全 文 ：栀子愈伤组织诱导的初步研究
潘清平，王清波，李琳，鲁耀邦
（湖南中医药大学 药学院，湖南 长沙 ４１０２０８）
［收稿日期］　２００８１０１０
［通信作者］　鲁耀邦，Ｔｅｌ：（０７３１）８４５８２２５，Ｅｍａｉｌ：ｌｕｙｂ４１４＠ｓｉｎａ．
ｃｏｍ
［作者简介］　潘清平，副教授，主要从事中药资源与质量研究工作。
Ｔｅｌ：（０７３１）８４５８２３４，Ｅｍａｉｌ：ｐａｎｑｐ２００６＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
　　栀子为茜草科植物栀子ＧａｒｄｅｎｉａｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓＥｌ
ｌｉｓ的干燥成熟果实，药材主要产于湖南、江西、湖
北、浙江及福建等地，系湖南产道地药材之一。其味
苦性寒，主归心、肺、三焦经，具有泻火除烦，清热利
尿，凉血解毒等功效，临床广泛用于热病心烦，黄疸
尿赤，血淋涩痛，血热吐衄，目赤肿痛，火毒疮疡等
症。由于目前栀子应用前景十分广阔，单纯依靠野
生和传统的栽培方法难以满足市场需求。因此，对
栀子进行组织培养和快速繁殖研究将有助于栀子的
开发利用。
鉴于近年来对于栀子组织培养的研究报道结果
差异较大［１４］，本实验结合现有研究状况对栀子愈伤
组织诱导及继代培养产生不定根的条件进行探讨，
旨在摸索出最佳诱导条件，考察培养物中主要成分
栀子苷的积累情况，为扩大栀子的药物资源和进一
步研究奠定基础。
１　材料
１．１　外植体
栀子Ｇ．ｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ的茎芽、茎段、叶片均采自
湖南中医药大学药用植物园并经湖南中医药大学中
药资源教研室周日宝教授鉴定。不同外植体准备在
灭菌前先用流水洗净后用无菌水浸泡过夜，然后以
洗洁剂水浸泡１０ｍｉｎ，再用无菌水洗净。灭菌先以
７０％乙醇浸泡 ４０ｓ，无菌水漂洗 ３次，再用 ０１％
ＨｇＣｌ２分别按照茎芽、茎段和叶片浸泡１０，１２，８ｍｉｎ，
无菌水漂洗６次。灭菌后将茎芽表面划伤，茎段和
叶片表面划伤后分别切成８～１０ｍｍ小段和１ｃｍ×
１ｃｍ左右小块再行接种培养。
１．２　仪器
光照培养箱（ＬＲＨ２５０Ｇ，广东省医疗器械厂）；
高效液相色谱仪（Ａｇｉｌｅｎｔ１２００ＬＣ，美国）；灭菌锅
（ＴＨＡ３５６０Ｃ，照鑫企业有限公司）；分析天平（１／１
万，ＡＲ１１４０奥豪斯国际贸易有限公司）。
１．３　试剂
琼脂（福建省泉州市泉港化工厂）；２，４二氯苯
氧乙酸（２，４Ｄ，ＰｈｙｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＬＬＣ）；６
苄基 腺 嘌 呤 （６ＢＡ，ＰｈｙｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
ＬＬＣ）；萘乙酸（ＮＡＡ，上海市曹阳化工厂）；甲醇（色
谱纯）；其他试剂均为分析纯。栀子苷对照品购自
中国药品生物制品检定所，批号１１０７４９２００６１３，纯
度９８％。
２　方法
２．１　愈伤组织诱导与培养
２．１．１　愈伤组织诱导　将经过灭菌处理的不同外
植体分别接种于培养基上以诱导愈伤组织。培养基
为ＭＳ基本培养基（３％蔗糖，琼脂０８％）附加以下
激素配比以筛选栀子愈伤组织诱导最佳培养基：
ⅠＭＳ＋ＮＡＡ０５ｍｇ·Ｌ－１＋６ＢＡ０５ｍｇ·Ｌ－１；
ⅡＭＳ＋ＮＡＡ０５ｍｇ·Ｌ－１＋６ＢＡ１０ｍｇ·Ｌ－１；
ⅢＭＳ＋２，４Ｄ１０ｍｇ·Ｌ－１＋６ＢＡ１０ｍｇ·Ｌ－１；
ⅣＭＳ＋２，４Ｄ２０ｍｇ·Ｌ－１＋６ＢＡ１０ｍｇ·Ｌ－１。
接种后置于光照培养箱中培养，培养条件为（２４±
１）℃，暗培养，继代周期为１０～１５ｄ。
２．１．２　愈伤组织生长状况检测　诱导率 ＝接种的
外植体总数／形成愈伤组织的外植体数×１００％。通
过愈伤组织的生长速度、颜色、质地等指标对诱导的
愈伤组织进行综合评价。将增殖后的愈伤组织切成
０５ｃｍ×０５ｃｍ大小接种于下列培养基：ⅠＭＳ＋
ＮＡＡ０１ｍｇ·Ｌ－１；ⅡＭＳ＋ＮＡＡ０２ｍｇ·Ｌ－１；
ⅢＭＳ＋ＮＡＡ０３ｍｇ·Ｌ－１。进行继代生根培养，
培养条件同２．１．１。
２．２　培养物中栀子苷含量检测
２．２．１　色谱条件　ＡｇｉｌｅｎｔＣ１８色谱柱（４６ｍｍ×
１５０ｍｍ，５μｍ）；流动相 甲醇水（１５∶８５）；检测波长
２３８ｎｍ；流速１０ｍＬ·ｍｉｎ－１；柱温３０℃；进样量１０
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第３４卷第１１期
２００９年６月
　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　
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μＬ。
２．２．２　对照品溶液制备　精密称取栀子苷对照品
２８９ｍｇ，用甲醇溶解定容到５０ｍＬ量瓶中，配制成
质量浓度为００５７８ｍｇ·Ｌ－１的溶液。
２．２．３　供试品溶液制备　精密称量离体培养的愈
伤组织和不定根干品粉末（过４号筛）０１ｇ，置具塞
锥形瓶中，精密加入５０％甲醇２５ｍＬ，称重，超声处
理２０ｍｉｎ，放冷，称重并补重，摇匀，滤过。精密量取
续滤液１０ｍＬ，置２５ｍＬ量瓶中，加甲醇至刻度，摇
匀，用微孔滤膜（０４５μｍ）过滤，作为供试品溶液。
２．２．４　线性关系考察　精密吸取栀子苷对照品储
备液０５，２０，４０，６０，８０，１００ｍＬ分别置１０ｍＬ
量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取１０
μＬ进样，测定峰面积。以峰面积积分值为纵坐标，
栀子苷量（μｇ）为横坐标进行线性回归，得回归方程
为Ｙ＝１２７６２Ｘ＋４４８６４，ｒ＝０９９９５，栀子苷进样
量在００２８９～０５７８０μｇ呈良好的线性关系。
２．２．５　精密度考察　取对照品溶液（００５７８ｍｇ·
Ｌ－１），按上述色谱条件，分别重复进样６次，测定栀
子苷平均峰面积以考察精密度，ＲＳＤ１２％，表明仪
器精密度良好。
２．２．６　稳定性考察　取供试品溶液，按上述色谱条
件，分别在０，２，４，８，１２，２４ｈ进样１０μＬ，测定栀子
苷平均峰面积以考察稳定性，ＲＳＤ２６％，表明样品
２４ｈ内稳定性良好。
２．２．７　重复性考察　取同一批栀子培养品，分别制
备６份供试品溶液，在上述色谱条件下分别进样１０
μＬ，测定栀子苷含量以考察重复性，ＲＳＤ１４％，表
明方法重复性良好。
２．２．８　回收率试验　精密称定已知含量栀子培养
品粉末００５ｇ各５份，分别精密加入００５７８ｍｇ·
Ｌ－１的对照品溶液５ｍＬ，再分别精密加入２０ｍＬ的
５０％甲醇。称重，超声 ２０ｍｉｎ，放冷，再称重，用
５０％甲醇补足失重，摇匀，过滤。在２．２．１色谱条件
下测定栀子苷的含量以考察加样回收率，平均回收
率为９７５８％，ＲＳＤ１６４％。
２．２．９　样品含量测定　精密吸取对照品溶液和供
试品溶液进样，按２．２．１色谱条件测定样品含量。
３　结果与分析
３．１　愈伤组织的诱导
以栀子不同部位（茎芽、茎段、叶片）为外植体
诱导愈伤组织后发现不同外植体诱导率不同。茎芽
和叶切片较易诱导出愈伤组织，１０ｄ左右即可在切
口周围见愈伤组织形成，其中以叶切片的诱导率最
高，达３０％。茎芽在１５ｄ左右即表现出较高的诱导
率（５９％）。茎段也能较好地诱导愈伤组织，但在１５
ｄ左右始观察到愈伤组织出现。至３０ｄ左右，茎芽、
叶片及茎段的诱导率继续上升，分别达到 ８２％，
７６％，５２％。由茎芽、叶片和茎段诱导出的愈伤组织
生长旺盛，质地疏松，色白，呈半透明状，继代后仍保
持良好的生长趋势。随着培育时间的延长，愈伤组
织逐渐由白色变为淡黄色，根据有关报道，应为栀子
黄色素的积累［５］。由此可见，愈伤组织的诱导和生
长与外植体有密切关系，以幼嫩组织的诱导效果最
佳，生长旺盛的部位诱导率明显高于其他部位的诱
导率，诱导效果茎芽＞叶＞茎段，见表１。
表１　栀子不同外植体的愈伤组织诱导率 ％　
外植体 １０ｄ １５ｄ ２０ｄ ３０ｄ
茎芽 ２０ ５９ ６５ ８２
叶片 ３０ ５０ ５６ ７６
茎段 ０ １５ ３９ ５２
　　通过选用３种常见植物激素 ＮＡＡ，２，４Ｄ，６ＢＡ
的不同配比进行实验研究，结果表明，ＭＳ＋ＮＡＡ０５
ｍｇ·Ｌ－１＋６ＢＡ１０ｍｇ·Ｌ－１的激素组合对栀子的
诱导率最高，诱导出的愈伤组织生长状况也较佳，见
表２。
表２　不同激素组合对栀子愈伤组织诱导和生长的影响
激素组合
／ｍｇ·Ｌ－１
诱导率
／％
愈伤组织生长状态
ＮＡＡ０５＋６ＢＡ０５ ７２ 生长良好，乳白色，半透明，组织疏松
ＮＡＡ０５＋６ＢＡ１０ ７６ 生长较快，乳白色，半透明，组织疏松
２，４Ｄ１０＋６ＢＡ１０ ６９ 生长较快，乳白色，半透明，组织疏松
２，４Ｄ２０＋６ＢＡ１０ ７２ 生长良好，乳白色，半透明，组织疏松
３．２　不定根的诱导与增殖培养
愈伤组织转入生根培养基１０ｄ后开始发根并
不断有新根长出，３０ｄ后生长密集，颜色以白色为
主且带有淡黄色根尖，根长约６～８ｃｍ。其中以接
种到ＭＳ＋ＮＡＡ０２ｍｇ·Ｌ－１的培养基中的诱导率
最高，根数量最多。不同激素浓度培养基配方对不
定根的诱导和生长状况比较结果见表３。
３．３　愈伤组织和不定根培养物中栀子苷的含量
依据色谱条件测定峰面积，按照外标法计算，检
测了不同培养时间的愈伤组织和不定根培养物中栀
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第３４卷第１１期
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　　表３　不同激素浓度对栀子不定根诱导和增殖的影响
激素
／ｍｇ·Ｌ－１
诱导率
／％
不定根生长状态
ＭＳ＋ＮＡＡ０１ ７２ 根数较少，生长适中
ＭＳ＋ＮＡＡ０２ ８０ 根数较多，细长，色白带黄色根尖，生长旺盛
ＭＳ＋ＮＡＡ０３ ３５ 短小细长，逐渐褐化死亡，生长缓慢
子苷的含量，结果在愈伤组织中未检出栀子苷。而
在培养３０～９０ｄ的不定根中可检测到栀子苷，且随
着培养时间的延长出现含量累积增加的趋势。经统
计学处理（成组ｔ检验），不同培养时间不定根中的
栀子苷含量有显著性差异（Ｐ＜００１）。具体不同培
养时间不定根样品中栀子苷含量测定结果见表４。
表４　不同培养时间栀子不定根中栀子苷质量分数
（珋ｘ±ｓ，ｎ＝５）
组别 培养时间／ｄ 栀子苷／％
１ ３０ ００１５±０００２
２ ６０ ００２１±０００２１）
３ ９０ ００３０±０００２１，２）
　　注：与１比较，１）Ｐ＜００１；与２比较，２）Ｐ＜００１。
４　讨论
同一植物来源的不同部位的外植体在相同条件
下的诱导效果不同。本实验结果表明，栀子茎芽和
幼嫩叶片的愈伤组织诱导率明显优于茎段，表明生
长旺盛的部位容易产生愈伤组织。这可能是因为不
同部位的外植体中所含的植物激素的含量和比率不
同，而外植体自身的生理状态及激素合成代谢的差
异与愈伤组织的诱导效果也有密切的关系［６］。可
见，在愈伤组织诱导时采用不同的外植体对诱导效
果有很大的影响。
本实验结合已有的相关报道［７］，筛选了一些常
用的激素及其浓度进行研究，发现 ＮＡＡ和６ＢＡ的
组合效果最佳，其中 ＮＡＡ的最适浓度为０５ｍｇ·
Ｌ－１，６ＢＡ的最适浓度为１０ｍｇ·Ｌ－１。愈伤组织诱
导产生不定根最佳培养基为 ＭＳ＋ＮＡＡ０２ｍｇ·
Ｌ－１。利用高效液相检测栀子培养物中活性成分栀
子苷，发现栀子培养在愈伤组织阶段并没有产生次
生代谢产物栀子苷，而在栀子不定根中可以检测到
栀子的活性成分栀子苷，而且其含量随着培养时间
的延长有增加的趋势，表明在栀子的不定根中是可
以产生所需成分的，不过与野生品相比，含量还有较
大差距［８］。由于不定根培养周期相对野生或栽培
的时间要短很多，所以单位时间内的有效成分产出
率还可以通过添加前体物质和诱导子、调整培养基
组成、给予环境胁迫和调节 ｐＨ等多种手段来进一
步提高栀子苷的含量，这些工作将在以后实验中进
行深入研究。
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北华大学学报：自然科学版，２０００，１（６）：５３３．
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［５］　阎少辉，张德权．栀子色素研究进展与开发［Ｊ］．食品研究与开
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［６］　谷瑞升，杜生明．国家自然科学基金委员会启动“植物激素作
用的分子机理”重大研究计划促进我国植物激素研究的跨越
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［８］　黄青萍．高效液相法测定不同产地栀子中栀子苷的含量［Ｊ］．
医学信息，２００８，２１（９）：１７０６．
［责任编辑　吕冬梅］
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