全 文 ：鞣花酸对脾淋巴细胞增殖、自然杀伤细胞活性和 Th1/ Th2 细胞因子的影响
姜成哲1 ,2 ,张乾坤1 ,2 ,金庆日1 ,2 ,安仁波3 ,4 3
(11 韩国化学研究院附属安全性评价研究所 ,大田 　3052343 ; 21 延边大学农学院 ,吉林 延吉 　133000 ;31 延边大学药学院 ,
吉林 延吉 　133000 ;41 延边大学 长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室 ,吉林 延吉 　133002)
摘 　要 :目的 　通过鞣花酸对免疫细胞和细胞因子的定量化实验 ,筛选新的免疫调节制剂。方法 　实验小鼠 ig 鞣
花酸 (2、10、50 mg/ kg) 10 d ,测定体质量变化、脾脏指数 ,采用酶标法观察鞣花酸对脾淋巴细胞增殖的影响 ,采用
流式细胞仪测定脾脏中自然杀伤 (N K) 细胞的活性和辅助性 T 淋巴细胞 ( Th) 1 和 Th2 分泌的细胞因子的量。
结果 　鞣花酸对脾淋巴细胞的增殖无明显影响 ,鞣花酸 (10、50 mg/ kg) 明显增强 N K 细胞的活性 ,对细胞因子的
分泌有轻微影响。结论 　鞣花酸主要通过影响 N K 细胞活性而起到一定的免疫调节作用。
关键词 :鞣花酸 ; 脾淋巴细胞 ; 自然杀伤细胞 ; 免疫调节
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2010) 02 0275 03
　　鞣花酸 (ellagic acid) 又称没食子酸、胡颓子
酸 ,是一种广泛存在于石榴、草莓、葡萄、苹果、蔓越
桔、黑莓和胡桃中的一种天然多酚组分。其不仅以
游离的形式存在 ,而且更多的是以二聚体的形式存
在 ,表现出抗氧化、抗炎和抗突变的活性[1～3 ] 。近年
来发现鞣花酸对正常细胞无细胞毒作用 ,但对于某
些癌细胞有细胞毒作用[ 4 ,5 ] 。目前只有鞣花酸免疫
耐受和对外周血液淋巴细胞影响的研究报道[6 ,7 ] ,
而鞣花酸对其他主要免疫因素的影响的研究报道则
较少。
细胞因子是体内细胞之间相互作用的主要介
质 ,在机体的免疫应答、炎症反应等许多方面起重要
作用。细胞因子的异常变化常常与疾病相关[8 ] 。本
实验旨在研究不同浓度的鞣花酸对动物脾脏的 T
细胞和 B 细胞的增殖以及自然杀伤 (N K) 细胞活
性的影响 ,还对脾脏细胞分泌的细胞因子产物进行
测定 ,为进一步研究鞣花酸的免疫调节作用奠定
基础。
1 　材料
111 　实验动物 :BALB/ cj 雌性小鼠 (6 周龄) ,由韩国
Orient 公司提供。实验期间 ,小鼠自由饮食 ,饮用灭
菌后的自来水。小鼠饲养条件 :温度为 (24 ±2) ℃;
相对湿度为 (50 ±10) %;明暗周期为 12 h/ 12 h。
112 　药物及试剂 :鞣花酸 (质量分数 ≥96 %) 、丝裂
霉素 C、细菌脂多糖 (L PS) 、刀豆蛋白 A ( Con A)
和碘化丙啶 ( PI) 均购自 Sigma 公司 ; 牛血清
( FBS) 、抗菌素 (青霉素 100 μg/ mL 、链霉素 100
μg/ mL) 、RPMI 1640 培养基、10 mmol/ L HEPES 购
自 Gibco 公司 ;CBA Kit 购自 BD 公司 ;Cell Counting
Kit 8 购自日本 Dojindo Laboratories 公司。
113 　实验仪器 :流式细胞仪、FACSort 为美国 Bec2
ton Dickinson 公司产品 ; EL ISA Reader 为美国分
子仪器公司产品 ;Beckman CS —6R 离心机为美国
Beckman 公司产品。
2 　方法
211 　动物实验 :将 BALB/ cj 雌性小鼠按体质量随
机分成 4 组 ,每组 10 只 ,分为对照组和鞣花酸低、
中、高剂量组。各组小鼠均 ig 给药 ,持续 10 d ,其中
对照组给予蒸馏水 ,其余 3 组分别给予鞣花酸 (2、
10、50 mg/ kg) 。分别于第 1、4、7、10 天测定小鼠体
质量。10 d 后 ,对动物进行麻醉剖检 ,取脾脏 ,先称
脏器质量 ,计算脾脏指数。然后分别进行脾淋巴细
胞增殖反应、N K 细胞活性和细胞因子的测定试验。
212 　脾淋巴细胞增殖反应 :对照组及各实验组小鼠
剖检 ,按常规方法制备淋巴细胞悬液 ,用 RPMI
1640 培养液稀释调成 1 ×106 / mL ,然后分别接种于
96 孔板 ,并使淋巴细胞的浓度为 2 ×105 / 孔。各组
用 L PS 和 ConA 各处理 3 个复孔。培养基置于
37 ℃、5 % CO2培养箱中培养 72 h ,然后各孔加入
Cell Counting Kit 8 试剂 , 孵育 2 ～ 4 h 后 , 用
EL ISA Reader 在 450 nm 波长处测吸光度 ( A) 值 ,
计算出各实验组和对照组之间的百分比。
·572·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
3 收稿日期 :2009204206　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30860343) ; 吉林省科技发展计划资助项目 (200705427)
作者简介 :姜成哲 (1966 —) ,男 ,博士 ,副教授 ,现任延边大学农学院教师 ,主要从事动物药理与毒理学的研究。
E2mail : ksc66 @yeah. net3 通讯作者　安仁波　Tel : (0433) 2660568 　E2mail : anrb @ybu. edu. cn
213 　N K 细胞活性测定 :以脾淋巴细胞中的 N K 细
胞为效应细胞 ,以 YAC21 细胞株为靶细胞 ,效应细
胞和靶细胞的比例 ( E ∶T) 分别为 10 ∶1 和 50 ∶
1 ,利用 PI 染料排斥法 ,在 488 nm 波长下产生绿色
荧光 ,再用流式细胞仪测定受 N K 细胞作用后靶细
胞的死亡率 ,从而反映出 N K 细胞的活性[9 ] 。
214 　辅助性 T 淋巴细胞 ( Th) 1 和 Th2 细胞因子
的测定 :根据 BDTM Cytomet ric Bead Array ( CBA)
Mulitiplex Assays ,将上述制备的淋巴细胞悬液
(1 ×106 / mL) 采用 Con A (1μg/ mL) 诱导小鼠脾
细胞产生 Th1/ Th2 细胞因子 ,用流式细胞仪测定
IFN2γ、TN F2α、IL22、IL24 和 IL25 的量 ,采用 Cell2
Quest 软件程序进行分析[9 ] 。
215 　统计学处理 :实验数据以 x ±s 表示 ,组间差
异的比较采用 ON E2WA Y ANOVA 分析 , 选择
L SD 和 Dannet t′s T3 进行组间多重比较。
3 　结果
311 　体质量变化 :结果见表 1。对照组和各实验组
动物在实验期间没有出现异常症状 ,饮食和饮水等
无特殊变化。各组动物平均体质量没有明显的差异
( P < 0105) ,鞣花酸高剂量组在第 4 天体质量有下
降趋势 ,但第 7 天至第 10 天已恢复正常生长趋势。
312 　脾脏指数 :测定对照组和鞣花酸各剂量组小鼠
脾脏指数 ,分别是 (0160 ±0112) %、(0162 ±0107) %、
表 1 　实验期间动物体质量的变化 ( x ±s , n = 10)
Table 1 　Changes of mice body weight during experiment
period ( x ±s , n = 10)
组　别
剂量/
(mg ·kg - 1 )
体质量/ g
第 1 天 第 4 天 第 7 天 第 10 天
对照 - 20196 ±2162 21134 ±1100 20112 ±1100 20144 ±1161
鞣花酸 2 21140 ±1156 21174 ±1118 20144 ±1106 20184 ±1157
10 20188 ±1142 20168 ±0194 20104 ±1136 19192 ±1185
50 21147 ±1139 19172 ±1107 18174 ±0176 20156 ±1175
(0168 ±0110) %、(0170 ±0107) % ,表明脾脏指数各
组间没有显著性差异 ( P > 0105) 。
313 　脾淋巴细胞增殖反应 :鞣花酸各剂量组与
L PS 诱导的脾脏 B 淋巴细胞增殖对照组的百分率
分别为 (140140 ±19172) %、(103117 ±36136) %、
(107137 ±27101) % ;与 Con A 诱导的脾脏 T 淋巴
细胞增殖对照组的百分率为 (124110 ±14151) %、
(115175 ±2210) %、(112113 ±11134) % ,对照组和
各组间比较没有显著差异 ( P > 0105) 。
314 　N K 细胞活性 :结果见表 2。鞣花酸 10 mg/ kg
剂量组中 ,当 E ∶T 为 10 ∶1 时能显著增强 N K 细
胞的活性 ( P < 0101) ;鞣花酸 50 mg/ kg 剂量组中 ,
E ∶T 分别为 10 ∶1 和 50 ∶1 时 ,与对照组相比能
显著增强 N K 细胞杀死 YAC21 细胞株的能力
( P < 0101) 。
315 　Th1/ Th2 细胞因子测定结果 :结果见表 3。
在 ConA 刺激下 ,鞣花酸 10 mg/ kg 剂量组的脾细
胞在 24 和 48 h , IN F2γ、IL22、IL24 和 IL25 的量与
对照组相比均有一些增加 ,说明在本实验的条件下 ,
适量的鞣花酸能够同时作用于 Th1 和 Th2 细胞。
可推测鞣花酸可能通过影响细胞因子的分泌来发挥
作用。
表 2 　鞣花酸对 NK细胞活性的影响 ( x ±s , n = 4)
Table 2 　Effect of ellagic acid on NK cell activities
( x ±s , n = 4)
组　别
剂量/
(mg ·kg - 1)
细胞毒性/ %
( E ∶T = 10 ∶1) ( E ∶T = 50 ∶1)
对照 　- 41 50 ±1100 23130 ±51 41
鞣花酸 　2 51 68 ±1147 20104 ±71 05
10 81 46 ±2125 3 3 17184 ±41 18
50 111 94 ±4179 3 3 31104 ±41 62
　　与对照组比较 : 3 3 P < 01 01
　　3 3 P < 0101 vs cont rol group
表 3 　鞣花酸对 Con A 刺激脾细胞 Th1/ Th2 细胞因子的影响 ( x ±s , n = 4)
Table 3 　Effects of ellagic acid on Th1/ Th2 cytokines production by Con A2stimulated splenic cells ( x ±s , n = 4)
组　别
剂量/
(mg·kg - 1 )
TNF2α/ (pg·mL - 1 )
24 h 48 h
IFN2γ/ (pg·mL - 1 )
24 h 48 h
IL22/ (pg·mL - 1 )
24 h 48 h
IL24/ (pg·mL - 1 )
24 h 48 h
IL25/ (pg·mL - 1 )
24 h 48 h
对照 - 350146 ± 92176 571133 ±129119 591196 ±454181 6 841181 ±3 912133 500144 ±168133 442114 ± 51178 16136 ± 7126 31131 ±13124 5108 ±4171 11150 ± 9135
鞣花酸 2 298171 ± 91133 382193 ±137137 830183 ±440130 5 798111 ±1 291155 474111 ±195141 335194 ±127119 28111 ±10111 36128 ±18107 4116 ±1116 9134 ± 1142
10 404182 ± 79132 508189 ±194150 1 289110 ±429115 9 005167 ±2 559102 545150 ± 54137 470156 ±198125 41161 ±31140 42101 ±30177 7176 ±2172 21174 ±11185
50 281198 ±230176 402138 ±375180 528186 ±649141 6 137117 ±5 071176 358113 ±273143 369186 ±332158 28123 ±17156 43111 ±17118 3185 ±1178 8190 ± 4161
4 　讨论
　　目前国内外在研究中药免疫调节剂时 ,大多还
是直接使用粗制剂 ,使得要在分子水平上阐明其药
理作用机制受到了很大的限制[10 ] 。本实验研究了
纯的鞣花酸对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。鞣花酸
对小鼠脾淋巴细胞有无丝裂酶原样作用 ,只是在低
剂量 (2 mg/ kg) 时对 L PS 诱导的 B 淋巴细胞增殖
有轻微的促进作用 ( 140140 ±19172 ) % , 而对
Con A 诱导的 T 淋巴细胞增殖则没有明显的影响。
在免疫系统中 , N K 细胞起重要的作用。N K
·672· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
细胞具有细胞介导的细胞毒作用 ,能直接杀伤靶细
胞。本实验结果显示 ,鞣花酸 10 mg/ kg 剂量的
N K 细胞在效应细胞和靶细胞比例为 10 ∶1 时 ,细
胞毒性作用与对照组相比差异显著 ( P < 0101) ;鞣
花酸 50 mg/ kg 剂量组的 N K 细胞在效应细胞和靶
细胞比例为 10 ∶1 和 50 ∶1 时 ,细胞毒性作用与对
照组相比差异均显著 ( P < 0101) ,并且 50 ∶1 时的
作用比 10 ∶1 时大了约 3 倍。因为 N K 细胞是第 3
类淋巴细胞 ,不依赖于抗原刺激 ,能自发地发挥细胞
毒效应 ,肿瘤患者免疫功能状态评价指标中包括
N K 细胞的功能及血清中抗体、补体和某些细胞因
子水平等[11 ] 。因此能影响 N K 细胞活性的药物历
来受到人们的重视。而细胞因子又能够调节 N K
细胞对靶细胞的杀伤作用。辅助 T 细胞 ( Th1/
Th2) 在某些疾病时体内细胞因子及其受体的表达
可发生异常 ,与机体免疫功能低下或发生病理损伤
有关。IL22 作为重要的细胞因子参与 T 细胞的活
化 ,大部分 T 细胞的活化途径需要 IL22 参与 ,而
N K 细胞的细胞溶解作用能被 IL22 等细胞因子激
活。Th1 细胞分泌 IFN2γ和 IL22。Th1 细胞可辅
助促进细胞介导的免疫应答和炎症反应。
本实验在不同时间段检测培养液中细胞因子的
活性 ,属于目前国外应用较多的在蛋白质水平上检
测 (不包括膜表面受体) ,得到的一些数据对于筛选
一些具有免疫调节作用的中草药 ,可作为对比性的
数据。由于细胞因子由各种细胞合成、表达和分泌 ,
所以有多种存在形式 ,大多数细胞因子被分泌到体
液中 ,是液相的可溶性细胞因子。本实验所用的免
疫检测法能够检测到细胞因子的蛋白质特性 ,而脾
细胞增殖和 N K 细胞活性测定等生物学活性检测
法相互印证是最理想的 ,但是这两者的检测结果只
在一定的条件下才有相关性 ,两者不能互相替代。
本实验结果显示 ,脾脏指数各实验组与对照组
比较没有统计学上的显著差异 ,而且从脾细胞的增
殖反应中未能见到淋巴细胞的明显增殖 ,提示鞣花
酸可能不是通过增加辅助 T 细胞的数量 ,而是通过
增强 N K 细胞的活性和轻微影响细胞因子分泌的
途径发挥作用 ,而且与其所作用的剂量有密切关系。
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《中草药》杂志列中文核心期刊中国医学类第一位
中国医学类核心期刊表
序号 刊 　名 　　 序号 刊 　名 　　
1 　中草药 11 　针刺研究
2 　中国中药杂志 12 　中药新药与临床药理
3 　中国中西医结合杂志 13 　南京中医药大学学报
4 　中国针灸 14 　中国实验药剂学杂志
5 　中成药 15 　辽宁中医杂志
6 　北京中医药大学学报 16 　时珍国医国药
7 　中药材 17 　中医杂志
8 　中国中医基础医学杂志 18 　新中医
9 　中药药理与临床 19 　中国中西医结合急救杂志
10 　中华中医药杂志 20 　中国天然药物
　　　　摘自《中文核心期刊要目总览》2008 年版 (第五版)
·772·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月