全 文 ：药理与临床
雷公藤内酯醇对多发性骨髓瘤 RPMI 8226 细胞周期及
P21wap1/ cip1 和 P27kip1 表达的影响
刘 媛,陈 燕,赵 菲, 李 睿,张 纯* ,文 璐
(华中科技大学同济医学院附属协和医院 血液科,湖北 武汉 430022)
摘 要:目的 观察雷公藤内酯醇对多发性骨髓瘤细胞 RPMI 8226 增殖和周期的影响, 探讨细胞周期调控蛋白
P21w ap1/ cip1 和 P27kip1 在其中的作用和意义。方法 采用 MTT 比色法和流式细胞术检测雷公藤内酯醇对
RPMI 8226 细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响, 半定量 RTPCR 和 Western blotting 法检测 RPMI 8226 细胞中
P21w ap1/ cip1、P27kip1 mRNA 和蛋白表达。结果 雷公藤内酯醇能明显抑制 RPMI 8226 细胞增殖, 其抑制作用
呈时间、剂量依赖性, 雷公藤内酯醇作用 48 h 的 IC50值为 ( 71 18! 2. 01) nmo l/ L。雷公藤内酯醇还可以诱导 RP
MI 8226 细胞周期阻滞于 G0 / G 1期, 随着雷公藤内酯醇浓度的增加, G0 / G 1期细胞逐渐增多, S 期细胞逐渐减少。
经雷公藤内酯醇干预后周期调节蛋白 P21w ap1/ cip1 和 P27kip1 的 mRNA 和蛋白表达水平明显上调。结论 雷
公藤内酯醇可以抑制 RPM I 8226 细胞增殖,该抑制作用是通过调控 P21w ap1/ cip1 和 P27kip1 的表达, 从而阻止
细胞周期 G0 / G 1期过渡实现的。
关键词:雷公藤内酯醇; RPM I 8226 细胞;细胞周期; P21w ap1/ cip1; P27kip1
中图分类号: R286 91 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 11181905
Effects of triptolide on cell cycle and expression of P21wap1 / cip1 and P27kip1
in human multiple myeloma RPMI 8226 cells
LIU Yuan, CHEN Yan, ZHAO Fei, LI Rui, ZHANG Chun, WEN Lu
( Depar tment of H ematolo g y, Union H ospital, T ongji Medical Colleg e, H uazhong Univ ersit y
of Science and Technolog y, Wuhan 430022, China)
Abstract: Objective T o investig ate the effect of tr iptolide on cell proliferat ion, cell cycle dist ribut ion,
DNA and pr otein expr ession regulation of P21w ap1/ cip1 and P27kip1 in human mult iple myeloma RPM I
8226 cells. Methods Cell v iability w as detected by MT T assay and cell cycle dist ribut ion w as measured by
flow cytometry . Ef fect on mRNA expression o f P21w ap1/ cip1 and P27kip1 w as detected by RTPCR. The
change of protein expression w as measured by Western blo tt ing. Results T riptolide o f v ary ing concentra
t ion significant ly induced the inhibit ion o f prolifer at ion in a dosedependent manner and G 0 / G 1 phase arrest
of the cell cycle prog ression. T he events w ere coincided w ith the upregulat ion of the mRNA and pr otein
expression o f P21w ap1/ cip1 and P27kip1. Conclusion These r esults suggest that tr iptolide might exhibit
its str ong ant itumor ef fect v ia alternat ion of P21w ap1/ cip1 and P27kip1. It provides fr amew o rk for a clini
cal evaluat ion o f tr iptolide.
Key words: t ripto lide; RPM I 8226 cel ls; cell cycle; P21w ap1/ cip1; P27kip1
雷公藤内酯醇 ( t ripto lide) 是从卫矛科雷公藤
属植物雷公藤中分离到的二萜内酯化合物, 是雷公
藤的主要有效成分[ 12] , 对多种肿瘤具有抑制增殖、
促凋亡和控制转移的作用, 其抗肿瘤作用主要是通
过干预细胞周期和抗增殖作用[ 3] , 激活 caspase8、
caspase9、caspase3和裂解 DNA 修复酶 PARP [ 4] ,
以及直接通过上调核因子 B 抑制蛋白 ( IB) 抑
制核因子 B ( NFB) 的激活 [ 5] 来诱导细胞凋亡。
最近研究表明, 雷公藤内酯醇能够通过下调 PI3k/
Akt / NFB 和 MAPK 通路促进人多发性骨髓瘤细
胞耐地塞米松细胞株的凋亡 [ 6]。本研究通过观察雷
公藤内酯醇抑制人多发性骨髓瘤 RPM I 8226 细胞
增殖、细胞周期阻滞以及其对 P21w ap1/ cip1 和
P27kip1 的调控作用,探讨其间的相互关系, 为雷公
1819中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100313 基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30700882)作者简介:刘 媛( 1983 ∀ ) ,女,吉林人,硕士,主要研究方向为恶性血液病。T el: 15050740025 Email : liu yuan _jilin@ yeah. n et
* 通讯作者 张 纯 T el: ( 027) 85726008 Email: zhangch un23@ yah oo. com. cn
藤内酯醇的临床应用提供新的理论基础。
1 材料
雷公藤内酯醇, 质量分数 #98% ( HPLC) , 购
自 Sigma 公司,用二甲基亚砜 ( DM SO) 溶解, 配成
1 mo l/ mL, - 20 ∃ 避光 保存备用。MTT、
DMSO、碘化丙锭 ( PI)、Hoechst 33258 荧光染液、
RNaseA 均购自 Sigma 公司; RNA 抽提试剂 T rizol
和 RPM I 1640 培养基购自 Gibico BRL 公司, 胎牛
血清 ( FBS) 购自杭州四季青生物工程材料有限公
司。氯仿、异丙醇、乙醇为国产分析纯。PTPCR 试
剂盒购自 T oyobo 公司。兔抗人单克隆抗体
P27kip1和兔抗人多克隆抗体 P21w ap1/ cip1 购自
美国 Cel l Signaling 公司。兔抗人抗体 !act in 和辣
根过氧化酶标记的羊抗兔二抗均购自美国 Santa
Cr uze 公司。人多发性骨髓瘤细胞株 RPM I 8226
由华中科技大学同济医学院免疫教研室提供。
2 方法
2 1 细胞培养及处理: RPM I 8226 细胞用含 10%
FBS、青霉素 100 U / mL、链霉素 100 U / mL 的
RPM I 1640 培养基, 37 ∃ 、5% CO2、水饱和湿度条
件下培养。每 1~ 2 d换液传代 1次,取活细胞大于
98% 的对数生长期细胞, 细胞悬液终浓度为 1 %
106 / mL,分别与不同浓度的雷公藤内酯醇共同培养
后,检测各项指标。
2 2 MT T 比色法检测细胞增殖: 将处于对数生长
期的 RPM I 8226 细胞 ( 1 % 105 / mL) 接种于 96 孔
板, 每孔 200 L, 设 5 个平行孔, 经 30、60、120
nmol/ L 雷公藤内酯醇分别处理 24、36、48 h 后, 加
入 5 mg/ mL MTT 20 L, 37 ∃ 继续孵育 4 h,小心
吸去培养上清液,每孔加入 150 L DMSO, 震荡 10
min, 使结晶充分溶解后用 Bio ∀ RadM450 酶标仪
于 492 nm 波长处检测各孔吸光度 ( A ) 值,计算细
胞增殖抑制率[增殖抑制率= ( 1- 实验组 A 值/对
照组 A 值) % 100% ]。实验重复 3次。
2 3 流式细胞术检测细胞周期: 收集分别经 0、30、
60、120 nmol/ L 雷公藤内酯醇作用 24 h 的 RPMI
8226 细胞 1 % 106个, 以 PBS 缓冲液清洗 2 次, 用
70% 冷乙醇 4 ∃ 固定过夜,离心,用 PBS 洗 1次,
加入 20 L RNaseA 于 37 ∃ 水浴 30 m in,再加入
300~ 500 L PI 染液混匀,至 4 ∃ 避光 30 min, 用
流式细胞仪 (美国 Becton Dickinson 公司) 进行检
测,记录激发波长 488 nm 处的红色荧光。
2 4 RTPCR 方法检测 P21w ap1/ cip1和 P27kip1
mRNA 表达: T rizol 法提取细胞总 RNA ,按说明书
合成 cDNA, 以细胞 cDNA 的第一链为模板, 进行
PCR 反应。P21w ap1/ cip1 的 PCR 扩增条件为:
94 ∃ 、5 min, 94 ∃ 、30 s, 55 ∃ 、30 s, 72 ∃ 、30 s,循
环 32 次; 72 ∃ 延伸 7 min, 4 ∃ 保存。P27kip1的
PCR 扩增条件为: 94 ∃ 、5 min, 94 ∃ 、30 s, 60 ∃ 、
30 s, 72 ∃ 、30 s,循环 32 次; 72 ∃ 延伸 7 min, 4 ∃
保存。!act in 的 PCR 扩增条件为: 94 ∃ 、5 min,
94 ∃ 、30 s, 60 ∃ 、30 s, 72 ∃ 、30 s, 循环 32 次;
72 ∃ 延伸 7 m in, 4 ∃ 保存。PCR 产物的电泳分
析:取 5 L 产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳,紫外照相
并进行扫描分析,以 !act in 为对照进行 P21w ap1/
cip1 和 P27kip1 mRNA 表达水平的半定量分析。
P21w ap1/ cip1 的引物序列:上游为 5&GGAT
GTCCGT CAGAACCCA3&, 下游为 5&CAGGT C
CACA TGGTCTT CC3&, 扩 增 产 物 为 399 bp。
P27kip1 的引 物序 列: 上游 为 5&CCGGCT A
ACTCT GAGGACAC3&, 下 游为 5&CCGGCT A
ACTCT GAGGACAC3&, 扩 增产 物 为 224 bp。
!actin 的 引 物 序 列: 上 游 为 5&GAGC
TA CGAGCTGCCT GA CG3&, 下 游为 5&CCT A
GAAGCAT TT GCGGTGG3&,扩增产物为 416 bp。
2 5 Western blot t ing 方法检测 P21w ap1/ cip1 和
P27kip1 蛋白表达水平: 收集分别经 0、30、60、120
nmo l/ L 雷公藤内酯醇处理 24 h 的 RPM I 8226 细
胞,离心, PBS 洗涤 2 次, 去除洗涤缓冲液, 加入裂
解缓冲液, 冰上放置 30 min, 4 ∃ 下 12 000 r/ min
离心 15 min,取上清用 BCA 法进行蛋白定量, 等量
分装后 - 80 ∃ 保存。蛋白提取物经定量后,取 30
g 在十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺 ( SDSPAGE)
凝胶上电泳。然后转膜到醋酸纤维素膜上,丽春红
染色观察转膜情况。转膜成功后用 5% 脱脂奶粉
封闭 2 h。加一抗 P21w ap1/ cip1和 P27kip1抗体,
在 4 ∃ 条件下过夜。用 T BST (含 T risBuffer so
line with Tw een 缓冲液) 充分漂洗 3次, 每次 10
m in,再加二抗 ( 1 ∋2 000稀释的辣根过氧化酶标记
的羊抗兔 IgG) 震荡孵育 2 h。洗去未结合的二抗,
滴加 ECL 化学发光试剂, X射线曝光显影。扫描 X
光片,计算机软件处理,进行分析,计算灰度值。
2 6 统计方法: 应用统计学软件 SPSS 13 0 进行
分析,数据以 x ! s 表示, 组间比较采用 t 检验。
3 结果
3 1 对多发性骨髓瘤细胞 RPMI 8226细胞增殖的
影响:分别以 30、60、120 nmol/ L 雷公藤内酯醇作
用 RPMI 8226细胞后,各处理组的增殖活性明显低
1820 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
于对照组。随着雷公藤内酯醇作用时间和作用浓度
的逐渐增加,雷公藤内酯醇对 RPMI 8226细胞的增
殖抑制作用逐渐增强, 见图 1,其作用 48 h 的 IC50
值为 ( 71 18 ! 2 01) nmol/ L。
3 2 对 RPMI 8226 细胞周期的影响:雷公藤内酯
图 1 雷公藤内酯醇对 RPMI 8226 细胞增殖的抑制作用
( x! s, n= 5)
Fig. 1 Inhibition of triptolide on proliferation
of RPMI 8226 cells (x ! s, n= 5)
醇诱导 RPM I 8226 细胞周期阻滞于 G 0 / G 1期, 随着
雷公藤内酯醇浓度的增加, G 0 / G 1期细胞比例越来
越多,相应的 S 期细胞数量逐渐减少, 而 G2 / M 期
细胞数改变不明显。此外,随着雷公藤内酯醇浓度
的增加, 亚二倍体峰 (凋亡峰) 越来越明显,见图 2。
雷公藤内酯醇阻滞 RPM I 8226 细胞周期于 G0 / G1
期作用具有良好的量效关系,见图 3。
3 3 对 RPMI 8226 细胞 P21w ap1/ cip1 和 P27kip1
mRNA 表达的影响: RPMI 8226 细胞分别经 30、60、
120 nmo l/ L 雷公藤内酯醇处理 24 h 后, P21w ap1/
cip1 和 P27 kip1 mRNA 表达有逐渐增强的趋势,
条带逐渐变亮 (图 4)。每组实验重复 3次,与对照
组相比均有显著差异 ( P< 0 05)。
3 4 对 RPMI 8226 细胞 P21wap1/ cip1 和 P27kip1
蛋白表达的调控作用:研究结果表明,以 0、30、60、120
nmol/ L 的雷公藤内酯作用 RPMI 8226细胞 24 h 后,
随着药物浓度的增加, 细胞内 P21 w ap1/ cip1 和
P27kip1蛋白表达量逐渐增加。每组实验重复 3 次,
与对照组比较差异显著 ( P< 0 05) ,见图5。
图 2 雷公藤内酯醇对 RPMI 8226 细胞周期的影响
Fig. 2 Effect of triptolide on cell cycle of RPMI 8226 cells
与对照组比较: * P < 0 05
* P < 0 05 v s cont rol group
图 3 雷公藤内酯醇对 RPMI 8226 细胞周期的影响
( x! s, n= 3)
Fig. 3 Effect of triptolide on cell cycle of RPMI 8226
cells ( x! s, n= 3)
4 讨论
雷公藤内酯醇是从雷公藤属植物雷公藤中分离
提取的一种环氧二萜类化合物, 可以通过干预和调
节细胞周期,抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡而发挥抗
肿瘤作用[ 78]。本实验以体外培养的人多发性骨髓
瘤细胞 RPMI 8226作为研究对象,观察雷公藤内酯
醇对 RPM I 8226 细胞的生长抑制和诱导凋亡作用,
并探讨其可能的机制。
本研究发现雷公藤内酯醇能明显抑制 RPM I
8226 细胞的增殖,且与药物作用浓度和作用时间呈
正相关;流式细胞术检测细胞周期结果显示,雷公藤
内酯醇诱导 RPM I 8226 细胞周期阻滞于 G 0 / G 1期,
1821中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
与对照组比较: * P < 0 05
* P < 0 05 v s cont rol group
图 4 雷公藤内酯醇对 RPMI 8226 细胞内 P21wap1/ cip1、P27kip1 mRNA 表达的影响 ( x! s, n= 3)
Fig. 4 Effect of triptolide on mRNA expression of P21wap1/ cip1 and P27kip1 in RPMI 8226 cells ( x ! s, n= 3)
图 5 雷公藤内酯醇对 RPMI 8226 细胞 P21wap1/ cip1
和 P27kip1 蛋白表达的影响
Fig. 5 Effect of triptolide on protein expression of P21wap1/
cip1 and P27kip1 in RPMI 8226 cells
随着雷公藤内酯醇浓度的增加, G0 / G1期细胞逐渐
增加, S期细胞逐渐减少, 并且细胞凋亡率逐渐增
加。另外随着雷公藤内酯醇浓度的增加, P21wap1/
cip1、P27kip1 的 mRNA 和蛋白表达水平逐渐增
加,提示雷公藤内酯醇的抗肿瘤作用与其抑制增殖、
诱导凋亡和干扰周期有关。
细胞周期的进程是一个高度有序、紧密调节的
进程, 细胞周期依赖激酶 ( cyclin dependent kinase,
CDK) 控制绝大多数真核生物细胞周期的进展,
P21w ap1/ cip1 和 P27kip1 是普遍的 CDK 抑制剂,
控制细胞周期的 G1 / S 调控点, 抑制细胞增殖, 在肿
瘤的发生、发展过程中起着重要作用[ 910] 。细胞在
增殖分裂过程中, P21w ap1/ cip1 和 P27kip1 是
G1 / S 限制点的负性调控因素,其过度表达可以抑制
cyclin、CKD 或 cyclinCDK 复合物的蛋白激酶活
性,阻碍细胞从 G 0 / G1进入 S 期, 从而使细胞周期
阻滞于 G0 / G1期,减少 DNA 合成和有丝分裂,抑制
细胞增殖,促进分化。研究表明,许多诱导分化剂如
维甲酸、组蛋白去乙酰化酶抑制剂等都是通过调控
P21w ap1/ cip1、P27kip1 的表达影响细胞增殖、生长
和分化 [ 1112]。P21w ap1/ cip1 可以抑 制 CDK2、
CDK4 和 CDK6 的活性,从而使细胞停滞于 G0 / G1
期,不能进入 S期 [ 13]。另有研究表明, P27kip1可以
阻止 RB 蛋白磷酸化而影响细胞周期进程,从而抑
制细胞生长[ 14]。P27kp1 也通过抑制 cyclin E/
CDK2 和 cyclin D/ CDK4等激酶复合物的活性,阻
滞细胞由 G0 / G 1期向 S 期转化的 [ 15]。本实验结果
显示, 在 RPM I 8226 细 胞 中 P21w ap1/ cip1、
P27kip1 呈低表达, 经不同浓度的雷公藤内酯醇处
理后, 其 mRNA 和蛋白水平均以浓度依赖方式逐
渐增加, 这表明雷公藤内酯醇可以通过上调
P21w ap1/ cip1 和 P27kip1 表达,发挥其细胞增殖抑
制和周期阻滞作用。
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藤黄酸诱导胃癌细胞凋亡及抗肿瘤转移的实验研究
黄恺飞*
(厦门市医药研究所 药物研发中心,福建 厦门 361003)
摘 要:目的 研究藤黄酸对人胃癌 BGC803 细胞增殖和转移相关能力的影响及其机制。方法 MTT、H oechst
染色法检测藤黄酸对 BGC803 细胞的增殖和凋亡的影响;侵袭小室模型等方法检测藤黄酸对 BGC803 细胞侵袭、
黏附、迁移的影响; 运用 RTPCR、Westernblo tting 法分析藤黄酸对胃癌细胞凋亡和转移相关基因 bcl2、bax、细胞
黏附分子1 ( ICAM1) mRNA 和蛋白表达的影响。结果 藤黄酸抑制 BGC803 细胞的生长,其抑制率与药物浓
度及作用时间呈依赖关系。低浓度的藤黄酸处理 BGC803 细胞后, 可明显降低胃癌细胞的黏附、迁移和侵袭能
力。随着藤黄酸浓度的增大, bcl2、ICAM1 mRNA 和蛋白表达均下调, bax mRNA 和蛋白表达上调。结论 藤黄
酸对胃癌细胞 BGC803 有明显的生长抑制作用,具有显著的促肿瘤细胞凋亡作用和抑制肿瘤细胞转移相关性质,
其机制可能与下调 bcl2、ICAM1 及上调 bax 的表达有关。
关键词:藤黄酸; 肿瘤; 侵袭; 细胞凋亡; 转移
中图分类号: R286 91 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 11182306
Experimental study on gambogic acidinduced gastric cancer cell apoptosis
and antitumor metastasis
HUANG Kaifei
( Drug R & D Cent er , X iamen M edicine Research Inst itute, Xiamen 361003, China)
Abstract: Objective T o invest ig ate the inhibit ion o f gambog ic acid on pro liferation and metastasis
ability o f BGC803 cells and to study their preliminar y mechanism further. Methods Methy l thiazoly l
tet razolium ( M TT ) and Hoechst staining w ere used to study the effects of gambog ic acidinduced apoptosis
in gast ric cancer cell line BGC803; Invasive methods w er e used to study the ef fects of invasion, adhesion,
migrat ion by gambogic acid; T he inf luence of g ambogic acid on the expression of bcl2, bax , and ICAM1
gene in gast ric cancer cells w as evaluated by RTPCR and Westernblo tt ing. Results Gambogic acid w as
found no t only to inhibit the grow th of BGC803 cells but also to induce the cell apoptosis in a dose and
timedependent manner. The ability of adhesion, mig ration, and invasiveness w as clearly inhibited by
gambog ic acid. With the increase of g ambogic acid concentr at ion, the expression of bcl2, ICAM1 gene,
and pr otein w er e downregulated and the expression of bax gene and pro tein were upregulated. Conclusion
Gambog ic acid could inhibit the g row th o f g ast ric cancer cells BGC803 significant ly, have a significant role
1823中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100205 作者简介:黄恺飞( 1982 ∀ ) ,男,安徽桐城人,研究实习员,硕士研究生, 现工作于厦门市医药研究所, 主要从事药物研发等相关工作。T el :
( 0592) 2050262 Em ail: hk f5306@ 163. com