全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 7 期 2011 年 7 月

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小檗碱抑制组织因子活性和静脉血栓形成的实验研究
陈 玲，寇俊萍，余伯阳*
中国药科大学 中药复方研究室，江苏 南京 211198
摘 要：目的 研究小檗碱体内外对抑制组织因子（tissue factor，TF）活性和静脉血栓形成的影响。方法 采用肿瘤坏死因
子-α（TNF-α）活化人单核细胞株 THP-1 细胞模型，应用发色底物法测定 TF 的促凝活性，Western blotting 检测 TF 蛋白表达，
考察小檗碱体外对 TF 的作用；采用下腔静脉结扎致小鼠血栓模型，考察小檗碱体内给药对血浆 TF 活性及血栓形成的影响。
结果 TNF-α（25 ng/mL）作用 5 h 能明显诱导 THP-1 细胞 TF 表达和活性增强，小檗碱（10～1 000 nmol/L）明显抑制 TNF-α
诱导的 TF 蛋白表达和促凝活性的增强，其 IC50约 25.71 nmol/L；阳性药姜黄素 1 000 nmol/L 也具有明显抑制作用。小檗碱
（1、10、100 mg/kg）单次 ig 给药，显著或非常显著降低下腔静脉结扎 6 h 致血栓模型小鼠升高的血浆 TF 促凝活性，并可明
显减少血栓干、湿质量，阳性药华法林钠片 1 mg/kg 也有明显抑制作用。结论 小檗碱体内外给药均显著降低 TF 促凝活性
及其蛋白表达，并可抑制 TF 相关的静脉血栓形成。
关键词：小檗碱；组织因子；THP-1 细胞；肿瘤坏死因子-α；静脉血栓
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)07 - 1389 - 04
Inhibition of berberine on tissue factor activity and venous thrombosis
CHEN Ling, KOU Jun-ping, YU Bo-yang
Department of Complex Prescription of Traditional Chinese Medicine, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China
Key words: berberine; tissue factor (TF); THP-1 cells; tumor necrosis factor-α (TNF-α); venous thrombosis

组织因子（tissue factor，TF）作为凝血级联反
应的启动因子，是介导血栓形成和炎症反应的关键
蛋白之一，参与深静脉血栓、动脉粥样硬化、肿瘤
转移等多种重大疾病的发生与发展过程，干预 TF
途径已成为防治心血管疾病的一种新治疗策略[1-3]。
小檗碱（berberine）是从黄连等中药中分离出的一
种异喹啉类生物碱，具有抗炎、调血脂、抗肿瘤等
广泛药理活性[4-7]，临床用于治疗心脑血管疾病，疗
效确切[8]。本课题组前期研究发现，小檗碱可抑制
脂多糖（LPS）诱导的人外周血单核细胞 TF 促凝活
性的增加[9]，鉴于肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的
单核细胞表达TF在心血管疾病中的重要作用[10-11]，
本研究拟考察小檗碱对TNF-α诱导的人单核细胞株
THP-1 细胞的 TF 促凝活性及其蛋白表达的影响，
继而观察其对 TF 参与的静脉血栓模型的效应，为
阐释其防治心血管疾病提供新证据。
1 材料
1.1 药物与试剂
小檗碱（质量分数 98%）、姜黄素（质量分数
98%），均为南京青泽医药科技开发有限公司产品；
RPMI 1640 液体培养基（Hyclone 公司），胎牛血清
（澳大利亚 PAA 公司），重组人肿瘤坏死因子-α（美
国 HumanZyme 公司），凝血因子 Xa 发色底物（美
国 Sigma 公司），人凝血酶原复合物（华兰生物工
程股份公司），牛血清白蛋白（BSA，罗氏公司），
TF 单克隆抗体（美国 R&D 公司），GAPDH（上海
康城生物工程有限公司），HRP 标记的山羊抗小鼠
第二抗体（武汉博士德生物工程有限公司），ECL
发光试剂盒（碧云天生物技术研究所），华法林纳片
（芬兰 Orion Corporation），其余试剂均为分析纯。
1.2 细胞
THP-1 细胞（人外周血单核细胞株）购自中国

收稿日期：2010-11-01
基金项目：中国药科大学中央高校基本科研业务费专项资金重点项目（JKZ2009010）
作者简介：陈 玲（1986—），女，江苏淮安人，硕士研究生，研究方向为中药物质基础与活性相关性研究。
Tel: (025)86185157 E-mail: chenling863@gmail.com
*通讯作者 余伯阳 Tel: (025)81685158 E-mail: boyangyu59@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 7 期 2011 年 7 月

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科学院上海细胞生物学研究所。
1.3 动物
雄性 ICR 小鼠，清洁级，体质量 25～30 g，由
扬州大学比较医学中心提供，合格证号：SCXK（苏）
2007-0001。
1.4 仪器
细胞培养箱（德国 Heraeus 公司），超净工作台
（苏州苏净集团安泰公司），Z—323K冷冻离心机（德
国 Hermle 公司），酶标仪 Sunrise（奥地利 Tecan 公
司），电泳仪、凝胶成像仪（美国 Bio-Rad 公司），
电子分析天平（上海 Mettler Toledo 公司）。
2 方法
2.1 体外对 TF 活性的影响
2.1.1 THP-1 细胞培养 THP-1 细胞以含 10%胎牛
血清的 RPMI 1640 培养基（含 50 μmol/L β-巯基乙
醇、2.05 mmol/L 谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100
μg/mL 链霉素）在 37 ℃、5% CO2 条件下培养。当
细胞密度达到 8×105/mL 时，进行传代培养（离心
法），即以 1 000 r/min，离心 5 min，弃上清，沉淀
用新鲜的 10% RPMI 1640培养基以 2×105/mL的密
度传代接种。
2.1.2 诱导表达 TF 将 THP-1 细胞用 10% RPMI
1640 培养基悬浮，以 1×106/mL 的细胞密度接种于
96 孔培养板（150 μL/孔）或者 6 孔培养板（2 mL/
孔），37 ℃、5% CO2 培养 24 h 后，吸取培养基，
换成无血清 RPMI 1640 培养基，同步化 1 h。实验
分为对照组、模型组、给药组。小檗碱不同浓度（10、
100、1 000 nmol/L）或姜黄素 1 000 nmol/L 作用 1 h，
再加入 TNF-α（25 ng/mL），共同孵育 5 h 后，将 96
孔板内培养基吸去，每孔加无血清 RPMI 1640 培养
液 100 μL，−70 ℃至室温反复冻融 3 次，待测。收
集 6 孔板中的细胞，加入适量细胞裂解液，于冰上
裂解 30 min，4 ℃、12 000 r/min 离心 10 min，取
上清，用 BCA 蛋白测定试剂盒测定，−70 ℃保存
备用。
小檗碱先溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配成
100 mmol/L 的高浓度母液，临用前以 RPMI 1640
培养基稀释到所需浓度，DMSO 的最终体积分数均
为 0.1%。
2.1.3 TF活性的测定 吸取45 μL细胞裂解液接种
于 96 孔板中，37 ℃温育 5 min，加入新鲜配制的
人凝血酶原复合物（PPSB）溶液（0.01 g/mL，5 μL/
孔，含有 CaCl2 100 mmol/L），温育 15 min，再加入
新鲜配制的发色底物溶液（0.5 mmol/L，50 μL/孔，
含 100 mmol/L EDTA），温育 3 min，用酶标仪于 405
nm 测定吸光度（A）值[10]。
2.1.4 Western blotting 测定 TF 蛋白表达 总蛋白
40 μg 与样品缓冲液作用，沸水变性 5 min 后，以
12.5% SDS-PAGE 电泳分离蛋白，再以 100 V 恒压
转移至 PVDF 膜；置于含有 3% BSA 的 PBST 溶液
室温封闭 2 h；再分别用相应的鼠抗人 TF 单克隆抗
体（1 800∶ ）、GAPDH（1 5∶ 000），4 ℃孵育过夜，
次日用 PBST 洗涤 3 次，10 min/次，采用 HRP 标记
的羊抗鼠 IgG 抗体（1 5∶ 000），室温孵育 2 h，PBST
洗涤 3 次，10 min/次，加入 ECL 显色试剂，置于凝
胶成像系统中拍照保存。
2.2 体内对静脉血栓形成的影响
2.2.1 下腔静脉结扎致小鼠血栓形成模型 雄性
ICR 小鼠 48 只，25～30 g，随机分为 6 组，每组 8
只，分别为对照组（蒸馏水）、模型组（蒸馏水）、
小檗碱（1、10、100 mg/kg）组和阳性对照华法林
钠片（1 mg/kg）组。各组分别单次 ig 给药 1 h 后，
ip 给予 4%水合氯醛溶液（10 mL/kg）麻醉小鼠，
仰卧固定，于腹正中线切开皮肤约 1.5 cm，从腹白
线切开腹膜，分离下腔静脉，于左肾静脉下方用粗
丝线结扎下腔静脉，缝合腹膜，对照组分离下腔静
脉后只穿线不结扎。6 h 后眼眶取血，分离血浆待测；
并重新打开腹腔，在结扎线下方 2 cm 处用止血钳夹
住血管，剪取该段血管，观察有无血栓形成，若已
形成，将血栓取出称湿质量，然后放入烘箱内，60 ℃
干燥 24 h，称血栓干质量。
2.2.2 小鼠血浆 TF 活性的测定 取小鼠血浆，按
“2.1.3”项下方法测定 TF 的活性。
2.3 统计学分析
所有数据采用 sx ± 表示，各组数据比较采用方
差分析。
3 结果
3.1 对 TNF-α 诱导的 THP-1 细胞 TF 促凝活性的
影响
由图 1 可见，TNF-α（25 ng/mL）刺激 THP-1
细胞 5 h 后，能使其促凝活性非常显著地增加；10～
1 000 nmol/L 小檗碱可明显抑制 TNF-α 诱导的
THP-1 细胞 TF 活性，与模型组比较，具有非常显
著差异（P＜0.01），小檗碱对 TF 的 IC50 为 25.71
nmol/L；1 000 nmol/L 小檗碱与同浓度姜黄素的抑
制率相当（分别为 93.45%、94.65%）。
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与对照组比较：##P＜0.01；与 TNF-α组比较：**P＜0.01
##P＜0.01 vs control group; **P＜0.01 vs TNF-α group
图 1 小檗碱对 TNF-α诱导的 THP-1 细胞 TF 促凝活性的
影响 ( 3=± n , sx )
Fig. 1 Effect of berberine on TF procoagulant activity
in THP-1 cells induced by TNF-α ( 3=± n , sx )
3.2 对 TNF-α 诱导的 THP-1 细胞 TF 蛋白表达的
影响
Western blotting 结果显示（图 2），TNF-α（25
ng/mL）作用 5 h 后能明显增加 THP-1 细胞 TF 蛋白
的表达，当小檗碱（10～1 000 nmol/L）预处理 1 h，
再与 TNF-α（25 ng/mL）共孵育 5 h 后，能明显抑
制 TNF-α诱导的 THP-1 细胞 TF 蛋白的表达，阳性
对照药姜黄素 1 000 nmol/L 也呈明显抑制作用。

图 2 小檗碱对TNF-α诱导的THP-1细胞TF蛋白表达的影响
Fig. 2 Effect of berberine on TF expression
in THP-1 cells induced by TNF-α
3.3 对下腔静脉结扎模型小鼠血栓形成的影响
由图 3 可见，小檗碱 10、100 mg/kg 对小鼠下
腔静脉结扎血栓形成均具有明显的抑制作用，与
模型组比较具有显著或非常显著的差异（P＜0.05、
0.01）。阳性药华法林钠片 1 mg/kg 也能明显减少血
栓质量。
3.4 对下腔静脉结扎模型小鼠血浆 TF 活性的影响
由图 4 可见，下腔静脉结扎模型组小鼠血浆 TF
活性明显增强，与对照组比较差异非常显著（P＜
0.01）；10、100 mg/kg 小檗碱能使升高的 TF 活性明
显下降，高剂量组的抑制率为 95.00%；阳性药华法
林钠片 1 mg/kg 也能使升高的 TF 活性下降，抑制率
为 74.28%。

与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
*P<0.05 **P<0.01 vs model group
图 3 小檗碱对下腔静脉结扎模型小鼠血栓形成的影响
( 8=± n , sx )
Fig. 3 Effect of berberine on venous thrombosis induced
by IVC ligation in mice ( 8=± n , sx )

与对照组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
##P<0.01 vs control group; *P<0.05 **P<0.01 vs model group
图 4 小檗碱对下腔静脉结扎模型小鼠血浆 TF 促凝活性的
影响 ( 8=± n , sx )
Fig. 4 Effect of berberine on plasma TF procoagulant
activity in venous thrombosis induced
by IVC ligation in mice ( 8=± n , sx )
4 讨论
单核细胞是血液循环中影响凝血和止血过程的
主要细胞[11]，在正常生理状态下，单核细胞不能引
发血液凝固，但在 TNF-α 等一些炎症介质及 LPS、
佛波酯等刺激下，可诱导单核细胞大量表达 TF，介
导动脉血栓、脓毒血症、肿瘤等多种疾病的病理过
程。干预单核细胞 TF 表达或活性，有利于上述疾
病的防治[12]。
本实验首先采用 TNF-α诱导 THP-1 细胞，考察
了小檗碱体外给药对 TF 的影响。Western blotting
结果显示，正常培养的 THP-1 细胞仅少量表达 TF，
TNF-α 25 ng/mL 刺激 5 h，可明显上调 THP-1 细胞
的 TF 表达；小檗碱 10～1 000 nmol/L 可明显抑制
模型 1 10 100 华法林钠片
小檗碱/(mg·kg–1)
6.00
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
血
栓
质
量
/m
g
**
湿质量
干质量
** **
* * *

小檗碱/(nmol·L–1)
对照 TNF-α 10 100 1 000 姜黄素
TF
GAPDH
对照 TNF-α 10 100 1 000 姜黄素
小檗碱/(nmol·L–1)
120
80
40
0
TF
活
性
/%

##
**
**
** **
对照 模型 1 10 100 华法林钠片
小檗碱/(mg·kg–1)
120
80
40
0
TF
活
性
/%

##
*
**
**
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升高的 TF 表达。同时，也明显降低 TF 的促凝活性，
其 IC50约 25.71 nmol/L。与文献报道类似[13]，姜黄
素也显示出明显的抑制 TF 活性，证实小檗碱体外
加药具有显著抑制单核细胞表达 TF 作用。
已有研究显示，大鼠下腔静脉结扎可快速诱导
TF 表达增加[14]，临床深静脉血栓（DVT）患者单
核细胞和血浆 TF 活性明显升高，二者呈正相关[15]，
进一步证实单核细胞诱导的 TF 是诱导 DVT 的重
要发病机制之一[16]。本实验采用下腔静脉结扎致小
鼠血栓模型，考察小檗碱体内给药对 TF 的影响。
结果显示，小檗碱 10、100 mg/kg 单次 ig 给药，可
显著或非常显著降低 DVT 模型小鼠血浆升高的 TF
促凝活性，同时也明显抑制静脉血栓的形成。与已有
研究类似[17]，口服抗凝血药华法林钠片也能够显著
降低 TF 活性和血栓质量，证实小檗碱体内给药具
有明显抑制 TF 活性和静脉血栓形成作用。
综上所述，抑制 TF 的表达及活性，可能是小
檗碱防治心血管疾病的作用机制之一，该研究结果
为其临床应用提供新的依据。小檗碱调节 TF 的信
号转导途径值得深入研究。
参考文献
[1] Chu A J. Role of tissue factor in thrombosis. Coagulation-
inflammation-thrombosis circuit [J]. Front Biosci, 2006,
11(1): 256-271.
[2] Mackman N. The many faces of tissue factor [J]. J
Thromb Haemost, 2009, 7(Suppl 1): 136-139.
[3] Steffel J, Luscher T F, Tanner F C. Tissue factor in
cardiovascular diseases: molecular mechanisms and
clinical implications [J]. Circulation, 2006, 113(5):
722-731.
[4] 王 静, 张艳军, 常亮堂. 小檗碱对Aβ25-35损伤大鼠皮
层神经元的保护作用 [J]. 中草药 , 2011, 42(4):
728-733.
[5] 章 涛, 李苌清, 杨俊卿, 等. 小檗碱抑制人乳腺癌
MDA-MB-231 细胞增殖及其与过氧化物酶体增殖物激
活受体 γ的关系 [J]. 中草药, 2009, 40(2): 244-247.
[6] Jin J L, Hua G Q, Meng Z, et al. Antibacterial mechanisms
of berberine and reasons for little resistance of bacteria
[J]. Chin Herb Med, 2011, 3(1): 27-35.
[7] Sun Y, Xun K, Wang Y, et al. A systematic review of the
anticancer properties of berberine, a natural product from
Chinese herbs [J]. Anticancer Drugs, 2009, 20(9): 757-769.
[8] Li B, Zhu W L, Chen K X. Advances in the study of
berberine and its derivatives [J]. Acta Pharm Sin, 2008,
43(8): 773-787.
[9] 孙 祺, 邵方娴, 李晶晶, 等. 调节组织因子功能的中
草药有效成分研究进展 [J]. 中草药, 2010, 41(3): 488-
491.
[10] Jiang W W, Kou J P, Zhang Z, et al. Effects of twelve
representative flavonoids on tissue factor expression in
human monocytes: structure-activity relationship [J].
Thromb Res, 2009, 124(6): 714-720.
[11] Shantsila E, Lip G Y. Monocytes in acute coronary
syndromes [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2009,
29(10): 1433-1438.
[12] Zhang H, Park Y, Wu J, et al. Role of TNF-α in vascular
dysfunction [J]. Clin Sci, 2009, 116(3): 219-230.
[13] Pendurthi U R, Williams J T, Rao V M. Inhibition of
tissue factor gene activation in cultured endothelial cells
by curcumin. Suppression of activation of transcription
factors Egr-1, AP-1, and NF-kappa B [J]. Arterioscler
Thromb Vasc Biol, 1997, 17(12): 3406-3413.
[14] Zhou J, May L, Liao P, et al. Inferior vena cava ligation
rapidly induces tissue factor expression and venous
thrombosis in rats [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,
2009, 29(6): 863-869.
[15] Vieira L M, Dusse L M, Fernandes A P, et al. Monocytes
and plasma tissue factor levels in normal individuals and
patients with deep venous thrombosis of the lower limbs:
Potential diagnostic tools? [J]. Thromb Res, 2007, 119(2):
157-165.
[16] Lopez J A, Kearon C, Lee A Y. Deep Venous Thrombosis
[M]. Washington: The American Society of Hematology,
2004.
[17] Edwards R L, Schreiber E, Brande W. The effect of
sodium warfarin on rabbit monocyte tissue factor
expression [J]. Thromb Res, 1986, 42(2): 125-137.