耗完。

图 6 悬浮培养细胞培养液中 PO43−量变化曲线
Fig. 6 Change curve of PO43− content in media
of suspension cultural cell
4 讨论
4.1 悬浮培养过程中营养消耗与细胞生长的关系
掌叶半夏[14]在培养过程中生长曲线呈 S 型，分
为延迟期、对数期、对数生长期和静止期，培养 20
d 左右细胞数量和鲜质量达到最大值。银杏悬浮培
养细胞生长曲线基本为 S型，其中 0～3 d为延滞期，
3～18 d 为指数生长期[14]，18～21 d 为静止期，21～
24 d 为衰亡期。人参悬浮[15]细胞培养生长曲线 0～
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
糖
质
量
浓
度
/(g
·L
−1
)
0 3 6 9 12 15 18 21 24
t / d
300
250
200
150
100
50
0
N
H
4+
质
量
浓
度
/(m
g·
L−
1 )
N
O
3 −质
量
浓
度
/(m
g·L
−1)
NO3−
NH4+
2 000
1 600
1 200
800
400
0
0 3 6 9 12 15 18 21 24
t / d
140
120
100
80
60
40
20
0P
O
43
− 质
量
浓
度
/(m
g·
L−
1 )

0 3 6 9 12 15 18 21
t / d
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6 d 为延滞期，6～15 d 为对数生长期，21～24 d 为
减慢期，29 d 后进入静止期。本实验中，淫羊藿细
胞生长曲线也呈 S 型，0～5 d 为延滞期，5～18 d
为指数生长期，18～24 d 为静止期，最佳换液时间
为 20 d 左右，此时培养基的养分所剩无几，细胞生
长量下降，甚至细胞出现退化现象，褐化死亡。不
同悬浮培养材料对营养利用时间不同，细胞生长规
律也不同。
在植物细胞培养中，细胞的生长受培养基中的
糖源的制约，蔗糖作为生物代谢过程中的碳源，在
培养基中降解成葡萄糖和果糖。高量的蔗糖常刺激
组织培养细胞的生长。NH4+作为生物合成过程中的
氮源，被用于蛋白质的合成，而 NO3−与次生代谢过
程中的关键酶和一些代谢物的合成有关。在本实验
中淫羊藿悬浮细胞选择了 B5 作为培养基，能获得高
产次生代谢物黄酮。淫羊藿细胞在生长初期铵盐被
迅速消耗，硝酸盐消耗比较缓慢。两者之间的代谢
关系有待进一步研究。
4.2 光照与细胞合成黄酮的关系
光照条件对黄酮类化合物的合成影响很大。研
究发现植物合成黄酮类化合物是对紫外线照射的一
种反应，可以保护植物免受紫外线的伤害。紫外线
可以引发植物合成黄酮类化合物的基因的转录活
性，紫外线照射后，黄酮类化合物迅速合成，并积
累于表皮细胞[16]。光照可以促进植物细胞黄酮类化
合物的合成，巫山淫羊藿黄酮的合成也与光照关系
密切，黑暗条件下细胞培养物产黄酮量只是光照的
3/5，细胞黄酮的量是光照条件下的 4/5。而细胞产
黄酮量与光照时间也有一定关系，研究发现 12 h 有
利于巫山淫羊藿悬浮细胞黄酮的形成和积累，此时
细胞黄酮量最高 5.2%，产量也达到最高。
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