全 文 ：微量热法对小檗碱类生物碱抑菌作用的量效关系研究
代春美1, 2, 3 ,彭 成3 , 王伽伯2 , 肖小河2*
( 1 辽宁医学院,辽宁 锦州 121001; 2 解放军第三 二医院 全军中药研究所, 北京 100039;
3 成都中医药大学药学院, 四川 成都 610000)
摘 要:目的 测定黄连中的 3 种生物碱小檗碱、药根碱、巴马汀对痢疾杆菌生长代谢的影响,从热力学角度研究
小檗碱类生物碱抑菌作用的量效关系。方法 以微量热法测定小檗碱类生物碱作用于痢疾杆菌生长代谢的热谱
曲线, 并得出相应的热动力学参数, 如生长速率常数、产热功率、最大热功率出现时间、抑制率、传代时间等,根据热
动力学模型,拟合了 3 种生物碱产热功率质量浓度关系, 并进行初步的量效关系分析。结果 小檗碱、药根碱、巴
马汀对痢疾杆菌的生长代谢均有不同程度的抑制作用, 在 0 08~ 1 20 mg / mL 内随着质量浓度的增加, 最大热功
率出现时间和传代时间延长,生长速率常数降低和最大产热功率降低,抑制率增加, 且与药物质量浓度呈现一定的
量效关系。结论 3种生物碱对痢疾杆菌的抑菌活性的强度顺序为小檗碱 > 巴马汀 > 药根碱,从热力学角度研
究抑菌类中药的量效关系具有定量、灵敏、快速等优势。
关键词:黄连; 小檗碱; 微量热法; 量效关系
中图分类号: R285 5 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 07113604
Doseeffect relationship of berberine and analogues on antibacterial metabolism
of Bacillus shigae by microcalorimetry
DAI Chunmei1, 2, 3 , PENG Cheng3 , WANG Jiabo2 , XIAO Xiaohe2
( 1 L iaoning M edical University, Jinzhou 121001, China; 2. Institut e o f Chinese Mater ia Medica, 302 H ospital
of People s Liber ation A rmy , Beijing 100039, China; 3. Colleg e o f Pharmacy , Chengdu Univer sity
of T r aditional Chinese Medicine, Chengdu 610000, China)
Abstract: Objective T o study the effect of berberine, jatr orrhizine, and palmat ine in [ WT BX] Coptis
chinensis[ WTBZ] on the metabolism of [ WT BX] Bacillus shig ae [ WT BZ] and invest igate the doseeffect
relat ionship fr om the view of thermodynamics. Methods By m icrocalorimetry, the pow ertime curv es of
[ WT BX] B. shigae[ WT BZ] g row th w ere obtained and the act ion on them by addit ion of ber berine, jat ror
r hizine, and palmat ine at different concentrat ions [ WTBX] in vit ro [ WT BZ] was studied. Meanwhile, the
quant itat ive thermokinet ic parameters, such as g row th rate constant ( k1 , k2 ) , maximum heatoutput
( [ WT BX] P1 , P2 ) , peak t ime ( t1 , t 2 ) , inhibit ion rat io ( [ WTBX] I[ WTBZ] ) , and generation time ( [ WT
BX] tG ) obtained from these cur ves w ere analy zed and relationship of [ WTBX] P[ WT BZ] w as obtained.
Results Results suggested that berber ine, jatr orrhizine, and palmat ine had dif ferent inhibited ef fects on
[ WTBX] B. shig ae[ WTBZ] g row th in a dosedependent manner. With the concentrat ion incr easing f rom
0. 08 to 1. 20 mg / mL, thermokinet ic parameters, such as [ WT BX] P 1 , P2 , k1 , [ WTBZ] and [ WTBX] k2
[ WT BZ] diminished, [ WT BX] I[ WT BZ] and [ WTBX] t [ WTBZ] G increased. On the contr ary , the appear
ance t ime o f [ WT BX] t1 and t2 [ WT BZ ] p r olong ed. Conclusion Berberine and its analo gues have obv ious
ant imicrobial ef fect and the sequence of ant im icrobial act ivity w as berberin > palmat ine > jat rorr hizine.
Microcalo rimetry is a useful tool to evaluate the doseeffect relat ionship of ant imicrobial drug w ith its high
sensitiv iy and significant quant itative informat ion.
Key words: Cop t is chinensi s[ WT BZ ] F ranch. ; ber ber ine; micr ocalor imetr y ; doseef f ect r elat ionship
阐明中药量效关系, 科学地认识和把握中药剂
量,从合理用药特别是剂量角度探索提高中医药疗
效的新思路、新对策,是当前中医药研究的重大核心
课题。然而, 中药量效关系是否客观存在? 如何评
价中药的量效关系,这些关键科学问题不容回避,同
时又鲜有探究。
!1136! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
* 收稿日期: 20090909 基金项目: ∀ 973#计划项目 ( 2007CB512607) ; 国家自然科学基金资助项目 ( 30500665) ; 辽宁省教育厅科研项目计划 ( L2010334)作者简介:代春美( 1977 ∃ ) ,女,辽宁锦州人,讲师,在读博士,主要研究方向为中药药理。
T el: ( 0416) 4673175 Email: sprin gdaidai@ 163. com
* 通讯作者 肖小河
微量热法[ 1] (micr ocalorimetr y ) 是一种基于生
物热力学表达的生物活性检测方法,生物体生长代
谢过程中所伴随的能量和产热的变化, 可以采用热
动力学方法特别是微量热法进行检测, 尤其是对于
抑菌类药物,根据生物热动力学参数和热谱图,可实
时、连续、在线、灵敏地检测药物影响生物体代谢过
程中的热变化, 并可对其作用性质和强度进行定性
和定量分析 [ 2~ 4]。
黄连性寒、味苦,具有清热燥湿、泻火解毒、抗病
原微生物的作用, 主要成分包括小檗碱、药根碱、巴
马汀[ 5] 等。黄连有抑制痢疾杆菌作用, 其中小檗碱
对痢疾杆菌有较强的抑制作用, 药根碱和巴马汀与
小檗碱的结构相似, 药根碱和巴马汀是否也有类似
作用, 三者抑制痢疾杆菌的作用强弱程度如何? 其
量效关系如何? 本研究采用微量热法, 对 3种生物
碱对痢疾杆菌生长代谢过程的影响进行比较研究,
建立热谱图,获得相应的热动力学参数, 对其抑菌活
性进行客观量化评价, 并对 3 种生物碱抑制痢疾杆
菌的量效关系进行初步探讨。
1 材料与方法
1 1 供试菌株:痢疾杆菌 [ Baci llus shigae CMCC
( B) 51342] , 由武汉大学中国典型培养物保藏中心
提供。
1 2 样品:盐酸小檗碱 (批号 07139906)、盐酸巴
马汀 (批号 07329604)、盐酸药根碱 (批号 0733
200004) 对照品均购自中国药品生物制品检定所,
质量分数大于 98%。
1 3 培养基: LB 培养基, 取 10 g 蛋白胨, 5 g 酵母
膏, 5 g N aCl,溶于 1 000 mL 二次蒸馏水中, 调 pH
7. 2后分装, 121 % 高压蒸气灭菌 20 min, 4 % 冰
箱中放置备用。
1 4 实验仪器: 瑞典 Thermometric 公司产的
T AM Air 微量热仪,有关仪器结构、原理及操作见
参考文献内容 [ 6]。
1 5 实验方法:采用安瓿法。每个安瓿瓶精确加入
5 mL 培养基, 接种痢疾杆菌, 接种量为 1 & 106 /
mL,按实验要求加入一定量小檗碱、药根碱、巴马汀
药液,加盖瓶塞, 密封放入微量热仪中[ 7, 8] 。上述均
为无菌操作。在 37 % 下跟踪记录细菌生长代谢热
谱曲线,当曲线回到基线后,实验结束。
2 结果
2 1 痢疾杆菌生长代谢热谱曲线: 在 37 % , 安瓿
法测定了痢疾杆菌生长代谢热谱曲线及其在小檗
碱、药根碱、巴马汀作用下的生长代谢热谱曲线 (图
1)。在相同的条件下, 重复实验 3次,实验结果有良
好的重现性。痢疾杆菌的生长繁殖过程可分为 4个
时期:停滞期、第一指数生长期、第二指数生长期、衰
亡期。3种生物碱作用于痢疾杆菌的热谱曲线形状
相似,相对于对照组,痢疾杆菌的停滞期均延长, 曲
线的第一指数生长期和第二指数生长期出峰时间均
后移,峰形变得平缓,其整个代谢过程的时间延长,
尤其是小檗碱和巴马汀上述特征明显。区别在于:
相对于对照组,各样品的最高峰的峰高、出峰时间及
上升段的斜率不同。
A小檗碱 B药根碱 C巴马汀 a~ g0、0 08、0 16、0 24、0 40、0 60、120 mg ! mL- 1
Aberberine B jat rorrh izine Cpalmat ine a ∃ g0、008、0 16、0 24、0 40、0 60、1 20 m g ! mL- 1
图 1 痢疾杆菌在小檗碱类生物碱作用下的热谱曲线
Fgi . 1 Powertime curves of [ WTHX]B. shigae[ WTHZ] at 37 % affected by different concentrations of berberine and its analogues
2 2 痢疾杆菌生长热动力学参数的测定:在细菌的
指数生长期中: P t= P0 exp ( kt ) 或 ln[ WTBX] Pt =
ln[ WTBX] P 0+ [ WTBX] kt [ WT BZ]
[ 9, 10]
,其中 P 0、
P t分别是细菌在指数生长期的起始点和 t 时的热功
率。将热谱曲线上指数生长期的 ln[ WT BX] Pt对 t
进行线性拟合可得出痢疾杆菌第一指数生长期生长
速率常数 ( [ WTBX] k1 )。可得 [ WTBX] k1 = ( 0.
024 53 ∋ 0. 000 008) min- 1 ( n= 6) ,相关系数 ( r ) 均
大于 0 995 0, 可见其结果有非常好的重现性。
同时由 tG = ln2/ k1得出细菌传代时间 tG [ 11, 12]。
痢疾杆菌及在不同浓度药物作用下的 tG , k1、k2 , 大
热功率 P1、P2 ,出峰时间 t 1、t 2列于表 1中。细菌生
长抑制率( I )定义为 I= ( k0 - k1 ) / k0 [ 11, 12] , 式中 k0
为对照组痢疾杆菌的生长速率常数, k1为痢疾杆菌
!1137!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
在不同药物作用下的生长速率常数,小檗碱类药物
不同质量浓度对痢疾杆菌的 I 见表 1。
2 3 P2与药物质量浓度的量效关系:由表 1 可见,
随着药物质量浓度的增加,细菌第二指数生长期的
最大发热功率 P2相应减小。P2可以作为表征药物
表 1 小檗碱类生物碱作用于痢疾杆菌的热动力学参数
Table 1 Thermokinetic parameters for [WTHX] B. shigae[WTHZ] treated by berberine, jatrorrhizine, and palmatine at dif ferent concentrations
组 别 / ( mg ! mL - 1) k1 / m in- 1 k2 / m in- 1 P1/ mW P2 / mW t1 / m in t2/ min I /% tG / m in
对照 0 0 024 53 0 012 81 0 500 6 0 832 7 184 259 0 28 251 3
小檗碱 0 08 0 017 36 0 009 23 0 490 2 0 774 3 203 276 29 243 9 39 927 8
0 16 0 014 99 0 008 04 0 532 4 0 798 7 205 277 38 903 6 46 240 6
0 24 0 016 10 0 008 09 0 515 1 0 766 0 207 280 34 379 5 43 052 6
0 40 0 016 64 0 005 83 0 516 5 0 702 0 210 285 32 178 5 41 655 4
0 60 0 015 14 0 005 40 0 490 3 0 646 2 213 290 38 292 2 45 782 5
1 20 0 012 83 0 001 56 0 495 7 0 555 8 229 313 47 707 4 54 025 5
药根碱 0 08 0 017 38 0 008 79 0 513 4 0 815 6 207 281 29 162 4 39 881 8
0 16 0 017 33 0 009 49 0 486 5 0 786 3 208 283 29 366 2 39 996 9
0 24 0 016 36 0 011 69 0 511 7 0 794 7 210 285 33 318 7 42 368 4
0 40 0 018 02 0 009 80 0 491 6 0 771 9 210 287 26 553 9 38 465 4
0 60 0 016 99 0 007 72 0 511 6 0 751 8 214 291 30 752 0 40 797 3
1 20 0 015 29 0 007 60 0 521 9 0 746 1 213 290 37 680 9 45 333 3
巴马汀 0 08 0 017 40 0 009 72 0 511 2 0 828 5 186 262 29 080 9 38 836 0
0 16 0 017 55 0 009 94 0 510 9 0 826 2 189 265 28 469 5 39 495 5
0 24 0 019 91 0 008 62 0 487 9 0 802 4 190 267 18 850 6 34 814 0
0 40 0 018 01 0 009 27 0 482 4 0 783 5 192 271 26 594 7 38 486 8
0 60 0 017 31 0 008 37 0 469 0 0 741 8 195 277 29 447 7 40 043 1
1 20 0 017 10 0 008 24 0 437 0 0 738 9 199 288 30 303 6 40 534 9
抑菌活性的特征参数之一。以 P 2对药物质量浓度
()进行线性拟合, 其斜率绝对值越大, 抑菌作用就
越强。P2与 的关系为小檗碱: P2 = 0. 813 85 -
2. 303 21 & 10- 4 , r = - 0. 972 73; 药根碱: P2 =
0. 804 92- 5. 866 01 & 10- 5 , r= - 0. 890 69; 巴马
汀: P2= 0. 833 2- 1. 177 25 & 10- 4 , r= - 0. 976 06;
(质量浓度范围为 0. 08~ 1. 20 mg/ mL)。从 P2与
的量效关系图 (图 2) 中,可以看出小檗碱的抑菌作
用最强,巴马汀、药根碱依次递减。
图 2 P2 与 的量效关系图
Fi g. 2 Doseeffect relationship of [WTHX] P[WTHZ] 2 and
3 讨论
本研究利用热力学方法及其热动力学参数, 从
细胞水平上对小檗碱类生物碱的抑菌作用进行了定
量研究与分析。本研究中黄连 3种小檗碱类成分对
痢疾杆菌均有一定的抑制作用, 其抑菌活性可借助
于热动力学参数进行定量。生长速率常数 ( k ) 值
可作为表征细菌生长代谢过程的特征常数之一, 因
此在其他条件相同而加入不同抑制性药物时, k 值
的改变可作为评价药物抑菌作用大小的参数。本研
究中,小檗碱、药根碱、巴马汀随着质量浓度的增加,
k1、k2总体趋势减小, 尤其是 k2 减小的趋势更为明
显,但未显现明显线性关系;随着药物质量浓度的增
加,细菌生长抑制率增加,以小檗碱的抑制率增加最
为显著,药根碱、巴马汀随着药物质量浓度的改变,
抑菌强度增加的程度相对较弱。同时, 随着药物质
量浓度的增加, tG也相应增加, 尤其是小檗碱随着药
物质量浓度的增加, tG明显延长,提示小檗碱对痢疾
杆菌的抑菌作用比较显著。在热动力学参数中, 第
二指数生长期最大热功率 P2 与药物质量浓度呈线
性关系,对于定量评价小檗碱类生物碱抑菌作用具
有重要意义。
对于抑菌类中药的量效关系研究, 以往的传统
方法如管碟法和比浊法[ 13] 虽能反应药物抑菌作用
的强弱,但不能获得实时在线的数据,且灵敏性相对
于微量热法要低。而以热力学理论为指导的中药生
物活性测定, 反映了中药的整体效应,其中生长速率
常数、最大发热功率及出峰时间具有明显的特征性,
!1138! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
符合中医药的整体观,并具有高效、灵敏、实时、在线
等特点,且能获得定性定量的数据,对中药量效关系
及药效物质基础研究提供了新的技术平台, 具有一
定的应用前景。
参考文献:
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黄芩中黄酮类成分活性作用的虚拟评价
商 倩1, 2 , 刘 巍2 ,徐为人2* ,刘 鹏2 ,刘冰妮2 ,韩英梅2 ,汤立达2
( 1 天津医科大学基础医学院, 天津 300070; 2 天津药物研究院 天津市新药设计与发现重点实验室,天津 300193)
摘 要:目的 利用理论对接方法研究黄芩中黄酮类化合物的潜在作用机制。方法 选取黄芩中 8 个黄酮类化合
物 (包括苷元及其苷) ,收集现有靶标的晶体结构, 利用 Schrdinger 软件进行计算,以分级标准评价选择性。结果
文献报道黄芩黄酮类化合物药理作用共 26 种,其中与苷元及其苷类化合物对接结果相符的个数分别为 9 个和 25
个。表明苷元及其苷类化合物的靶标选择性与虚拟评价有差异, 苷类化合物的结果与文献更接近。结论 说明虚
拟评价技术对于中药复杂作用系统的研究具有较大的实用性, 苷元与苷类化合物体内作用效果相似,而体内代谢
是药物虚拟评价过程中非常重要的影响因素。
关键词:黄芩; 黄酮类化合物; 虚拟评价
中图分类号: R285 51 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 07113904
Virtual evaluation on activities of flavonoids from Scutellar ia baicalensis
SHANG Qian
1, 2
, L IU Wei
2
, XU Weiren2 , L IU Peng 2 , LIU Bingni2 , HAN Yingmei2 , TAN G Lida2
( 1 Basic Medical Colleg e, T ianjin Medical Univer sity, T ianjin 300070, China; 2. T ianjin Key Labor ator y of M olecular Design
and Drug Discover y, T ianjin Instit ute o f Pharmaceutical Resear ch, T ianjin 300193, China)
Abstract: Objective To explore the invest igat ion method of complicated Chinese materia medica
( CMM ) , the potent ial action mechanisms of f lav ono ids f rom S cutel lar ia baicalensi s were studied by doc
king calculat ion. Methods In to tal, eight flavonoids ( agly cones and their gly cosides) f rom [ WTBX] S.
baicalensis[ WTBZ] w ere selected as ligand. The crystalline st ructures of targets related to common disea
ses w ere used as the receptors for calculat ion. The calculat ions w ere conducted w ith Schrdinger softw are
package. The g rading standard o f select ivity w as developed according to Gsco re betw een lig ands and re
!1139!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
* 收稿日期: 20100310 基金项目:科技部支撑项目 ( 2007BAI41B01) ; 天津市应用基础与前沿技术项目 ( O7T CZDJC05300)作者简介:商 倩( 1983 ∃ ) ,女,天津人,硕士研究生,研究方向为新药设计与筛选。Email : dt sm alau@ hotmail. com
* 通讯作者 徐为人 T el: ( 022) 23003529 Email: xw rt j@ yah oo. com . cn