全 文 ：当归红芪超滤物对氧化损伤乳鼠心肌细胞的保护作用及其机制
马燕花1, 2 ,李应东2 ,赵健雄1* ,王 婷1 *
( 1 兰州大学中西医结合研究所,甘肃 兰州 730020; 2 甘肃中医学院,甘肃 兰州 730020)
摘 要:目的 探讨当归红芪超滤物对 H 2O2致乳鼠心肌细胞氧化损伤的保护作用及其可能机制。方法 用高浓
度的 H 2O2 ( 400mo l/ L) 在 Wista r乳鼠原代培养的心肌细胞上建立氧化损伤模型,用不同质量浓度的当归红芪超
滤物 ( 3 75、7 5、15 mg / mL ) 进行干预。在倒置显微镜下观察各实验组心肌细胞的搏动频率, 用 MTT 法检测心
肌细胞的存活率,用试剂盒检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶 ( LDH)、肌酸激酶 ( CK ) 的活性及细胞内超氧化物
歧化酶 ( SOD) 的活性、丙二醛 ( MDA )、髓过氧化物酶 ( MPO ) 的量。RTPCR 技术检测 caspase3、hsp70 基因在
心肌细胞中的表达情况。结果 当归红芪超滤物显著提高氧化损伤心肌细胞的细胞活力; 与损伤组比较, 当归红
芪超滤物各干预组心肌细胞 LDH、CK、M PO、MDA 量显著降低 ( P < 0 01) , SOD 活性显著提高 ( P < 0 01) ,
caspase3 基因表达显著降低 ( P< 0 05) , hsp70 基因表达显著提高 (P < 0 05) , 差异具有统计学意义; 并且当归红
芪超滤物的抗氧化损伤作用呈剂量依赖性。结论 当归红芪超滤物具有良好的抗氧化损伤作用,其机制可能与清
除自由基、上调 hsp70 表达、抑制 caspase3 活性有关。
关键词:当归红芪超滤物; 氧化损伤; 心肌细胞; 热休克蛋白 70
中图分类号: R285 5 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 04060206
Protection of ultrafiltration extract mixture from Angelica sinensis and Hedysarum polybot rys
on oxidative damage in cardiomyocytes of neonatal rats and its mechanism
MA Yanhua1, 2 , LI Yingdong2 , ZHAO Jianx iong 1 , WANG T ing1
( 1 Institute of Combination of Chinese T raditional with West ern Medicine, Lanzhou U niv ersit y, L anzhou 730020, China;
2. Gansu Colleg e of T r aditional Chinese Medicine, Lanzhou 730020, China)
Abstract: Objective To invest igate w hether the adm inist rat ion o f the ult raf iltr at ion ex t ract mix ture
from A ngel ica sinensi s and H edy sarum poly botr y s is able to pr otect cardiomyocy tes f rom ox idat ive injury
of rats induced by H 2O2 and its potent ial mechanism. Methods Myocardial cells fr om 2 3 d neonatal rats
w ere cultured in DF medium and the cellular injury w as induced by H 2O 2 . The ultr afilt rat ion ex t ract mix
ture f rom A . sinensi s and H . p oly botr y s was given in three doses of 3. 75, 7. 5, and 15 mg/ mL. M orpho
logical changes o f cardiomyocytes w er e observed by m icroscope. Surv iv al r ate of myocardial cells w as as
sessed using MT T. The cardiomyocyte damages w ere est imated by detecting lactate dehydro genase ( LDH )
and cr eat ine kinase ( CK) releases in the medium, superox ide dismutase ( SOD) act ivities and int racellular
malondialdehyde ( MDA) , and myeloperox idase ( MPO) contents. T he levels o f caspase3 and hsp70 ex
pression in cardiomyocytes w ere measured by RTPCR. Results T he ult raf ilt ration ext ract mixture could
pro tect the cardiomyocytes f rom H 2O2 injury in a dosedependent manner ( 3. 75, 7. 5, and 15 mg/ mL) .
The ult raf iltr at ion ex t ract mixture could signif icant ly decrease LDH and CK leakages and int racellular
MDA and MPO contents, increase SOD activity, upregulate hsp70 expression, and downregulate caspase
3 expression. Conclusion T he ult raf ilt ration ex tract mixture has protect ion on cardiomyocytes injur ed by
H 2O2 through impr oving cell ant iox idant ability, upr egulat ing hsp70 expression, and inhibit ing caspase3
act ivity .
Key words: ult rafilt rat ion ex tr act mixture fr om A ng el ica sinensi s ( Oliv. ) Diels. and H edy sar um
poly botr y s Hand.Mazz. ; ox idative injury; cardiomyocyte; heat shock protein 70
当归、红芪是中医补血、益气的常用药物。当归 为伞形科植物当归 A ngel ica sinenesi s ( Oliv. )
!602! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月
收稿日期: 20090716 基金项目: ∀ 十一五#国家科技支撑计划项目 ( 2006BAI06A2004) ; 国家科技支撑计划资助项目 ( 2007BAI37B01)作者简介:马燕花( 1976 ) ,女,甘肃人,博士研究生,讲师,主治医师,主要研究方向为中西医结合内科临床。
T el : 13893411954 Email: 617747928@ qq. com
* 通讯作者 赵健雄
Diels的干燥根, 性甘、辛、温,归肝、心、脾经,其主要
成分为多糖、阿魏酸、挥发油等。红芪系多序岩黄芪
H edy sar um poly botr y s Hand.Mazz. 的干燥根, 与
黄芪同科异属, 以其根皮带红棕色而得名。红芪中
含有众多的生物活性物质, 如氨基酸、有机酸、谷
甾醇、红芪多糖、微量元素等, 且含有黄芪中不存在
的抗菌成分 13羟基9甲氧基紫檀烷。近年来研究
发现, 当归、红芪有效成分均具有清除自由基 [ 1, 2]、
抗肿瘤 [ 3~ 5]、抗辐射损伤 [ 6]等作用。两药按 1∃ 5 配
伍组成的当归补血汤,为中医补血生脉的基本方, 当
归红芪超滤膜提取物合剂来自于经典名方当归补血
汤。膜分离技术是一项新兴的高效分离技术, 已被
国际公认为 20世纪末到 21世纪中期最有发展前途
的一项重大高新生产技术 [ 7, 8]。超滤技术是 20世纪
60~ 70年代发展起来的一种膜分离技术,它是用多
孔性半透膜为介质, 以错流方式进行滤过。由于中
药中的化学成分很多,类型非常复杂,而传统中医的
水煎剂提取方法所含杂质、非药用性成分或药用性
较差的成分较多,使中药药效低下,超滤技术可对中
药进行提纯、分离[ 9] , 显著提高了其药效。本实验运
用超滤膜技术提取当归、红芪合剂 ( 1 ∃ 5) 中有效
成分,以过氧化氢 ( H 2O2 ) 造成心肌细胞氧化损伤
模型,探讨其对心肌细胞氧化损伤的保护作用及其
机制。
1 材料
1 1 动物: 1~ 2日龄 Wistar 乳鼠由甘肃中医学院
科研实验动物中心提供, SPF 级, 动物合格证编号
为: SCXK (甘) 2004000600000012。
1 2 主要仪器与试剂: BB16UV 型二氧化碳培养
箱,德国 Heraeus公司; VS 1300L 型超净工作台,
苏净集团; IX71 型倒置相差光学显微镜, 日本
Olympus 公司产品; 电子天平, 德国 Sarto rius 生
产;恒温孵育箱,金坛市恒丰仪器厂; Sony717 相机,
日本; 101 型电热恒温烘干箱,北京科伟永鑫实验仪
器设备厂;美国亚培全自动生化分析仪; 680 系列酶
标仪,美国伯乐 ( BioRad) 公司产品。PE2400 型
PCR 扩增仪, 美国 PE 公司产品; AlphaImager2200
型凝胶成像分析系统, 美国 Alpha 公司产品;
DYCP31D 型电泳槽、DYY 12 型电脑三恒多用电
泳仪, 北京市六一仪器厂。DF 培养液: DMEM
( Dulbecco%s M odif ied Eag les%Medium ) 培养基与
HamF12 培养基按 1 ∃ 1 比例混合, 为美国 Sigma
公司产品。新生牛血清 ( NBCS) , 杭州四季青生物
材料工程研究所。胰蛋白酶消化液,上海生物工程
有限公司。 &型胶原酶, 美国 Sigma 公司产品; 5
Br,美国 Sigma 公司产品; 30% H 2O2 ,天津市百世
化工有限公司产品。超氧化物歧化酶 ( SOD)、丙二
醛 ( MDA)、乳酸脱氢酶 ( LDH )、肌酸激酶 ( CK)、
髓过氧化物酶 ( MPO) 测定试剂盒,南京建成生物
工程研究所产品; MT T 试剂盒, 碧云天生物技术研
究所; RTPCR 试剂盒, Fermentas公司; T rizo l, In
vit rog en;引物由大连宝生物合成。其他试剂均为国
产分析纯。当归红芪超滤膜提取物 (相对分子质量
1 ∋ 105滤过物) 由甘肃中医学院科研实验中心与甘
肃省膜科学研究院联合制备。
2 方法
2 1 当归、红芪及当归红芪合剂超滤膜提取物的制
备: 依照文献提供的方法进行制备 [ 10] , 以药材煎
煮 (粗滤(浓缩(微滤 (超滤(浓缩 (包装、贮存、
备用的流程制成每毫升药液含 1 g 生药的超滤膜提
取药液 (相对分子质量 1 ∋ 105 )。运用紫外分光光
度计和高效液相色谱法对多糖及阿魏酸进行测定,
相对分子质量 1 ∋ 105超滤物中不含阿魏酸, 多糖的
量为 19 57 mg/ mL[ 11] ,略高于单剂当归中的量。
2 2 乳鼠心肌细胞原代培养: 参照 Simpson 等[ 12]
的方法,略有改进。无菌操作下取出生 1~ 3 d 的
Wistar 乳鼠心脏心尖部, 立即在 PBS 液中洗去残
血,用眼科剪将心肌剪成约 1 mm 3碎块, 放入 50
mL 三角烧瓶中, 加入 0 08% 胰蛋白酶消化液 5
mL,在 37 ) 恒温孵育箱中进行消化, 10 min 后取
下吸弃上清,再加入 5 mL 胰蛋白酶消化液, 同样消
化 10 min 后取下吸弃上清,第 3次加入等量胶原酶
消化液消化 8 min 后, 收集上清于离心管,并向离心
管中加入少量 DMEMH amF12 ( 1 ∃ 1) 培养基和
小牛血清终止消化。上述过程反复进行 8~ 10 次
至组织块完全消化, 200 目钢网滤过后离心收集细
胞,重悬于含 15% 小牛血清的 DF 培养基, 37 )
CO 2培养箱中静置培养 1 5 h,以差速贴壁法纯化心
肌细胞,将细胞密度调至 5 ∋ 105 / mL, 接种于 24 孔
培养板中。每 48 h 换液 1次,培养 48 h 后可见细
胞融合并出现整体搏动,于培养 72 h 后进行实验。
2 3 氧化损伤模型的建立和实验分组:心肌细胞按
5 ∋ 105 / mL 的密度分别接种于 96 孔板和 24孔板。
实验开始时, 所有细胞均更换新鲜无血清培养液。
按随机原则分为 3 组: 对照组, 不加任何处理因素;
H 2O 2组 (模型组 ) [ 13] : 加入终浓度 400 mo l/ L
H 2O 2作用 6 h;当归红芪超滤物不同质量浓度预处
理组 (超滤物组) :根据 MT T 法确定超滤物的有效
!603!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月
质量浓度范围为 1 ~ 22 mg/ mL, 取低、中、高
( 3 75、7 5、15 mg / mL,相当于生药质量浓度) 3 个
质量浓度分别加入培养基中孵育 24 h, 后加入终浓
度为 400 mol/ L H 2O 2作用 6 h。实验结束后, 镜
下观察细胞形态,收集心肌细胞及培养上清液用于
指标测定。各组设 8 孔,重复 3次。
2 4 倒置相差光学显微镜下观察细胞形态:按 2 2
项乳鼠心肌细胞原代培养的方法在 24 孔板中培养
心肌细胞 3 d 后, 弃去原培养液, 换成无血清的
DMEM 培养液, 按 2 3项方法分组给药, 倒置显微
镜下观察心肌细胞的形态及细胞生长状况。
2 5 细胞存活率的检测:细胞存活率应用 MT T 法
检测。心肌细胞用 DF 培养液制成单细胞悬液, 调
整细胞密度为 5 ∋ 105 / mL, 接种于 96 孔培养板中,
每孔 100 L,培养 3 d。换无血清 DF 培养 24 h, 按
各实验分组处理细胞, 然后每孔加入 10 L MT T
溶液, 37 ) CO2培养箱中静置培养 4 h,小心弃去上
清液,加入 100 L formazan 溶解液,继续于 37 )
CO 2培养箱中培养 4 h, 直至紫色结晶完全溶解, 选
择 570 nm 波长, 在酶标仪上测定各孔吸光度
( A 5 70 nm ) 值, 与实验孔平行设不加细胞只加培养液
的空白对照孔, 比色时作为空白调零孔。
2 6 SOD、LDH、CK、MPO 活性及 MDA 的测定:
96 孔板和 24孔板分别按实验分组处理后, 96 孔板
取其上清液测定 LDH、CK 活性。将培养于 24 孔
板的心肌细胞用超声破碎仪碎裂后取培养液测定
SOD、MPO 活性和 MDA 水平, 实验操作按试剂盒
说明进行。
2 7 RTPCR 检测 hsp70、caspase3 mRNA 表达:
各实验组处理结束后弃上清液,按 T rizo l试剂盒抽
提纯化操作方法提取心肌细胞总 RNA。提取的
RNA 通过紫外光分光光度计测定 260、280 nm 吸
光度值,计算 RNA 纯度和浓度。按反转录试剂盒
说明书将 RNA 反转录成 cDNA 第一链, 再进行
PCR 扩增。PCR 反应体系总体积为 50 L: DEPC
水 24 L, 10 ∋ Taq buf fer 50 L, 2 mmol/ L dNTP
m ix 5 L, Primer ∗ 1 L, Primer & 1 L, T aq
DNA polymerase 0. 5 L, 25 mmo l/ L M gCl2 3. 5
L, T emplate DNA 10 L。act in 作为内参照。
根据文献设计引物 (表 1)。反应条件: 94 ) 预变
性 4 min,之后进行如下循环: 94 ) 变性 45 s,退火
45 s, 72 ) 延伸 1 min,共 28个循环,最后 72 ) 终延
伸 7 min。产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳分析, 利用凝
胶成像仪拍照,测定电泳条带吸光度值, 计算 hsp70、
caspase3与 act in 吸光度比值,作为相对定量。
2 8 统计学分析 : 采用统计软件SPSS 11 0进行
统计学分析,定量资料以 x + s 表示, 多组间差异比
较用单因素方差分析, 两组间比较用 t 检验。
3 结果
3 1 心肌细胞形态学改变:正常心肌细胞伸出伪足
互相融合成片,细胞核折光性好, 搏动具有整体性、
协调性和规律性。H 2O 2损伤组细胞皱缩,细胞核暗
淡,搏动明显减弱, 部分停搏, 搏动幅度强弱不一。
各当归红芪超滤物干预组心肌细胞伪足变细,搏动
频率不同程度地减弱。见图 1和表 2。
3 2 心肌细胞存活率:模型组心肌细胞严重受损,
细胞存活率显著降低, 与对照组比较具有统计学意
义 ( P< 0 01)。当归红芪超滤物干预组心肌细胞的
受损显著改善,存活率显著提高,与模型组比较差异
显著 ( P< 0 01)。见表 2。
表 1 hsp70、caspase3、actin 基因的 RTPCR 引物序列
Table 1 RTPCR Primer of hsp70, caspase3, andactin
基因 上游序列 ( 5%( 3% ) 下游序列 ( 5%( 3%) 退火温度/ ) 片段长度/ bp
hsp70 5%CGCGACCTGAACAAGAGCAT3% 5%T CGAAGGT CACCTCGAT CTG3% 52 363
caspas e3 5%GGT AT TGAGACAGACAGT GG3% 5%CAT GGGAT CTGT TT CT TT GC3% 50 288
actin 5%T GAACCCTAAGGCCAACCGTGAA3% 5%T CTGCT GGAAGGTGGACAGTGAG3% 56 735
图 1 当归红芪超滤物对氧化损伤乳鼠心肌细胞形态学的影响
Fig. 1 Effects of ultrafiltration extract mixture from A. sinensis and H. polybotrys on morphologuy of cardiomyocytes of neonatal rats
!604! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月
3 3 培养介质中 SOD、LDH、CK、MPO 活性及
MDA 水平: H 2O2处理使细胞膜的通透性增加, 培
表 2 当归红芪超滤物对氧化损伤乳鼠心肌细胞搏动频率
和存活率的影响 ( x+ s, n= 8)
Table 2 Effects of ultrafiltration extract mixture from A.
sinensis and H. polybotry s on beating frequency
and survival rate of cardiomyocytes of neonatal
rats ( x+ s, n= 8)
组别 剂量
搏动频率/
(次! min- 1)
A 570 nm
存活率 /
%
对照 - 982 + 134 0603+ 0 018 89 7
模型 400 m ol! L- 1 201 + 33* * 0245+ 0 021* * 29 5
当归红芪超滤物 375 mg! mL- 1 437 + 96 , , 0427+ 0 015 , , 43 9
750 mg! mL- 1 711 + 67 , , 0528+ 0 013 , , 64 4
1500 mg !mL- 1 869 + 84 , , 0554+ 0 011 , , 77 6
与对照组比较: * * P < 0 01; 与模型组比较: , ,P< 001
* * P< 0 01 v s cont rol gr ou p; , , P< 0 01 v s model group
养介质中 LDH、CK 的量增加, 当归红芪超滤物可
显著抑制 H2O2所致心肌细胞膜通透性的改变, 减
少 LDH、CK 的外漏。H 2O 2损伤组细胞内 MDA、
MPO 量增加、SOD活性降低, 当归红芪超滤物可显
著降低心肌细胞内 MDA、MPO 的量,提高 SOD 活
性,两组比较差异显著 ( P< 0 01) ;且呈剂量依赖关
系,随超滤物质量浓度的增加 LDH、CK、MDA、
MPO 量逐渐减少, SOD活性逐渐增强。见表 3。
3 4 hsp70、caspase3 mRNA 表达: 对照组 hsp70、
caspase3 mRNA 呈低水平表达, 模型组 hsp70、
caspase3 mRNA 表达量显著增加, 与对照组相比
差异有统计学意义;与模型组比较,各超滤物干预组
hsp70 mRNA 呈过度表达, 而 caspase3 mRNA 表
达量显著降低,差异有统计学意义。见表 4和图 2。
表 3 当归红芪超滤物对氧化损伤乳鼠心肌细胞 LDH、CK、MPO、MDA、SOD 的影响 ( x+ s, n= 8)
Table 3 Ef fects of ultrafiltration extract mixture from A. sinensis and H. polybotry s on LDH, CK,
MPO, MDA, and SOD in oxidative damage cardiomyocytes of neonatal rats ( x+ s, n= 8)
组别 剂量 MPO/ ( U! L- 1 ) LDH/ ( U! L- 1 ) MDA/ ( nmol! L- 1 ) CK/ ( U ! L- 1) SOD/ ( U ! mL- 1 )
对照 - 38 47 + 1 12 138 07 + 11 27 2 34 + 0 50 42 69 + 1 53 118 33 + 5 77
模型 400 mol! L- 1 114 00 + 3 24* * 274 36 + 15 16* * 3 82 + 0 64* * 201 47 + 2 71* * 58 23 + 2 45* *
当归红芪超滤物 3. 75 mg ! mL- 1 85 22 + 4 18, , 201 06 + 18 13, , 3 11 + 0 35, , 132 54 + 1 92, , 71 45 + 7 11, ,
7. 50 mg ! mL- 1 71 52 + 1 03, , 183 48 + 9 88, , 2 80 + 0 32, , 99 6 + 64 18, , 83 36 + 6 63, ,
15 00 mg! mL- 1 59 76 + 1 84, , 167 22 + 10 11, , 2 51 + 0 28, , 88 14 + 1 06, , 101 34 + 2 14, ,
与对照组比较: * * P < 0 01; 与模型组比较: , ,P< 001
* * P< 0 01 v s cont rol gr ou p; , , P< 0 01 v s model group
表 4 当归红芪超滤物对氧化损伤乳鼠心肌细胞 hsp70、
caspase3 mRNA 表达的影响 (x + s, n= 8)
Table 4 Effects of ultrafiltration extract mixture from A.
sinensis and H. polybotry s on expression hsp70
and caspase3 mRNA in oxidative damage of cardio
myocytes of neonatal rats (x + s, n= 8)
组别 剂量 hsp70/actin caspase3/act in
对照 - 0 73+ 0 08 0 59+ 0 06
模型 400 mol! L - 1 0 78+ 0 12* 0 88+ 0 05* *
当归红芪超滤物 3. 75 mg ! mL- 1 1 03+ 0 11, , 0 81+ 0 01,
7. 5 mg! mL- 1 1 39+ 0 04, , 0 70+ 0 02, ,
15. 00 mg ! mL- 1 1 43+ 0 02, , 0 67+ 0 07
与对照组比较: * P< 005 * * P< 0 01
与模型组比较: ,P< 005 , ,P< 0 01
* P< 0 05 * * P < 0 01 v s cont rol group
, P< 0 05 , ,P < 0 01 v s model gr ou p
4 讨论
目前抗氧化的研究已成为近年研究心血管疾病
防治的热点之一。我国中药资源丰富, 传统的中医
药学为开发利用中草药提供了基础。中药的有效成
分与氧化应激损伤的关系是一个值得研究的领域。
随着科技的不断发展,提取工艺的不断提高, 对中药
主要成分的研究越来越深入。当归、红芪中多种主
1对照组 2模型组
3~ 5当归红芪超滤物 15、7 5、3 75 m g !mL- 1组
1 cont rol group 2m odel group
3~ 5ult raf ilt ration ext ract mixtur e from A . sinensi s
and H . p oly botr ys ( 15, 7. 5, 3. 75 mg ! mL- 1) groups
图 2 各组心肌细胞 hsp70 和 caspase3 mRNA 表达
Fig. 2 Expression of hsp70 and caspase3 mRNA
in cardiomyocytes
!605!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月
要成分如多糖、苯酞类、香豆素类、黄酮类、有机酸类
等化合物, 都具有抗氧化损伤作用。当归红芪超滤
膜提取物来自于经典名方当归补血汤, 利用超滤膜
技术分离、提纯而成。本实验用高浓度 H 2O 2造成
心肌细胞氧化损伤模型, 用当归红芪超滤物进行干
预,研究结果显示,当归红芪超滤物可明显提高心肌
细胞存活率, 减少 LDH、CK 外漏, 降低细胞内
MDH、MPO 的量, 提高 SOD 活性, 且具有一定剂
量依赖关系,随超滤物质量浓度增加,对心肌细胞的
保护作用亦增强。说明当归红芪超滤物可以通过清
除自由基提高心肌细胞抗氧化损伤能力。
热休克蛋白 ( heat shock proteins, hsp) 是细
胞在应激情况下启动热休克基因从而产生的一种结
构高度保守的蛋白质, 几乎存在于从原核生物到真
核生物的所有生物体;除了热应激外,低氧、缺血、酸
中毒、活性氧等诸多因素都能诱导 hsp 的合成, 因
此它又被称为∀应激蛋白#。其中 hsp70 是一组具
有内源性保护作用的应激性蛋白质。机体应答氧化
应激时在不同的组织产生保护性的酶和热休克蛋
白。氧化应激促进 hsp70 族的合成 [ 14]。hsp70 通
过如下机制对心肌细胞发挥保护作用 [ 15] : ( 1)提高
心肌细胞蛋白质的正确折叠或聚集能力, 保持新合
成蛋白分子的恰当构型, 防止在正确的多聚体形成
前新合成蛋白质的错误折叠或聚集。( 2)促使受损
心肌细胞、变性蛋白质的恢复或加速其降解和消除,
能重新激活某些酶的作用, 以维护细胞的功能和生
存。( 3)抑制心肌细胞凋亡。( 4)保护心肌细胞肌动
蛋白和细胞骨架。( 5)增加心肌细胞一氧化氮合成。
( 6)允许心肌细胞新合成蛋白分子穿过细胞膜,陪伴
蛋白分子在细胞内跨膜转运。Jiang 等[ 16] 研究发
现,大鼠心肌细胞经热休克预处理后, 心肌 hsp70
明显表达,耐受 H 2O2损伤的能力增强,而 H 2O 2诱
导的线粒体损伤和凋亡显著抑制。
Caspase3 为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶
(称为 caspases) 家族成员, 是哺乳动物细胞凋亡的
关键蛋白酶。根据其在级联反应中的位置及 N 端
序列上的特点不同, 可将其分为在上游调控其他
caspase 活化的始起 caspase ( caspase 1、2、4、5、8、
9、10) 和下游直接介导凋亡实施的效应 caspase
( caspase 3、6、7、14)。其中 caspase3 处于核心位
置,发挥非常重要的作用,被称为死亡蛋白酶。现代
研究表明多种心脏疾病的病理过程都有凋亡机制参
与。其中自由基导致的细胞凋亡是心肌受损的主要
途径。H 2O 2是一种强氧化剂, 可诱导心肌细胞凋亡
甚至死亡。目前认为细胞凋亡的发生机制主要有两
条信号通路介导其发生, 一条是通过 Fas/ FasL 及
T NF/ TNFR依次激活 caspase8 和 caspase3 的死
亡受体通路;另一条是通过线粒体的信号通路, 即各
种损伤因素通过促进线粒体释放细胞色素 C ( cy to
chrome C ) 等信号分子, 然后激活 caspase9 和
caspase3而介导细胞凋亡的发生。Caspase 在整个
凋亡过程中起中心作用。肖为民等[ 13] 研究证实过
氧化氢通过线粒体通路和死亡受体诱导心肌细胞凋
亡。
本实验用 400 mol/ L H 2O 2造成心肌细胞氧
化损伤模型,用当归、红芪合剂超滤膜提取物进行干
预,来研究其对心肌细胞的保护作用。实验结果表
明,高浓度 H 2O 2可诱导 hsp70表达轻度增加 ( P<
0 05) , 同时促凋亡基因 caspase3 表达亦显著增加
( P< 0 01) ,促进心肌细胞凋亡,与对照组比较, 具
有统计学意义。当归红芪超滤膜提取物干预组
hsp70 基因则呈过度表达,而 caspase3 基因表达显
著下调,与损伤组比较, 差异具有统计学意义 ( P<
0 05)。实验结果证实当归红芪超滤膜提取物具有
抗心肌细胞凋亡的作用,其可能机制为:提高心肌细
胞抗氧化能力; 通过上调 hsp70 基因表达来抑制
caspase3活性。对于 hsp70 基因通过何种通路调
控 caspase3活性本实验未深入研究。
现代药理学研究表明,许多传统中药具有心血
管药理作用,本实验通过研究证实,当归红芪超滤物
可通过上调 hsp70 和下调 caspase3 表达抑制氧化
损伤心肌细胞的凋亡, 这为运用中药干预细胞凋亡
提供了分子学基础, 也为更加深入地研究这些药物
提供了依据。
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龟板提取物上调维生素 D受体表达促骨髓间充质干细胞向成骨分化
侯秋科1 ,吴 静1 ,易香华1 ,陈东风1, 2* ,周健洪1 , 李伊为1 *
( 1 广州中医药大学 解剖学教研室, 广东 广州 510405; 2 南京大学 医药生物技术国家重点实验室,江苏 南京 210093)
摘 要:目的 探讨龟板提取物诱导大鼠骨髓间充质干细胞 ( mesenchymal st em cells, MSCs) 向成骨分化和对维
生素 D受体 ( VDR) 表达的影响。方法 从大鼠骨髓中分离 MSCs, 体外培养,利用流式细胞术检测 M SCs 表面抗
原 CD44 细胞标志, 体外培养 MSCs 分成不同的组观察其向成骨分化,在培养基中不加任何处理的作为对照组, 培
养基中加成骨诱导液诱导 M SCs 向成骨分化作为阳性对照组,龟板提取物组在培养基中加龟板提取物, 诱导 7 d
后,通过免疫化学染色、Western blot ting、原位杂交、RTPCR 等方法观察龟板提取物对原代培养的 MSCs 向成骨
分化的成骨分化标记分子碱性磷酸酶 ( ALP )、骨桥蛋白 ( OPN ) 及 VDR 阳性表达及 VDR mRNA 的表达情况。
结果 免疫组化染色显示,龟板提取物组成骨分化标记分子 ALP、OPN 和 VDR 的阳性百分比明显高于对照组,
Western blotting 结果也显示龟板提取物组的 ALP、OPN 和 VDR 的蛋白表达水平高于对照组; 同时原位杂交、RT
PCR 结果表明,龟板提取物诱导 MSCs 向成骨分化过程可明显促进 VDR mRNA 的表达。结论 龟板提取物可促
MSCs 向成骨分化, 其机制可能与 VDR 的上调有关。
关键词:龟板提取物; 骨髓间充质干细胞; 成骨分化; 维生素 D 受体
中图分类号: R285 5 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 04060706
Induction of Plastrum testudinis extract to mesenchymal stem cells differentiation into osteoblast
through upregulating expression of vitamin D receptor
HOU Qiuke1 , WU Jing1 , YI Xianghua1 , CHEN Dongfeng1, 2 , ZHOU Jianhong1 , L I Yiwei1
( 1Depar tment o f Anatomy, Guang zhou Univ ersity of T r adional Chinese Medicine, Guang zhou 510405, China;
2. T he State Key Laborato ry of Pharmaceutical Biotechno log y, Nanjing Univ ersity , Nanjing 210093, China)
Abstract: Objective To invest igate vitam in D receptor ( VDR) mechanism implicated in the osteoblast
dif ferent iation of mesenchymal stem cells ( MSCs) induced by Plastr um testudinis ext racts ( PTE ) .
Methods MSCs w ere dissociated from rat bone marrow and w ere marked using the expr ession of CD44 by
the f low cytometry ( FCM ) . M SCs Cultured in vit ro were divided into dif ferent gr oups for the ef fects of
MSCs dif ferent iat ion into o steoblast, M SCs seeded in culture medium w ithout t reatment served as con
t ro ls, M SCs seeded in culture medium w ith osteoinduction t reatment served as posit ive controls, PT E w as
added and the cells were incubated fo r 7 d. Then immunohistochem ist ry, Westernblot t ing , in si tu hybrid
izat ion, and RTPCR were applied to observing the expression of the osteoblast dif ferent iation specific
marker ( ALP, OPN) as w ell as the V DR and VDR mRNA expression. Results Immunohistorchemist ry
!607!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 4 期 2010 年 4 月
收稿日期: 20090726 基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30472272, 30772861)作者简介:侯秋科( 1983 ) ,女(壮族) ,广西柳州人,研究生在读,研究方向为中医药调控神经干细胞防治重大神经疾病。
T el : ( 020) 36585448 Em ail: houqiuk e@ 126. com
* 通讯作者 陈东风 T el: ( 020) 36588581 Email: cdf27212@21 cn. com