全 文 ：高速逆流色谱分离制备广陈皮中多甲氧基黄酮类成分的研究
郑国栋1 ,周 　芳2 ,蒋 　林1
①
,杨得坡1 ,杨 　雪1 ,林乐维1
(11 中山大学药学院 生药与天然药物化学实验室 ,广东 广州 　510006 ; 21 湖南中医药大学药学院
天然药物化学实验室 ,湖南 长沙 　410208)
摘 　要 :目的 　采用高速逆流色谱技术 ( HSCCC)从广陈皮中制备分离高纯度多甲氧基黄酮类成分。方法 　应用制
备型高速逆流色谱仪 ,通过优化各分离条件 ,以四元两相溶剂系统石油醚2醋酸乙酯2甲醇2水 (1 ∶018 ∶017 ∶018) ,
上相为固定相 ,下相为流动相 ,制备分离广陈皮醋酸乙酯萃取部分粗提物。结果 　300 mg 粗提物经过 260 min 一
次制备分离 ,得到了 3 个多甲氧基黄酮类化合物 ,经 EI2MS 及1 H2NMR 分析 ,鉴定为川陈皮素、3 ,5 ,6 ,7 ,8 ,3′,4′2七
甲氧基黄酮及橘皮素 ,其质量分数分别为 96125 %、97110 %、99122 %。结论 　该方法简便、经济 ,所得化合物既可
作为广陈皮质量控制的参考物质 ,又可为柑橘属植物分类学研究提供一定的依据。
关键词 :广陈皮 ;多甲氧基黄酮 ;高速逆流色谱
中图分类号 :R28412 ;R286102 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 - 2670 (2010) 01 - 0052 - 04
Isolation and purif ication of polymethoxylated flavonoids from Perica r pium Cit ri Reticulatae
by high2speed counter2current chromatography
ZH EN G Guo2dong1 , ZHOU Fang2 , J IAN G Lin1 , YAN G De2po1 , YAN G Xue1 , L IN Le2wei1
(11Laboratory of Pharmacognosy and Natural Medicinal Chemist ry , School of Pharmaceutical Sciences , Sun Yat2sen
University , Guangzhou 510006 , China ; 21Laboratory of Natural Medicinal Chemist ry , College of Pharmaceutical
Sciences of Hunan University of Chinese Medicine , Changsha 410208 , China)
Abstract : Objective 　High speed counter2current chromatograp hy ( HSCCC) was applied to the pre2
parative separation of polymet hoxylated flavonoids ( PMFs) wit h high p urity f rom Pericar pi um Cit ri Re2
t icul at ae1 Methods 　After various parameters of p reparative HSCCC were optimized preliminarily , t he
crude ext ract of the EtOAc part of Pericarpi um Cit ri Reticul at ae was separated with a two2p hase solvent
system composed of pet roleum ether2EtOAc2methanol 2water (1 ∶018 ∶017 ∶018)1 The upper p hase was
chosen as t he stationary p hase , while t he lower p hase was chosen as the mobile p hase1 Results 　Three
PMFs including nobiletin , 3 , 5 , 6 , 7 , 8 , 3′, 4′2heptamethoxy flavone , and tangeretin could be obtained
f rom 300 mg crude ext ract s in one2step separation in 260 min wit h t heir p urities as 96125 % , 97110 % , and
99122 % , respectively1 And t heir st ructures were identified by EI2MS and 1 H2NMR1 Conclusion 　The re2
sult s demonst rate t hat the adopted met hods are simple , feasible , economical , and efficient for rapid p re2
parative isolation of PMFs f rom species of Cit rus L1 The compounds obtained in t he experiment could be
used as reference substances for quality cont rol of Pericar pi um Cit ri Reticul at ae1 Furt hermore , t he adopt2
ed methods may be used as st rong research tools for taxonomy in botanical sciences of Cit rus L1
Key words : Pericarpi um Cit ri Reticul at ae ; polymet hoxylated flavonoids ( PMFs) ; high speed coun2
ter2current chromatograp hy ( HSCCC)
　　广陈皮是广东著名的传统中药材 ,位列十大广
药之一。《中国药典》2005 年版记载 ,陈皮为芸香科
植物橘 Cit rus ret icul at a Blanco 及其栽培变种的干
燥成熟果皮 ,其药材可分为陈皮及广陈皮 ,质量以广
陈皮为优。广陈皮药材来源较广 ,正品为茶枝柑
Cit rus ret icul ata‘Chachi’的干燥成熟果皮 ,主产于
·25· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
①　　收稿日期 :2009204209
　　基金项目 :国家科技部“十一五”支撑项目 (2006BAI06A11202)
　　作者简介 :郑国栋 (1979 —) ,男 ,湖北省宜昌市人 ,博士 ,主要从事生药学与天然药物化学方向的研究与开发。
Tel :15918518120 　Fax : (020) 39943043 　E2mail :gd200237 @1261com
　　3 通讯作者　蒋　林　Tel : (020) 39943041 　E2mail :linderson jiang @163. com
广东新会 ,具有理气健脾、和胃止呕、燥湿化痰等多
种功效。广陈皮含有丰富的多甲氧基黄酮类成分 ,
其可作为芸香科柑橘属分类的指标性成分。该类成
分具有显著的药理活性 ,如抗癌[1 ,2 ] 、抗诱变[ 3 ] 、抗
炎[ 4 ] 、抗氧化[5 ] 及心血管保护[6 ] 等作用。故本课题
拟采用高速逆流色谱 ( high speed counter2current
chromatograp hy , HSCCC) 技术制备分离广陈皮多
甲氧基黄酮类成分 ,由于该技术不使用载体 ,没有不
可逆吸附 ,具有样品无损失、无污染、高效、快速和大
制备量分离等优点 ,并使常规提取分离无法分离得
到的一些微量及死吸附成分的获得成为可能 ,现已
广泛成功应用于天然产物有效成分的分离制
备[ 7～9 ] 。
1 　仪器与材料
高速逆流色谱系统 :Mk5 QuikPrep 500 制备型
高速逆流色谱仪 (英国 A ECS Co1 ) ,L C2Series Ⅱ液
相泵 (美国 SSi Co1 ) ,不锈钢线圈管路 P TFE pre2
parative coil (直径 2116 mm ,总容积 450 mL ,选择
容积 230 mL ,转速 0～860 r/ min) ,20 mL 定量环 ,
SPD210AV P 紫外检测器 (日本岛津) ;高效液相色
谱系统 :Waters 600 E 型高效液相色谱仪 (美国 Mil2
ford) ,Waters 2996 二极管阵列检测器 ,Waters 717
plus 自动进样器 ,Empower 色谱工作站软件 ;Milli2
Q plus system 超纯水仪 (美国 Millipore) ;电子轰击
电离质谱仪 ( TraceDSQ , Thremo , U SA ) ; Bruker
Avance AV 400 超导核磁共振谱仪 (瑞士 Bruker) ;
Varian INOVA 500NB 超导核磁共振谱仪 (美国
Varian) ; E YELA 旋转蒸发仪 (日本东京) 。
广陈皮药材于 2007 年 12 月采自广东省江门市
新会区双水镇广东省水果良种苗木繁育场 ,经中山
大学药学院蒋林研究员鉴定为茶枝柑 C1 ret icul at a
‘Chachi’的干燥成熟果皮。乙腈、甲醇为色谱纯试
剂 ,其他试剂均为分析纯试剂 ,怡宝纯净水 (怡宝食
品饮料有限公司) ,超纯水 (自制) 。
2 　方法与结果
211 　样品预处理 :1 kg 干燥广陈皮打成粗粉、过 20
目筛 ,用 80 %乙醇回流提取 3 次、每次 115 h、合并
提取液 ,提取液浓缩至无醇味并用水分散 ,依次用石
油醚 (60～90 ℃) 、醋酸乙酯分别萃取 6 次 ,合并萃
取液 ,醋酸乙酯萃取部分减压浓缩得醋酸乙酯浸膏
样品 10 g。
212 　HPL C 样品分析 :迪马 Dikma Diamonsil C18
色谱柱 (250 mm ×416 mm ,5μm) ;流动相 :乙腈2水
(50 ∶50) ;进样量 :10μL ;体积流量 :110 mL/ min ;
检测波长 :330 nm ;柱温 :25 ℃。样品经分离后 ,显
示 5 个主要色谱峰 ,见图 1。
图 1 　广陈皮醋酸乙酯萃取部分 HPLC色谱图
Fig11 　HPLC Chromatogram of EtOAc crude extract
from Perica r pium Cit ri Reticulatae
213 　溶剂系统筛选 :以试管法结合高效液相色谱法
测定高速逆流色谱溶剂系统的分配系数 k 值 ( k =
C固定相 / C流动相 ,015 ≤k ≤2) [10 ] ,以之为依据 ,对四元两
相溶剂系统石油醚2醋酸乙酯2甲醇2水进行筛选。结
果表明 ,石油醚2醋酸乙酯2甲醇2水 (1 ∶018 ∶017 ∶
018)为最佳溶剂系统 ,除峰 A 外 ,峰 B～E 的 k 值均
在 015～2 ,见表 1。
表 1 　广陈皮醋酸乙酯萃取部分 HSCCC溶剂系统筛选
Table 1 　Selection of two2phase solvent system for EtOAc
crude extract from Perica r pium Cit ri Reticulatae
溶剂系统
分配系数 k
峰 A 峰 B 峰 C 峰 D 峰 E
11 0 ∶01 8 ∶01 6 ∶018 0118 0150 11 15 11 80 21 05
11 0 ∶01 8 ∶01 7 ∶017 0112 0132 01 73 11 20 11 48
11 0 ∶01 8 ∶01 7 ∶018 0126 0158 11 17 11 47 21 00
11 0 ∶01 8 ∶01 9 ∶017 0110 0120 01 46 01 64 11 64
11 0 ∶01 9 ∶01 6 ∶018 0141 0153 01 75 21 57 41 40
11 0 ∶01 9 ∶01 8 ∶018 0115 0135 01 79 11 26 11 35
214 　其他分离条件优化
21411 　固定相及流动相选择 :以所选溶剂系统下相
为固定相 ,上相为流动相时 ,分离时发现基线不稳
定 ,且在分离过程中一直伴随固定相的流失 ,固定相
保留率较低、分离时间长 ,故选择溶剂系统上相为固
定相 ,下相为流动相。
21412 　样品质量浓度的选择 :固定进样体积为 20
mL ,逐步提高进样质量浓度分别为 5、10、15、20
mg/ mL ,发现以 20 mg/ mL 为进样质量浓度时 ,会导
致峰分离效果变差及固定相流失 ,故选择 15 mg/ mL
为适宜进样质量浓度。
21413 　转速、柱温及流动相体积流量的选择 :预试
验结果表明 ,转速越快 ,固定相保留率越高 ;柱温过
低 ,会带来固定相的流失 ,柱温过高 ,则溶剂系统在
分离过程中易出现大量气泡 ,从而影响分离 ;流动相
体积流量过低会导致分离周期延长 ,过高则会导致
固定相流失且分离效果变差。故经综合考虑 ,转速、
·35·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
柱温及流动相体积流量分别设定为 860 r/ min、
35 ℃及 2 mL/ min。
215 　HSCCC 制备分离 :溶剂系统为石油醚2醋酸乙
酯2甲醇2水 (1 ∶018 ∶017 ∶018) ;固定相 :上相 ;流
动相 :下相 ;线圈容积 :230 mL ;进样量 :300 mg ;进
样体积 :20 mL ;转速 :860 r/ min ;流动相体积流量 :2
mL/ min ;检测波长 :330 nm ;柱温 :35 ℃;固定相保留
率 :78 %。300 mg 样品经 260 min 一次制备分离 ,得
到 A～E 5 个组分 ,见图 2。其中 ,A、B 未能完全分
离 ,C、D、E则得到了良好的分离。组分 A～E 经浓缩
干燥后 ,称定质量 ,分别为 20、16、22、3、8 mg。
图 2 　HSCCC制备分离广陈皮醋酸乙酯萃取部分色谱图
Fig12 　Preparative HSCCC separation of EtOAc crude
extract from Perica r pium Cit ri Reticulatae
216 　H PL C2PDA 对质量分数的分析 :组分 A～ E
经 H PL C2PDA 分析 (色谱条件见 212) 、按峰面积归
一化法计算质量分数。结果表明 ,组分 A、B 不纯 ,其
主要成分质量分数分别为 86103 %、86141 % ,尚需进
一步纯化处理 ,组分 C、D、E 则较为纯净 ,其质量分数
分别为 96125 %、97110 %、99122 % ,结果见图 3。
217 　化合物结构鉴定
化合物 C:无色针状结晶(甲醇) ,mp 133～134 ℃,
分子式 C21 H22 O8 。EI2MS m/ z ( %) :402 (M + ) 、387
(M + - CH3 , 100) 、371 ( M + - OCH3 ) 、357、344、
326、255、197、182、162、149、131、111、97、83、69、57。
1 H2NMR (400 M Hz , CDCl3 ) δ: 7156 (1 H , dd , J =
814 ,210 Hz , H26′) 、7141 ( 1 H , d , J = 210 Hz , H2
2′) 、6199 (1 H ,d ,J = 814 Hz , H25′) 、6161 (1 H ,s , H2
3) 、4110 (3 H , s ,OCH3 ) 、4102 (3 H , s ,OCH3 ) 、3197
(3 H ,s ,OCH3 ) 、3195 (9 H ,m ,3 ×OCH3 ) 。其光谱数
据与文献报道对照基本一致[11] ,故化合物 C鉴定为 5 ,
6 ,7 ,8 ,3′,4′2六甲氧基黄酮(川陈皮素) 。
化合物 D :黄色针状结晶(甲醇) ,mp 130～131 ℃,
分子式 C22 H24 O9 。EI2MS m/ z ( %) :432 (M + ) 、417
(M + - CH3 ,100) 、401、387、374、359、225、209、202、
197、187、173、165、149、137、119、107、83、77、69。
1 H2NMR ( 400 M Hz , CDCl3 )δ: 7183 ( 1 H , dd , J =
814 ,210 Hz , H26′) 、7181 ( H ,d , J = 21 0 Hz , H22′) 、
图 3 　化合物 C～E的 HPLC2PDA纯度分析色谱图
Fig13 　HPLC2PDA Purity analysis of compounds C—E
7106 ( 1 H , d , J = 814 Hz , H25′) 、4109 ( 3 H , s ,
OCH3 ) 、4100 (3 H , s ,OCH3 ) 、31 98 (3 H , s ,OCH3 ) 、
3197 (6 H ,m ,2 ×OCH3 ) 、3195 (3 H ,s ,OCH3 ) 、3189
(3 H ,s ,OCH3 ) 。其光谱数据与文献报道对照基本
一致[ 12 ] ,故化合物 D 鉴定为 3 ,5 ,6 ,7 ,8 ,3′,4′2七甲
氧基黄酮。
化合物 E:无色针状结晶(甲醇) ,mp 159～160 ℃,
分子式 C20 H20 O7 。EI2MS m/ z : 372 ( M + ) 、357
(M + - CH3 , 100) 、329、314、296、268、225、197、
182、179、157、153、135、132、117、89、83、69。1 H2
NMR ( 500 M Hz , CDCl3 )δ: 7187 ( 2 H , d , J = 910
Hz , H22′,6′) 、7102 (2 H ,d , J = 910 Hz , H23′,5′) 、
6160 (1 H ,s , H23) 、4110 (3 H , s ,OCH3 ) 、4102 (3 H ,
s ,OCH3 ) 、3195 ( 6 H , s , 2 ×OCH3 ) 、3189 ( 3 H , s ,
OCH3 ) 。其光谱数据与文献报道对照基本一致[13 ] ,
故化合物 E 鉴定为 5 ,6 ,7 ,8 ,4′2五甲氧基黄酮 (橘
红素) 。
化合物 C～E 的结构式见图 4。
3 　讨论
在应用 HSCCC 技术制备分离天然产物化学成
分的过程中 ,良好溶剂系统的选择是关键。可根据
需要选用二元、三元或多元溶剂系统 ,并控制上下两
·45· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 1 期 2010 年 1 月
图 4 　化合物 C～E的结构式
Fig14 　Structures of compounds C—E
相分层时间在 30 s 以内 ,且不能出现乳化现象 ,通
过简单试管法结合薄层色谱、高效液相色谱、毛细管
电泳等方法计算 k 值 ,尽量控制其值在 015～2 ,从
而确定最佳溶剂系统。另外 ,固定相及流动相的选
择、样品进样量、转速、流动相体积流量、柱温等亦是
考察的重要指标。
在选择最佳溶剂系统时 ,Ito[10]认为应控制α值≥
115 (分离度 ,α= k2 / k1 , k2 > k1 ) 。笔者认为在进行
多组分分离时 ,该条件不仅难以实现 ,且并无太大必
要 ,适当控制 k 值在 015～2 即可。本实验选用的溶
剂系统 ,αAB 、αBC 、αCD 、αDE经计算分别为 2123、2102、
1126、1136 ,化合物 C、D、E 依然得到了良好的分离。
在薄层色谱预试验中 ,发现在采用各种不同展
开剂的条件下 (如石油醚2醋酸乙酯 ,石油醚2丙酮等
不同比例溶剂系统) ,化合物 D (3 ,5 ,6 ,7 ,8 ,3′,4′2七
甲氧基黄酮) 及 E (橘红素) 其 Rf 值总相同 ,且由于
其相对分子质量接近 ,难以通过常规分离手段分离。
实验采用 HSCCC 技术 ,经一次制备分离 ,得到了高
纯度的两种化合物 ,该方法简单、可行 ,其结果不仅可
作为参考物质进一步应用于广陈皮的质量控制研究 ,
又可为柑橘属的植物分类学研究提供一定的依据。
致谢 :新会农业局、新会陈皮协会、广东省水果苗
木繁育场及新宝堂陈皮有限公司等单位在样品采集
及基地建设方面对本项目工作的大力支持和协助。
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