全 文 :三七总皂苷油水分分配系数及大鼠在
体肠吸收动力学研究
翟永松,杜守颖,徐冰,陆洋,高瑛
(北京中医药大学 中药学院,北京 100102)
[摘要] 目的:测定三七总皂苷(PNS)3种主要有效成分三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1和 Rb1的油水分配系数及其肠吸收
情况。方法:采用经典摇瓶法测定3种主要有效成分的油水分配系数;采用大鼠在体肠吸收模型研究3种主要有效成分的肠
吸收情况,考察其在小肠各段的吸收情况及药物浓度对吸收的影响。结果:三七皂苷 R1(R1)、人参皂苷 Rg1(Rg1)和 Rb1
(Rb1)的油水分配系数P分别为10814,63104,02743;logP分别为00340,08001,-05618;PNS质量浓度02g·L
-1
组R1,Rg1和Rb1的吸收速率常数(Ka)分别为(0135±0006),(0144±0015),(0238±0013)h
-1;05g·L-1组R1,Rg1和
Rb1的Ka分别为(0110±0002),(0110±0006),(0140±0008)h
-1,1g·L-1组 R1,Rg1和 Rb1的 Ka分别为(0095±
0016),(0099±0011),(0137±0012)h-1,统计结果显示,02g·L-1组Ka与05,1g·L
-1组有显著性差异(P<001),
05g·L-1与1g·L-1Ka无显著差异;Rb1Ka与R1,Rg1有显著性差异(P<001);在十二指肠、空肠、回肠中,R1的Ka分别为
(0030±0006),(0033±0004),(0033±0007)h-1,Rg1的 Ka分别为(0032±0006),(0044±0012),(0044±
0011)h-1,Rb1的Ka分别为(0042±0007),(0065±0007),(0044±0014)h
-1,统计结果显示,不同肠段 Ka无显著性
差异。结论:根据经典理论,R1,Rg1和 Rb1均不易吸收;PNS中3种成分 Ka随浓度的增加而逐渐减小,02g·L
-1组 Ka高于
05,1g·L-1组,Rb1的Ka高于R1和Rg1,PNS吸收除被动扩散外,可能还存在其他吸收机制;PNS在大鼠小肠各个肠段均有
吸收。
[关键词] 三七总皂苷;油水分配系数;三七皂苷R1;人参皂苷 Rg1;人参皂苷Rb1;肠吸收
[收稿日期] 20090903
[基金项目] 国家“十一五”科技支撑计划项目(2006BA106A17);
科技部“重大新药创制”科技重大专项(2009ZX09502008)
[通信作者] 杜守颖,博士,教授,博士生导师,主要从事中药新剂
型与新技术研究,Tel:(010)84738645,Email:dushouying@263net
三七总皂苷(PNS)是三七的主要活性成分,人
参皂苷 Rg1(notoginsenosideRg1,Rg1),和人参皂苷
Rb1(ginsenosideRb1,Rb1)含量较高,而三七皂苷R1
(notoginsenosideR1,R1)是其代表性成分
[1]。PNS
为极易溶解物质,在人工胃液、人工肠液和水中的溶
解度均大于1g·mL-1。现代研究表明PNS在脑血
管疾病治疗方面具有确切疗效,对脑血管缺血缺氧
损伤、脑缺血再灌注损伤有保护作用,对脑神经细胞
凋亡有抑制作用[2]
油水分配系数P是研究药物亲水亲脂性,预测
药物在肠道吸收的重要参数之一,一般认为 logP=
2~3的药物在肠道中较易被吸收,而当药物的
logP<0时则极不易被肠道吸收[3]。大鼠在体肠循
环法是研究药物肠吸收动力学的重要方法,用于预
测口服药物的人体吸收。本研究通过对 PNS中 3
种主要有效成分 R1,Rg1,Rb1的油水分配系数及其
在体肠吸收的研究,旨在丰富药物的亲水亲脂性对
吸收的影响,探索 PNS的吸收规律和特征,为 PNS
的剂型开发提供生物药剂学依据。
1 材料
11 动物
SD大鼠,雄性,体重220~250g,北京维通利华
实验动物技术有限公司提供,动物许可证号 SCXK
(京)20070001。
12 仪器
岛津 LC20AT高效液相色谱仪,Labsolution工
作站,电子蠕动泵(DDB300型,上海之信仪器有限
公司),超声波清洗器(CX100型,北京医疗设备
厂),飞鸽离心机(TGL16G型,上海安亭科学仪器
厂),旋涡混合器(VORTEX5型,江苏海门其林贝尔
仪器制造有限公司)。
13 药品及试剂
人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1对照
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品(中国药品生物制品检定所,批号分别为110703
200424,110704200318,110745200415),PNS(云南
云科药业有限公司,批号090201,R1,Rg1和Rb1质量
分数分别为966%,4912%,2373%),CALEDON
乙腈(色谱纯),屈臣氏蒸馏水,其他试剂均为分
析纯。
2 方法
21 PNS中3种有效成分油水分配平衡时间及油
水分配系数测定
参照药典配制人工肠液作为水相(pH≈68),
人工肠液与正辛醇混合,室温搅拌24h,静置过夜,
分液后得到水饱和正辛醇作为油相,正辛醇饱和的
水作为水相。精密称取 PNS50mg于25mL量瓶
中,以水相稀释至刻度,得2g·L-1PNS的水溶液,
测定初始浓度。移取PNS水溶液置具塞三角瓶中,
加入油相使水油为1∶1,水浴恒温振荡(37℃,120
次/min),分别于2,4,8,12,18,24h各取2份,离心
分离,取水层HPLC测定PNS含量,计算均值。油水
分配系数 P=C0/Cw。C0药物在油相中的浓度;Cw
药物在水相中的浓度。
疏水常数logP=logC0/Cw
3种成分的油水分配系数和疏水常数以达到平
衡时的P和logP值计。
22 PNS大鼠在体肠循环试验
221 试液配制
KrebsRinger′s营养液(下文简称 K试液):称
取 NaCl78g,KCl035g,CaCl2037g,NaHCO3
137g,NaH2PO4032g,MgCl2002g,葡萄糖14
g,加蒸馏水使成1000mL[4]。
肠循环液配制:分别精密称 PNS20,50,100mg
于100mL量瓶中,K氏液溶解并稀释至刻度,作为
低、中、高3个浓度的药物肠循环液。
空白肠循环液:大鼠禁食12h,自由饮水,10%
水合氯醛麻醉,沿腹中线打开3cm,在十二指肠上
端(距幽门约1cm处)和回肠下端(距盲肠上端10
cm处)各切一小口,十二指肠上端插入硅胶管后,用
线扎紧,37℃预热的生理盐水以5mL·min-1流速
冲净小肠内容物,排净生理盐水,在回肠下端插入硅
胶管做成循环回路,取 K氏液50mL,先以5mL·
min-1,再以35mL·min-1,循环3h,中止试验,即
得空白肠循环液。
222 肠循环液中PNS的含量测定
DiamonsilTMC18色谱柱(46mm×250mm,5
μm);流动相乙腈(A)磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠
0125moL·L-1,用 H3PO4调整 pH=7),洗脱梯度
见表1;检测波长203nm;流速1mL·min-1;柱温
室温,见图1。
表1 流动相梯度 %
t/min A B
0~15 23 77
15~30 40 60
30~35 40 60
A空白肠液;B对照品;C供试品;1R1;2Rg1;3Rb1。
图1 PNS大鼠肠吸收HPLC图
2221 标准曲线 以 K氏液配制 R1,Rg1和 Rb1
质量浓度分别为1088,4020,4100mg·L-1的混
合对照品溶液,分别吸取上述溶液 05,10,20,
50mL于10mL量瓶中,K氏液稀释至刻度。将上
述对照品溶液分别进样10μL,以峰面积为纵坐标,
以浓度为横坐标进行线性回归。
三七皂苷R1质量浓度(C)在544~1088mg
·L-1与峰面积(A)线性关系良好,回归方程为A=
310721C+15118(r=09999);Rg1质量浓度
(C)在2010~4020mg·L-1与峰面积(A)线性关
系良好,回归方程为 A=278222C+89134(r=
09999);Rb1质量浓度(C)在2050~4100mg·
L-1与峰面积(A)线性关系良好,回归方程为 A=
255237C+46621(r=09999),3种成分标准曲
线的r值均符合试验要求。
2222 精密度试验 同一供试品连续进样5次,
R1,Rg1,Rb1的RSD分别为096%,100%,098%,
符合试验要求。
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2223 稳定性 含PNS的肠循环液在24h内稳
定性良好,R1,Rg1,Rb1的 RSD分别为 084%,
029%,014%,符合实验要求。
2224 加样回收率 取一定量的三七混合对照品
溶液,水浴锅60℃挥干,加入已知含量的PNS肠循环
液,超声后测定(n=6),R1,Rg1,Rb1的加样回收率分
别 为 10097% (RSD 056%),10322% (RSD
14%),10230% (RSD16%),均符合试验要求。
223 PNS在空白肠液中的稳定性研究
取空白肠液50mL,以空白肠液制备PNS溶液,
37℃水浴恒温,分别于0,1,2,3,4h取样测定,以峰
面积变化考察PNS在空白肠液中的稳定性。
224 蠕动泵管路的物理吸附情况考察
取PNS肠循环液于体外空循环3h,在0,05,
1,2,3h取样测定,考察 PNS中 R1,Rg1,Rb1在管路
的吸附情况。
225 大鼠在体肠循环试验
按照221项下方法先以5mL·min-1循环15
min,再以35mL·min-1循环,改变流速时即为 0
时,以后分别在05,1,15,2,25,3h取样1mL,每
次取样后补加空白 K氏液1mL。在循环回路中用
量筒盛装50mLPNS肠循环液,每到取样时间点读
取液体体积,待循环完毕,用空气排净肠内和管路内
液体,即为肠道和管路的死体积。死体积加上每一
时间点的量筒读数即为该时间点循环液体积,以此
方法进行肠循环液的体积校正。研究 PNS在不同
肠段的吸收情况时,按如下方法取肠段,十二指肠自
幽门下1cm处起向下10cm,空肠自幽门下15cm
起向下 10cm,回肠自盲肠向上 20cm起向下 10
cm,各段肠循环所用含药循环液体积均为15mL。
226 吸收动力学参数的计算
剩余药量Xn=CnVn+1∑
n-1
i=1
Ci;
Cn为药物浓度;Vn为肠循环液体积;以小肠内剩
余药量的对数(lnX)对取样时间t作图,所得直线斜
率即为吸收速率常数Ka。
吸收半衰期t1/2(h)=0693·Ka。
227 统计方法
采用SAS统计软件对实验数据进行统计分析。
3 结果
31 PNS中3种有效成分油水分配平衡时间及油
水分配系数测定
油水分配系数时间曲线见表2,图2。由不同
时间油水分配系数可知,R1,Rg1,Rb1在12,18,24h
3个时间点 P值的 RSD分别为 075%,12%,
21%,说明在12h时,PNS中R1,Rg1,Rb1在油水两
相中分配已达到平衡。R1,Rg1,Rb112h的 logP分
别为00340,08001,-05618。
表2 PNS中3种成分油水分配系数
成分 时间/h Cw
-
/g·L-1 Co
-
/g·L-1 P logP
R1 2 0.0984 0.0637 0.6479 -0.1885
4 0.0944 0.0678 0.7179 -0.1439
8 0.0827 0.0794 0.9608 -0.0174
12 0.0779 0.0842 1.0814 0.0340
18 0.0774 0.0847 1.0943 0.0392
24 0.0773 0.0848 1.0965 0.0400
Rg1 2 0.1793 0.6592 3.6760 0.5654
4 0.1483 0.6902 4.6535 0.6678
8 0.1213 0.7173 5.9134 0.7718
12 0.1147 0.7239 6.3104 0.8001
18 0.1168 0.7218 6.1806 0.7910
24 0.1168 0.7218 6.1789 0.7909
Rb1 2 0.5761 0.0884 0.1535 -0.8140
4 0.5697 0.0948 0.1665 -0.7786
8 0.5504 0.1142 0.2074 -0.6831
12 0.5215 0.1430 0.2743 -0.5618
18 0.5170 0.1476 0.2854 -0.5445
24 0.5177 0.1468 0.2836 -0.5473
注:Cw药物在水相中的平均浓度;Co药物在油相中的平均浓度。
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A三七皂苷R1;B人参皂苷Rg1;C人参皂苷Rb1。
图2 PNS中3种指标成分的油水分配系数时间曲线
32 PNS中R1,Rg1,Rb1的大鼠在体肠吸收研究
321 PNS在大鼠空白肠液中的稳定性
PNS在空白肠液的稳定性考察结果 R1,Rg1,
Rb1峰面积在 4h内的 RSD分别为 28%,15%,
20%,3种成分在37℃的空白肠液中4h内基本
稳定。
322 PNS中R1,Rg1,Rb1在蠕动泵管路的物理吸
附情况
PNS在管路的物理吸附情况结果各时间点 R1,
Rg1,Rb1的峰面积 RSD分别为 13%,089%,
10%,3h内PNS在循环管路中基本不吸附。
323 大鼠在体肠吸收试验结果
3231 药物浓度对PNS中R1,Rg1,Rb1吸收速率
的影响 分别考察了质量浓度为02,05,1g·L-1
的PNS中R1,Rg1,Rb1的Ka和吸收半衰期t1/2,结果
见表3。分别以剩余药量的对数值对时间作图,见
图3。统计结果表明,02g·L-1组Ka大于05,10
g·L-1组,且有显著性差异,05g·L-1组Ka大于1
g·L-1组,但无显著性差异。说明药物浓度对 PNS
中3种成分的吸收有影响,Ka随浓度增加而减小。
Rb1的Ka大于R1和 Rg1(P<001),具有显著性差
异。R1和Rg1的吸收速率常数无显著性差异。
表3 不同浓度时PNS中3种指标成分的吸收动力学参数(珋x±s,n=4)
PNS质量浓度
/g·L-1
R1 Rg1 Rb1
Ka/h-1 t1/2/(h) Ka/h-1 t1/2/h Ka/h-1 t1/2/h
02 0135±00061) 5126±02311) 0144±00151) 4866±0506 0238±0013 2915±0161
05 0110±00021,2) 6299±0116 0110±00061,2) 6290±0369 0140±00082) 4978±02912)
10 0095±00161,2) 7421±1118 0099±00111,2) 7070±0730 0137±00122) 5076±04492)
注:1)与Rb1相比P<001;2)与02g·L-1组相比P<001。
AR1;BRg1;CRb1。
图3 不同质量浓度时大鼠小肠吸收曲线
3232 PNS中 R1,Rg1,Rb1在不同肠段的吸收速
率 计算3种成分小肠不同部位的 Ka和吸收半衰
期t1/2,见表4。统计结果表明,PNS中3种成分在
不同肠段均有吸收,吸收速率无显著性差异。
4 讨论
logP反映了药物的亲水亲油性,是用于药物预
测跨膜被动转运的重要参数。3种成分的logP均未
在2~3内且小于1,其在体肠吸收研究结果也表明
3种成分均不易吸收,与经典理论一致。从
logP来看,Rg1>R1>Rb1,Rb1的logP<0,亲水性
表4 PNS在不同肠段中的吸收动力学参数(珋x±s,n=4)
肠段
R1 Rg1 Rb1
Ka/h-1 t1/2/h Ka/h-1 t1/2/h Ka/h-1 t1/2/h
十二指肠 0030±0006 23912±4752 0032±0006 22075±3810 0042±0007 16673±2594
空肠 0033±0004 21211±2622 0044±0012 16498±4094 0065±0007 10818±1293
回肠 0033±0007 21078±0011 0044±4678 16427±0014 0044±4482 16683±3757
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最强,相对分子质量最大,但其 Ka明显大于 R1和
Rg1。李晓宇
[5]等的 PNS药动学研究结果也表明
Rb1的生物利用度较R1和Rg1高,说明Rb1的吸收除
跨膜被动转运外,可能存在主动吸收或细胞间被动
扩散等其他吸收方式,其机制有待于进一步研究。
采用量筒直接读数校正体积的关键在于死体积
自始至终保持不变。经过试验研究证实当大鼠体位
高于量筒上沿时,大鼠肠内压力稳定,死体积基本保
持不变;而当大鼠体位低于量筒上沿时,循环液靠大
鼠肠道内的压力才能流回量筒,使肠管变粗,死体积
有逐步增大的趋势。此外,在回肠出口使用口径比
较粗的硅胶管以及在体循环前将肠道充分洗涤干
净,避免在试验中出现堵塞,也是保持死体积不变的
措施。
通过比较不同流速对肠吸收的影响发现,在流
速为25mL·min-1时 PNS的吸收量很小,当流速
为35mL·min-1吸收明显增加,这可能是由于流
速的升高造成肠内静压力升高,可能与细胞间隙屏
障通透性增加有关。
从全小肠吸收的研究结果可见,随着 PNS浓度
的升高3种成分的 Ka均下降,提示 PNS可能存在
主动吸收;PNS在各肠段均有吸收,提示 PNS可能
开发成缓控释制剂。
有研究认为 PNS经胃肠道水解成皂苷元形式
吸收,本课题组对PNS在模拟胃肠环境下的稳定性
进行了研究,证实药物主要以原型存在,现有的一些
PNS药动学数据也表明PNS在小肠有一定吸收。
[参考文献]
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O/W partitioncoeficientofPNSandabsorption
kineticsofitinratintestine
ZHAIYongsong,DUShouying,XUBing,LUYang,GAOYing
(SchoolofChinesePharmacy,BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing100102,China)
[Abstract] Objective:TodeterminetheO/Wpartitioncoeficientofpanaxpseudoginsengsaponin(PNS)andinvestigatethe
absortionkineticsofitinwholesmalintestineanddiferentintestinalsegmentsofratsMethod:Theshakeflaskmethodwasem
ployedtodeterminetheO/Wpartitioncoeficientofgeniposide,andaninsituintestinalperfusionmodelwasemployedtoinvestigate
theabsorptivekineticsofgeniposideResult:Thepartitioncoeficient(P)ofR1,Rg1andRb1ofPNSwere10814,63104and
02743,respectively,andtheirlogPwere00340,08001,-05618,theabsorptiverateconstants(Ka)ofR1,Rg1andRb1of
PNSattheconcentrationof02,05,10g·L-1were(0135±0006),(0110±0002),(0095±0016),(0144±0015),
(0110±0006),(0099±0011),(0238±0013),(0140±0008),(0137±0012)h-1,respectivelyTheKaofR1,Rg1
andRb1ofPNSwere(0030±0006),(0033±0004),(0033±0007),(0032±0006),(0044±0012),(0044±
0011),(0042±0007),(0065±0007),(0044±0014)h-1atduodenum,jejunum,ileum,respectivelyTheabsorptionrate
ofRb1washigherthanR1andRg1Conclusion:AccordingtothePandthelogP,itcanbeconjecturedthattheabsorptionofR1and
Rg1arebeterthanRb1.TheabsorptionrateisdecreasedwiththeincreaseofthePNSconcentrationTheirabsorptionisthepassive
difusionmechanismandothertransportmayalsotakepartinthetransportprocessPNSisabsorbedatalsmalintestinalsegmentsof
rats,therearenosignificantdiferencesbetweenthethreesections
[Keywords] PNS;insituintestinalperfusionmodel;notoginsenosideR1;ginsenosideRg1;ginsenosideRb1;O/Wpartition
coeficient
doi:10.4268/cjcmm20100809
[责任编辑 周驰]
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