全 文 ：尿素包合法分离月见草油中
!
5亚麻酸
&&&工艺参数的正交试验优化及结晶物的观察
王华! 凌满! 薛刚+!! 刘凤霞+! 郭书贤+
d西北农林科技大学 食品科学与工程学院 葡萄酒学院! 陕西 杨凌 %+ $$% +d南阳理工学院 生物与化学工程系! 河南 南阳 &%)$$ &#
摘要#!目的$研究不同因素!配比%包合时间%包合温度的正交组合对尿素包合结晶物的影响及最优组合的选择$为进
一步优化包合工艺提供理论参考) 方法$设计正交试验$采用显微镜观察不同正交组合的工艺参数条件下尿素包合结晶物的
形态%直径大小$利用气相色谱法检测各组合 ! 5亚麻酸的纯度) 结果$脂肪酸与尿素的配比%包合温度%包合时间对尿素包合
结晶物的形态和直径大小的影响较为明显$且 ) 个因素及其之间的交互作用对 ! 5亚麻酸纯度的影响达到显著或极显著水平$
最优组合为脂肪酸与尿素配比为 o)$包合温度为f h$包合时间为 +& ?) 结论$在最佳组合工艺条件下$
!
5亚麻酸的纯度
达到 *d% *e+通过观察尿素包合结晶物的形态及量变趋势$来反映并优化指导包合工艺是可行的) 关键词#!月见草油+ ! 5亚麻酸!OG4+尿素包合+包合结晶物+正交试验 稿件编号#!+$$*$#++$+ 基金项目#!南阳市科技攻关项目!+$$#8$$# 通信作者#!!薛刚$教授$主要从事生物物质分离和酶学研究$
PMS#!$)%%#+$%#)($I50BNS#DB2D7LMS3UN2B-./0 作者简介#!王华$教授$主要从事食品营养与安全研究$PMS#
!$+*((%+(&$$I50BNS#,B2D?LB32,ULBV-MJL-.2 !!月见草油中 ! 5亚麻酸!DB00BSN2/SM2N.B.NJ$OG4
因其特殊的生理生化功能成为近年来的研究的重点$对于分离纯化目前国内外普遍采用尿素包合法.5+/) 目前对尿素包合法的研究大部分为直接对工艺 条件进行优化$很少通过对尿素包合结晶物的变化$为工艺优化提供参考) 其中EB6MUXO.)/通过考察 尿素包合结晶物的形态和大小变化$反映了快速降
温和缓慢降温对于尿素包合结晶物的大小%不饱和
脂肪酸分离纯化效果) 但是脂肪酸与尿素的配比%
包合温度%包合时间对尿素包合结晶物的大小和形
态和不饱和脂肪酸的分离纯化效果都有影响$故本 研究的目的是观察其在不同因素条件下晶体形态% 大小及数量的变化来直观地对包合工艺进行理论指 导$优化其工艺条件)
!材料
气相色谱仪!P+$$ O<型$上海天美科学仪器有
限公司$双目生物显微镜!T8F5)<<型$上海豫光仪
器有限公司$照相机!奥林帕斯$真空干燥箱!X]Q5
#$+型$上海精宏实验设备有限公司$旋转蒸发仪
!>5+$型$上海申顺生物科技有限公司$水浴锅
!Z+$X型$上海申顺生物科技有限公司$水循环真
空泵!8E+5) 型$巩义市杜甫仪器厂$冷藏冷冻箱
!R换型冷冻冷藏柜!江苏阪神电器股份有限公司)
月见草油!江西$! 5亚麻酸!吉林药品检验所$
批号 + $$%$)$+$尿素!山西天脊集团晋城化工股 份有限公司$石油醚%氢氧化钾%*e乙醇%盐酸% 甲醇%RQ ) 5乙醚%无水硫酸钠等均为分析纯) (!方法与结果 (_!混合脂肪酸的制备!皂化反应 参考文献方法.&/ $在$$ $0G三口瓶中加入$$$ D月见草油$按油5cHE5乙醇5水 ! o$d++ o
d%o$d(%的比例$将相应比例的 ++ DcHE%
%$ 0G*e乙醇%(% 0G水一起加入到三口瓶
中$通氮气$升温到 ($ h回流 + ?$冷却后用 # 0/S*
G
f
E) g&$分出油相$收集待用)
(_(!尿素包合法
参考刘凤霞的方法./ $在$$0G三口瓶中按 一定的比例加入一定量的 *e乙醇%尿素和皂化后 的混合脂肪酸$密闭通氮气并不断搅拌$升温至 ($ g( h$保温回流 )$ 0N2$倒出冷却后移至低温 环境下一段时间$使尿素包合结晶物沉淀$然后抽 *+* 第 ) 卷第$ 期
+ $$年 月 !!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! ! [/Sd)$ :UULM!$ 9B6$ +$$
滤$分离掉尿素包合结晶物$将滤液旋转蒸发去除乙
醇一半以上后$加一定量的水$用 & 0/S*Gf EAE至 + g)$分出油相$水相再用石油醚萃取至石油
醚相为无色$将油相合并$水洗至 AE为 g#$再经 过无水硫酸钠脱水脱杂$旋转蒸发去除其中石油醚$即得OG4) (_&!尿素包合结晶物的观察与验证 将回收的尿素包合结晶物用小药匙轻取并拨 开$并用自制的专门,挑晶针-剥离并沾取少量凡士
林后$挑取形态完整且肉眼看似较为单一的晶体若 干$置于载玻片中央$然后再在显微镜! i&$下观
察其形态及大小)
(_Q!OG4含量测定
(_Q_!色谱条件!参考薛刚的检测方法.#/并加以
改进$P95ZB7极性毛细管柱!$d+ 00i)$0$$d 0$柱温 *$h$进样口温度 +($h$检测器温度
+($h$压力;
+
$d& 9FB$E
+
$d& 9FB$空气流速 ) $$0G*0N2 f $进样量 $d gd$ G) (_Q_(!样品处理与测定!取样品油液 # 滴置 $ 0G具塞试管中$加入 $d 0/S*GfcHE5甲醇溶液 + 0G于 # h水浴上皂化 +$ 0N2$加入 RQ ) 5乙醚溶 液!o$d+ 0G$# h水浴上甲酯化 0N2$取出冷 水冷却$加 + 0G石油醚$振摇$吸取上层 $d gd$ G进样$按面积归一法计算) (_$!数据分析 对不同组合条件下的结果用 8F88 $d$ 软件进 行分析$极差分析得到最优组合$方差分析得到各因 素对 ! 5亚麻酸纯度的影响是否达到显著水平) (_Y!正交试验设计及结果分析 (_Y_!不同正交组合条件下尿素包合结晶物的形 态!为考察脂肪酸与尿素的配比 !2%包合温度 !F%包合时间!1之间的交互作用$采用 G +% !) ) 正交表进行正交试验) 通过显微镜对正交试验的不 同组合下的尿素包合结晶物晶形观察$并测得每个 尿素包合结晶物的直径大小及长度) 次包合后晶形及大小均相似$晶体的直径都约 为 + g% 0++次包合后晶形较为一致!细长针状晶 体$并且粉末状颗粒析晶含量较多$直径约为 % g % 0+)次包合后晶体的形态更加完整$细长针柱 状析晶更为明显$并且其中粉末状析晶很少$直径约 为 + g)$$

0$&次包合后晶体的形态逐渐加粗$并
聚集形成片状晶体$晶体直径约为% g)$

0$略大 于三包结晶物) 每次尿素包合结晶物都比前 次的 尿素包合结晶物粗大$这也说明包合次数较大影响了
包合物质$故较大影响了晶体形貌$与有关报道相
似.%/ ) &次包合结晶物的比较见图 )
4d 次包合+Rd+ 次包合+图 !不同包合次数晶体照片
!!脂肪酸与尿素的配比对尿素包合结晶物的影
响#脂肪酸与尿素之间的配比为 o+ 时$次包合晶 体的直径约为 + g% 0++ 次包合的晶体直径约 为 % g% 0+) 次包合晶体直径约为 + g+$

0+& 次包合晶体直径约为 % g+$0+脂肪酸与 尿素直接按配比为 o+d 时$ 次包合晶体直径为
+ g%

0++ 次包合晶体约为 $$g% 0+) 次包 合晶体直径约为 $ g+% 0+& 次包合晶体约为 % g)$$

0+脂肪酸与尿素之间配比为 o) 时$次包合晶体直径约为 + g% 0++ 次包合晶体约 *++* 第 ) 卷第$ 期
+ $$年 月 !!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! ! [/Sd)$ :UULM!$ 9B6$ +$$
为 % g+ $$0+) 次包合晶体直径约为 $ g)$$

0+& 次包合直径约为 +$$ g)$

0) 从中可以看
出$晶体的直径随着脂肪酸与尿素之间配比的增加
而增加) 不同配比的尿素包合结晶物见图 +)
4do++Rdo+d+图 +!不同配比的晶体照片
!!包合温度对尿素包合结晶物的影响#当包合温度
为 +$h时$ 次包合晶体的直径约为 + g%

0$+ 次包合晶体直径约为 % g$

0$)次包合晶体直径 约为 + g+$$0$& 次包合晶体直径约为 $g+$

0+当包合温度为f$h时$ 次包合晶体直径约为
+ g%

0$+ 次包合晶体直径约为$$g% 0$)
次包合晶体直径约为 $g+$

0$& 次包合晶体直 径约为 % g)$$0+当包合温度为 f h时$ 次
包合晶体直径约为 + g%

0$+ 次包合晶体直径约 为$$g% 0$) 次包合晶体直径约为 % g)$$

0$&次包合晶体直径约为% g)$

0+可见当包
合温度为f h时$尿素包合结晶物的直径为最大$
包合效果最好$与胡小泓等人研究相符.(/ ) 不同包合
温度下尿素包合结晶物见图 ))
4d+$ h+Rdf$ h+图 )!不同包合温度的晶体照片
!!包合时间对尿素包合结晶物的影响#总体而言$随着包合时间的增加$尿素包合结晶物的形态越来
越完整+包合时间为 + ?时$次包合晶体直径约为 + g% 0$+ 次包合晶体直径约为 % g%

0$) 次包合晶体直径约为$$g+$

0$& 次包合晶体 直径约为$ g) $$0+包合时间为 +& ?时$ 次包 合晶体直径约为 + g% 0$+ 次包合晶体温度 约为$$ g%

0$) 次包合晶体直径约为 + g)+ 0$ & 次 包 合 晶 体 直 径 约 为
$g)$

0+包合时间为 )# ? 时$次包合晶体 直径约为 + g% 0$+ 次包合晶体直径约为
$$g% 0$) 次包合晶体直径约为$$ g)+

0$& 次包合晶体直径约为$ g)$0) 可见 尿素包合结晶物在 +& ? 和 )# ? 的相差不大$采
用 +& ? 和 )# ? 的包合时间均可行) 不同包合时
间的尿素包合结晶物见图 &)
4d+ ?+Rd+& ?+图 &!不同包合时间晶体照片
*)+*
第 ) 卷第 $期 +$$年 月 !!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! ! [/Sd)$ :UULM!$9B6$ + $$(_Y_(!正交试验结果!正交试验结果见表 ) 结果表明$对于纯度而言$极差分析的最佳工艺 组合为 2 ) F ) 1 ) $即脂肪酸5尿素!o) %包合温度 为 f h%包合时间为 )# ?$此结果亦与,尿素 包合物的直径大小在脂肪酸与尿素配比为 o) 时最大$在包合温度为 f h最大$在包合时间 )# ? 时较-佳相符) 表 !正交试验结果 e ;/d OG4纯度 ;/d OG4纯度 #)d$++ & (+d$+ + + %&d$% # (d+( ) ) %d(#) + % (*d$*# ) & %#d&(& ( (*d% & %#d&(# # * #$d#% * # %%d)% # +$ %)d&+ $ % %)d)#% # + %+d++ % ( %(d%%# ( ++ (%d$$ (
* ($d&)) + +) *+d &$ #$d+#$ + +& *$d)) % #%d+&+ + + (d$$+ %+d#+* ( +# *d% * ) %d( + +% *$d&& +
& %*d%#%
极差分析得到最优组合$而不同配比%包合 温度%包合时间及其之间的交互作用对 ! 5亚麻酸 纯度影响的显著性分析则需进行方差分析$
见表 +)
表 +!正交试验纯度方差分析表
变异来源 GG
G
+
D
2 +(d)&) &+d#%
##d%((
+
F )%d%* #%(d(#$)%d%(* + 1 +()d$ &d+#
##d+
+
2F

+(%d&+$&)d%$
#%d+%&
+
2F
+
)$d%## d)() %d+$
+
21

%d$** (d% &d$$+ 21 + d)*# d#*( +d##% F1 +d(+*$d*&
d$* F1 + +d&$# +#d+$) +d+## + 误差 %d$*$( +d)# 总变异 + )#&d* !!注#$n$d$$+$n$d$)
结果表明$脂肪酸与尿素之间的配比%包合 温度%包合时间 ) 个主因素对 OG4纯度的影响均 为极显著 !D2j##d%((+DFj)%d%(*+D1j ##d+ +并且不同配比%包合温度和包合时间之 间的交互作用中除了!2i1 + 以外都显著或极显 著 ! D2F j#%d+%&+ D2F + j%d+$+ D21

j
&d $$++DF1 jd$*+DF1 + j+d+## $这是由 于不同配比%包合温度和包合时间为极显著因素 造成的) 不同配比%包合温度%包合时间之间的交互 作用整体呈显著或极显著$需对交互作用进行显 著性检验$见表 )) 结果表明$2 ) F ) $2 ) F + 和 2 + F ) 差异不显著$即 配比为 o)%包合温度为 f h$配比为 o)%包 合温度为 f$ h和配比为 o+d%包合温度为 f h组合对 OG4的纯度没有显著性影响) 2 ) 1 + 和 2 ) 1 ) 在 $d$ 水平下差异显著$即配比为 o ) 时$包合时间 +&$)# ? 对 OG4有一定的影响) F ) 1 + 与 F ) 1 ) 差异不显著$即包合温度为 f h$ 包合时间为 +&$)# ? 组合对 OG4的纯度没有显 著性影响) 从交互作用的显著性分析可知#最优 组合为 2 ) F ) 1 + 和 2 ) F ) 1 ) $为了节省包合的时间$ 提高效率$取 2 ) F ) 1 + 为最优组合$即脂肪酸与尿 素配比为 o)%包合温度为 f h%包合时间为 +& ?) 最优组合的气相图谱见图 ) 4d月见草油+Rd最优组合+d软脂酸+ +d硬脂酸+)d油酸+&d亚油酸+d ! 5亚麻酸) 图 !气相检测图 &!结论 通过观察不同工艺参数!脂肪酸与尿素的配 比%包合温度%包合时间的正交组合下的尿素包 合结晶物的形态大小和直径的变化趋势$知尿素 包合结晶物直径随着脂肪酸与尿素的配比的增 加而增加$随着包合温度的降低而增加$随着包 合时间的延长而增加$可判断尿素包合结晶物在 脂肪酸与尿素的配比为 o)%包合温度为 f h%包合时间为 +& ? 或 )# ? 直径最大$尿素包合 效果最好) *&+* 第 ) 卷第 $ 期 +$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[/Sd)$:UULM!$
9B6$+$$表 )!正交试验显著性检验 处理 平均值 处理 平均值 处理 平均值 2 ) F ) *$d)& +B4
2
)
1
+
(%d$&# &B4 F ) 1 + (%d(# )B4 2 ) F + (*d* )B4 2 ) 1 ) (&d+)# *\4R F ) 1 ) (#d(## )B4R 2 + F ) ((d$+* %B4
2
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!!注#同一列不同小写字母 $n$d $$同一列不同大写字母 $n$d$) !!通过对正交试验中各组合下OG4的纯度进行方 差和极差分析可知#脂肪酸与尿素之间的配比%包合 温度%包合时间为极显著因素$其中得到最优组合为 脂肪酸与尿素的配比为 o)%包合温度为f h%包 合时间为 +& ?$此时 ! 5亚麻酸的纯度为 *d% *e) 与尿素包合结晶物的结果相一致+并且不同配比%包 合温度%包合时间之间的交互作用影响整体也呈现显 著性$通过显著性检验得到结果与最优组合相一致) 参考文献# ./!惠琴$鲍时翔d多价不饱和脂肪酸分离与纯化技术进展.W/d 中国油脂$***$+&!+#)+d .+/!慕鸿雁$裘爱泳d ! 5亚麻酸生理功能%资源及分其离纯化.W/d 粮食与油脂$+$$ &$!$#+d
.)/!EB6MUXO-IVM.@/V@M0AMCB@LCMAC/DCB00N2D/2 @?MAMCV/C0B2.M
/VLCMBN2.SLUN/2 ./0A/L2J5\BUMJ VCMMVB@6B.NJ VCB.@N/2B@N/2.W/-
W4H<8$+$$#$()!)#+)d
.&/!刘凤霞$高秋华$薛刚$等 d高纯度 ! 5亚麻酸包合工艺研 究 * 5皂化值及皂化反应.W/d中国中药杂志$+ $$$)$ !# )&)d ./!刘凤霞$高秋华$薛刚$等d ! 5亚麻酸包合工艺优化研究.W/d 中成药$+$$ $+%!%#%#d .#/!薛刚$黄开勋$刘凤霞$等d
!
5亚麻酸以柱色谱和甲酯化纯化的
正交试验.W/d中国医药工业杂志$+$ $$)#!##)&$d .%/!陈洁d油脂化学.9/d北京#化学工业出版社$+$$ &#*$- .(/!胡小泓$张新才$周临桃$等d尿素包合物固相中回收脂肪酸
的工艺研究.W/d食品科学$+$ $$+#!#&d :>J,D,A-?@?IS,++, .-@?.>@-T,T-EID?+>O>@-@S JD-+D?H>?-.V-ABFD>, -@T.FH-?@&?DAB?S?@,.>MJ>D-+>@A?I?JA-+-W-@S A>TB@?.?S-T,.J,D,+>A>DH ,@E?KH>DO,A-?@?IFD>, -@T.FH-?@T?+J?F@E * Z4;OELB $ G:;O9B2 $ T_IOB2D + ! $ G:_QM2D7NB + $ O_H8?L7NB2 + !C1%&9(9%.D%%< GA-9)A97)< 8)(-)99/-)($ 1%&9(9%.8)%&%($ 6%/,>Q9?,2(/-A*&,*/97)< D%/9?,/I)-J9/?-,$37)(&-)( %+$$ $1>-)7+ +C09;7/,+9),%.F-%A>9+-A7&8)(-)99/-)($ 67)7)( K)?,-,*,9%.=9A>)%&%($67)7)( &%)$$&$ 1>-)7
!!.3KHAD,TA/!5K\>TA-O># P?MN2VSLM2.M/2 @?MLCMBN2.SLUN/2 ./0A/L2J L2JMCJNVMCM2@./2JN@N/2U!BS/.B@MJ AC/A/C@N/2$@N0M/V N2.SLUN/2$ @M0AMCB@LCM/VN2.SLUN/2,MCMU@LJNMJ @?C/LD? @?M/C@?/D/2BS@MU@$B2J @?M/CM@N.BSCMVMCM2.M/VLCMBN2.SLUN/2 AC/.MUUV/CVLC5 @?MC/A@N0NYB@N/2 ,/L2J \M/VMCMJ-;>AB?E# P?M/C@?/D/2BSM7AMCN0M2@,BUBJ/A@MJ$ B2J 0N.C/U./AM,BULUMJ @//\UMClM@?MU?BAM$BAMC@LCMUNYM/V@?MLCMBN2.SLUN/2 ./0A/L2J L2JMCJNVMCM2@@M.?2/S/DN.BSABCB0M@MCU$ @?MO<,BUM0AS/6MJ @/N2UAM.@@?MALCN@6/V
OG4-7>HF.A# P?MCMULS@UN2JN.B@MJ @?B@@?MCB@N//VVB@6B.NJUB2J LCMB$N2.SLUN/2 /V@M0AMCB@LCM$ @N0M/VN2.SLUN/2 ?BJ DCMB@MVM.@/2
LCMBN2.SLUN/2 ./0A/L2J-P?M@?CMMVB.@/CUB2J N@UN2@MCB.@N/2UUND2NVN.B2@S6BVM.@MJ @?MALCN@6/VOG4-P?MCMULS@UBSU/U?/,MJ @?B@@?M
\MU@AC/.MUU,BU@?B@@?MCB@N//VVB@6B.NJUB2J LCMB,BUo)$@M0AMCB@LCM/VN2.SLUN/2 ,BUf h$ @N0M/VN2.SLUN/2 ,BU+&
?d/?@T.FH-?@# _2JMC@?M\MU@./2JN@N/2$@?MALCN@6/VOG4CMB.? LA @/*d% *e+B2J N@NUVMBUN\SM@//\UMClM@?MU?BAMB2J @?MB5 0/L2@/V@?MLCMBN2.SLUN/2 ./0A/L2J @/CMVSM.@B2J DLNJM@?MLCMBN2.SLUN/2 @M.?2/S/D6d .a>C V?DEH/!MlM2N2DACN0C/UM/NS+ DB00BSN2/SM2N.B.NJ !OG4+ LCMBN2.SLUN/2+ LCMBN2.SLUN/2 ./0A/L2J+ /C@?/D/2BSM7AMC5 N0M2@ E?-# bQ(Y`NT\T++(` 责任编辑!周驰# *+* 第 ) 卷第$ 期
+ $$年 月 !!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! ! [/Sd)$ :UULM!$ 9B6$ +$$