全 文 ：· 药理实验与临床观察 ·
三七总皂普对 T N F 、 N O 含量的影响及其机制研究
第三军医大学药理教研 室 (重庆 4 0 0 0 3 8) 李晓辉 ` 李淑慧
摘 要 采用 sc 角叉菜胶 ( C ar ) 25 m g k/ g 复制大 鼠背部气囊滑膜炎模 型 。 白细胞计数 、 蛋 白含量
分别用试管稀释法和 L o w yr 法测定 。 酶联免疫吸 附分析法 、 iR va n ol 法和 F叮 a 一 2 荧光分析法分别
用于测定灌洗液 中 T N F 、 N O 含 量以及中性粒细胞胞 内游离钙 ( N eu 一 [C a 纤」1 )水平的变化 。 结果显
示 :三七 总皂昔 (P n s ) 60 、 120 、 24 0 m g k/ 9 3 个剂量组 均能一定程度地 降低灌洗液中 白细胞数 、蛋 白
含量 、 T N F 及 N O 含量 ; 与此同时 , 抑制 N e u 一 〔C a “ + ] i 水平 的升高 , 其抑制率分别 为 : 9 . 2% 、 34 . 3%
及 3 9 . 2% 。 提示 P n S 具有 良好抗炎 活性 , 其机制与 抑制灌洗液 中炎性细 胞因子 T N F 及 N O 水平的
升高有密切关 系 , 而抑制 N eu 一〔C a Z一卜〕; 水平 的升高则是 P n S 抑制炎性细胞 因子含量 升高的重要分
子机制之一 。
关键 词 三七总皂昔 炎证 T N F N O 游离钙
三 七 总皂 昔 ( t o t a l s a p o n i n s o f p a n a x
n o t o g i n s e n g
,
P n S ) 是 三七 根 的主 要 活性 成
分 ,具有良好的抗炎活性川 , 但其抗炎机制 尚
不清楚 。 肿瘤坏死因子 ( t u n l o r n e c r o s i s f a c -
ot r
,
T N F ) 是 一 重要 的炎性细胞 因子 , 多种
炎性疾病均伴有 T N F 含量的升高川 。一氧化
氮 ( N O )是新近发现的另一重要致炎分子川 。
鉴 于 P n S 与人 参 皂 昔 组成 成 分 具 有类 似
性闭 , 而人参皂昔具有调节细胞因子生成 的
作用阁 , 故我们 以角叉菜胶 ( C a r )诱导的大 鼠
气囊滑膜 炎为模型 , 在研究 P n S 抗炎作用的
同时探讨 了 P n S 对灌洗液中 T N F 及 N O 含
量的影响 。 因细胞 内游离钙的变化介导 N O
的致伤作用困 , c a Z十参予 T N F 的释放川 。 为
此 , 进一步探讨 了 P n S 对 N e u 一「C a Z+ 〕i 水平
的影响 。
1 材料和方法
1
.
1 动物 : 健康雄性 W i s t a r 大鼠 , 体重 ( 1 8 5
士 3 4 ) g , 由第三军 医 大学实 验动物 中心提
供 。
1
.
2 药品与试剂 : P n S 为中国科学院昆明植
物研究所提供 (粉剂 , 含量 9 % ) ; 地塞米松
( D e x ) 为卫 生部药品检定所提供 ; 角叉菜胶
( C a r )为辽宁药物研究所产 品 ; r iva n ol : 美 国
iS g m
a 产品 ;肿瘤坏死因子 ( T N F )试剂盒 : 军
事 医学科学院基础所提供 ; F盯 a 一 2 及 F盯 “ 一 2
A M
: 中国科学院上海药物研究所提供 ; 其它
试剂为国产分析纯级 。
1
.
3 动物处理 : 随机将大鼠分为 6 组 (每组
8 只 ) : 正常组 、 C ar 致炎组 (对 照组 ) 、 C ar +
P n S 6 0
、
1 2 0
、
2 4 0 m g / k g 组 及 C a r + D e x l
m g / k g 组 。 于 C a r 致炎前 3 0 m i n 及致炎后 6
h 分别 i p P n S 和 D e x , 对照组给予等容量溶
媒 。 C a r 致 炎后 12 h 活 杀大 鼠 , 用 无钙 镁
H a n k
’
S 液 ( H B S S )灌洗 , 收集灌洗液进行有
关指标测定 。
1
.
4 大鼠气囊滑膜炎模型复制 :参照文献方
法进行仁8〕 。 气囊 内注射 C a r 2 5 m g / k g (正常
组给予等容量溶媒 )诱导炎症 , 致炎后 Z h 活
杀大 鼠 , 背部气囊 内注人 4 m L H B S S 灌洗 ,
收集灌洗液并置于已硅化试管 中 。 取少许灌
洗液行白细胞计数及分类计数 , 其余部分立
A d d r e s s
:
eD P
a r t m e n t o f
李 晓辉
P h a r m a e o lo g y
,
T h e T h i r d M i l医学博士 , 药理学教授
e d i e a l U n i v e r s i t y
,
C h o n g q in g
免疫药理学会 副主任委员兼秘书长 、 中国药理学会理事 。
(军 队 )二等奖 1 项 、 三等 奖 3 项 。
改研室主任 。 近年 主要从事抗炎 免疫药理研究工作 , 现为全 国抗 炎
首届中法国际药理学青年施维雅优秀工作者奖获得者 , 曾获省部级
.
5 1 4
·
即离心 ( 4 C , 1 8 0 0 x g , l o m i n ) 收集上清液
一 7 0℃贮存备用 。 将沉淀 白细胞用 H B S S 液
洗涤 2 次 ( 4 ℃ , 1 8 0 0 x g , s m i n ) , t y p a n b l u e
检查 白细胞活力 , 结果细胞 活力大于 97 % ,
N e u 占约 9 5% , 用 H B S S 调整成一定浓度的
细胞悬液后备用 。
1
.
5 灌 洗液 中蛋 白含量 的测 定 : 按 L o w yr
法进行〔 , : 。
1
.
6 灌洗液 中 T N F 含量测定 : 采用酶联免
疫吸附分析法进行 l0[ 〕。
.1 7 灌洗液中 N O 测定 : 参照文献方法 1l[ 〕 ,
略加改进 。 ( 1) 样品处理 : 取样品 0 . 25 m L ,加
人 4 0 m ol / L 过 氯酸 0 . 1 m L , 混 匀 后 离 心
( 3 0 0 0 只 g , 3 o m i n ) , 弃沉淀 , 一 7 0 ℃贮存待
测 。 ( 2) 测定 : 取样品或不同浓度的亚硝酸钠
标准液加蒸锢水至 Z m L ,加人 0 . 1% r iv a n o l
2 0 0 拼L 、 1 2 m o l / L 盐酸 8 0 0 拌L , 于波长 5 2 0
n m 处测定光密度值 。 根据标准曲线计算样
本 N O 含量 , 以 m g / L 表示 。
1
.
8 N e u
一
[ C
a Z+ l 〕i 测定 [ , 2〕 : 取 细胞悬 液 ( 1
x 10
9
/ L )
, 用 含 有 0 . 2%牛 血 清 白 蛋 白的
H E P E S
一 K r e b s R i n s 缓冲液 ( H K R ) (含 : N a -
C I 1 1 6
、
K C I 5
.
4
、
M g C I
: 1
.
0
、
H E P E S 2 0
、 葡
萄糖 1 0 m m o l / L ; p H 7 . 4 ) 洗涤 1 次 , 加人用
D M SO 配制的 F u r a 一 2 A M 贮存液 ( 2 m m o l /
L ) 使 其 终 浓 度 为 4 拌m ol / L , 37 ℃孵 育 4 0
m i n
,使 F u r a 一 2 A M 负载到细胞内 。 用 H K R
洗涤 2 次 , 测定荧光强度 。 测定条件 : 以 5 0 0
n m 波长 为发射波 , 激发光光栅 和发射 光光
栅均 固定为 10 n m ,扫描激发光光谱 ,若最大
荧光峰在 345 n m , 即说 明负载成功 。 固定激
发发射光波长于 3 45 n m , 测定 无 C a +2 及 1
m m ol / L C a
Z + 时的荧光强度 , 继之加 人 T ir -
t o n
一
X
一
1 0 0 (终浓度为 O , 0 9% ) 破细胞膜 测定
最大荧光强度 ( F m a 、 ) ,再 加人 9 m m o l / L E D -
T A 络 合 全 部 钙 , 以 测 定 最 小 荧 光 强 度
( F m
i n
)
, 依下列公式计算 [ C a , + 〕i 浓度 。
仁C a Z + ] i = K d ( F 一 F o i n ) / ( F m a x一 F )
K d 为 F u r a 一 2 与 C a Z+ 的解离常数 , 3 7℃
时为 2 2 4 n m o l / L 。
1
.
9 统计分析 : 各组数据采用方差分析和相关
显著性检验 。 结果用均数士标准差 (牙士 , )表示 。
2 结果
2
.
1 对灌洗液 中白细胞计数及蛋白含量 的
影 响 : 由表 1 可见 , C ar 致炎后 , 灌洗液 中白
细胞计数及蛋 白含量均显著高于正常组 (尸
< 0
.
0 1 )
,
P n S 在所用剂量范围内能明显降低
白细胞数及蛋白含量 ,且呈剂量依赖性 。
表 1 对灌洗液中白细胞计数及蛋 白含 l 的影响
( x 士 s )
剂量 动物数
(叱 / kg ) (只 )
白细胞
( I X 10 9 /L )
蛋白
(g /L )
正常组 一 8 2 . 95士0 . 54 0 . 59士0 . 20
C a r致炎组 一 8 47 . 87士15 . 34△△ 7 . 46士1 . 26△△
aC r+孙 5 60 8 30 . 29士9 . 4 9△△ 圣 赞 7. 41士1 . 55△△
aC
r+ P n S 120 8 21
.
16士7 . 15△△ 苍 份 5 . 70士1 . 47△△ 份
ca r+ P n S 240 8 16
.
99士6 . 18△ △ 苦 件 4. 41士1 . 35△△ . 砰
aC r+块 x 1 8 16 . 85士6 . 99△△ 份 卜 5 , 3 9士1. 2 0△ △ 苍 ·
与正常组 比较 : △△尸 < .0 01
与致炎组 比较 : 甘 尸< 0 . 05 “ 尸 < 0 . 01
2
.
2 对 C a r 致 炎大 鼠灌洗液 中 T N F 含量
的影响 : 由表 2 可见 , C a r 致 炎后 , 大 鼠气囊
灌洗 液 中 T N F 含 量明 显升 高 (尸 < 0 . 0 1 ) ,
P n S 在所 用剂量范 围内能一定程度 地抑制
T N F 含量的升高 , 且呈剂量依赖性 。 eD x 具
有类似作用 。 但各药物不能使 T N F 含量恢
表 2
剂量
( m g / k g )
对灌洗液中 T N F 及 N O 含 , 和 N eu 一比扩+ 〕.水平的影响 (牙士 s)
组别 动物数
(只 )
T N F
( g / L )
N O
( m g / L )
N e u
一仁C a Z+ 〕;
( n m o l / L )
正常组
aC
r致炎组
C a r+ P n S
C a r+ P
n S
C a r+ P n S
C a r十 1死 x
1
.
2 2士 0 . 3 6
6
.
4 7士 2, 0 6 △△
5
.
6 6士 2 . 2 1 △△
4
.
3 4士 1 . 6 6△△ .
3
.
0 8士 0 . 7 4△ 裕 畏
2
.
9 7士 0 . 7 3△△ ` .
1
.
0 9士 0 . 2 0
4
.
7 0士 1 . 0 2△ △
4
.
8 9士 1 . 3 2△△
3 4 8士 0 . 5 9△△ “
2
.
1 1士 0 . 5 9△ △二
2
.
2 2士 0 . 3 5△△ 份 ,
2 1 6士 4 8
4 8 5士 1 2 6△△
4 4 1士 1 3 1△△
3 2 4 士 1 1 5△ 于
2 9 4士 8 6△ ’ .
4 8 0士 1 0 6△△
601204
1
与正常组比较 : △尸 < 0 . 05 △△尸 < 0 . 01 ; 与致炎组 比较 : 璐 尸 < 0 . 05 ’ “ 尸 < 0 . 01
《中草药 》 1 99 9 年第 3 。 卷第 7 期 . 5 1 5 .
复到正常水平 。
2
.
3 对 C a r 致炎大 鼠灌洗液中 N O 含量 的
影响 : C a r 致炎 后大 鼠气囊灌洗液 中 N O 含
量明显升高 , P n S 在 所用剂量 范围内能一定
程度地降低灌洗液中 N O 的含量 ,且 呈剂量
依赖性 。 D e x 也具有类似作 用 (见表 2 ) 。
2
.
4 对 C a r 致炎大 鼠 N e u 一 [ C a Z斗 」, 水平 的
影 响 : C a r 致 炎 后 大 鼠 气 囊 灌 洗 液 N e u -
〔C a Z+ 〕; 水平 明显 升高 ( P < 0 . 0 1 ) , P n S 6 0 、
12 0
、
24 0 m g k/ g 能 一 定 程 度 地 抑 制 N eu -
[ C
a +2 〕、 水 平 的 升 高 , 其 抑 制 率 分 别 为
9
.
2%
、
3 4
.
3%
、
3 9
.
2% ; D e x 无 降 低 N e u -
[ C
a , + 〕; 水平的作用 (见表 2 ) 。
2
.
5 相关分 析结 果 : P n S 对灌 洗液 中 T N F
及 N O 含量变化 的影响与其对灌洗液 中蛋 白
含量 变 化 的 影 响 均 呈 显 著 正 相 关 (r -
0
.
9 3 1 9
、
0
.
9 1 0 9
,
P 均 < 0 . 0 1 ) ; N e u 一「C a Z+ ] i
水平与 T N F 、 N O 含量 的变化也呈显著正相
关 ( r = 0 . 6 9 8 6 、 0 . 6 6 4 0 , P 均 < 0 . 0 1 ) 。
3 讨论
白细胞游出和蛋 白渗出是炎症的两大显
著特征 。 本实验观察到 P n S 在使用剂量范围
内能明显 降低 ` c a : 致 炎大 鼠气囊灌 洗液 中
N e u 数量 , 降低灌洗液 中蛋白含量 , 表明 P n S
具有抑制 C a r 诱导 的大 鼠气 囊滑膜 炎的作
用 。 这与其它学者报道 P n S 能显著抑制大鼠
5
一
H T 足肿胀 、 巴豆油 致耳 肿胀 的结 果川相
似 。 说明 P n S 的确具有 良好的抗炎活性 。
实验结果显示 , C a r 致 炎后大 鼠气囊灌
洗液中 T N F 水平 明显增 加 , 这 与其 它学者
报道人类系统性炎症反应综合症 、 类风湿性
关节炎时均伴有 T N F 含量增加的结果阁相
一致 。 P n S 在所用剂量范围内能明显 降低大
鼠气囊灌洗液中 T N F 含 量 , 且呈 剂量依 赖
关系 。 相关分析结果显示 , P n S 抑制灌洗 液
T N F 含量升高与其抑制灌洗液 中蛋 白渗 出
呈显著正相关 (尸 < 0 . 0 1 ) 。 表明抑制炎性细
胞因子 T N F 生成是 P n S 发挥抗炎作用的重
要机制之一 。
实验还发现 , C a r 致炎 后大 鼠灌洗 液中
N O 含量明显升高 。 这与其它学者报道大鼠
关 节炎时 N O 含量 明显升高 的结果川 相吻
合 ,提示降低 N O 可能具有抗炎活性 。 但 目前
对 P n S 是否影 响炎症时 N O 的含量 尚未见
文献报道 , 本实验首次观察到 P n S 能一定程
度地阻止 C a r 致炎大鼠灌洗液中 N O 含量的
升高 。 相关分析结果显示 , P n S 抑制 N O 含量
的升高与其抑制蛋 白渗出呈显著正相关 (r -
0
.
9 1 0 1
,
P < 0
.
0 1 ) ; 表 明 P n S 抑制 N O 合成
可能是其发挥抗炎作用的又一重要机制 。
实 验 进一 步 观察 到 , C a r 致 炎后 N eu -
「C a , + 〕: 水平 明显升高 , P n S 3 个剂量组呈剂
量依赖 性地阻止 N eu 一 [ C a Z+ 」: 水平的升高 ,
D e x 无 影 响 。 相关 分 析 结 果 显示 , P n S 对
N e u
一「C a ’ + 〕: 水平的影响与其对 T N F 及 N O
含 量的影响成显著正相关 (尸 均 < 0 . 0 1 ) , 表
明 P n S 抗 炎 机 制 与 D e x 不 同 , 抑 制 N eu -
[ C
a Z+ 〕; 水平的升高是其抑制炎性细胞 因子
T N F 及 N O 含量升高的重要分子机制之一 。
参 考 文 献
1 张 晓丹 ,等 . 中医药信息 , 19 93 , ( 5) : 28
2 D i n a r e l l o C A
.
J B i
o l R e g u l H o m e o s t A g e n t s
,
1 9 9 7
.
1 1
( 3 )
: 9 1
3 李淑慧 , 等 四 川生理科学杂志 , 1 9 98 , 20 ( l ) : 9
4 范盘生 , 等 . 中国药理学与毒理学杂志 , 19 8 , 2( 4) : 2 57
5 于永利 , 等 . 中国免疫学杂志 , 19 8 7 , 3( 1) : 41
6 R i e h t e r C
, e t a l
.
B i o e h e m B i o p h y s R e s C o m m u n
,
1 9 9 4
,
2 0 5 ( 2 )
:
11 4 3
7 oS d h i A
, e t a l
.
I n t J Im m u n o p h a r am
e o l
,
1 9 94
,
1 6 ( 12 )
:
1 0 0 3
8 M ik a m i T
,
et a l
.
E u r J P h
a r n l a e o l
,
1 98 3
,
9 5 ( l )
:
l
9 L o w r y O H
, e t a l
.
J B i
o 1 C h e m
,
1 95 1
,
19 3 ( l )
:
2 6 5
1 0 M e a g e r A
,
et a l
.
J Im m
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,
1 9 8 9
, 1 1 6 ( l )
:
l
1 1 罗向东 ,等 . 中华创伤杂志 , 1 9 9 4 , 1 0 ( 4 ) : 1 8 5
2] 关永源 ,等 . 中国药理学通报 , 19 90 , 6 (5 ) : 96
,
1 3 M o u r e l l e M
, e l a l
.
Am J P h y
s i o l
,
1 99 6
,
2 7 0 ( 3 P t l )
:
G 4 2 5
( 1 9 9 8
一
1 2
一
3 0 收稿 )
5 1 6
Ef f e e t s o f T o t a l S a p o n i n s o f s a n e h i (aP
n a x 夕s e u d o 一 g i n s e n g v a r · n o t o g i n s e n g )
o n T N F
,
N O a n d I t s M e c h a n i s m s
L i X i
a o
h
u i a n d L i S h
u h u i ( D e p a r t m e n t o f P h a r m a e o l o g y
, th e T h i r d M il i t
a r y M
e
d i
e a l U n iv e r s i t y
,
C h
o n g q in g 4 0 0 0 3 8 )
A b s t r a e t R
a t a ir
一
p o u e h
a e u t e im f l a m m a t o r y m o d e l w a s p r e p a r e d b y s e in j
e e t i o n o f e a r r a g e e n a n (C a r
,
2 5 m g /k g )
·
T h e n e u t r o p h il (N e u ) e o u n t a , i d p r o t e in e o n t e n t in e x u d a t e w e r e m e a s u r e d b y t e s t t u b e d il u t i n g
m e t h o d a n d L o w r y m e t h o d
.
E n
z y m e l in k e d im m u n o s o r b e n t a s s a y a n d R iv a n o l a s s a y w e r e a P P l ie d r e s P e e t iv e ly
t o i n v e s t i g a t e e f f e e t s o f s a p o n in s o f P a n a ￡ P s e u d o 一 g i n s e n g v a r · n o t o g i n s e n g ( B u r k · ) H o o e t T s e n g ( P n S ) o n
t u m o r n e e r o s is f a e t o r ( T N F ) a n d n it r i e o x id e (N O ) e o n t e n t i n t h e p e r f u s a t e
.
F u r a
一
2 f l u o r e s e e n e e t e e h n iq u e
w a s u s e d t
o
d
e t e r m in e t h e in t r a e e ll u la r f r e e e a l e iu m 。 o n e e n t r a t io n i n N e u t r o p h il s (N e u 一〔C a Z+ ] ` ) , T h e r e s u l t s
s
h
o w e d t h a t P n S 6 0
,
1 2 0
a n d 24 0 m g /k g i p
r e d u e e d N e u e o u n t s
,
p r o t e i n
e o n t e n t , T N F
a n
d N O e o n t e n t s i n a
d
o s e 一
d
e p e n d
e n t m a n n e r ; l o w e r e d t h e l e v e l o f N e u
一
[ C
a Z+ 〕, w it h in h ib i t o r y r a t e s o f 9 . 2% , 3 4 . 3% , a n d
3 9
.
2%
, r e s P e e t i v e ly
.
I t w a s e o n e l u d e d t h a t P n S h a s a n o b v i o u s a n t i in f l a m m a t o r y e f fe e t a n d i t s m e e h a n i s m s
o
f
a e t i o n a r e r e l a t e d t o t h e r e d u e t o n o f T N F a n d N O c o n t e n t s
, a n d i n h ib i t io n o f N e u
一〔C a Z+ 〕; le v e l .
K e y wo
r d s s a p o n i n s o f P a 九 a x P s e u d o 一 g i n s e n g v a r
.
n o t o g i n s e n g ( B u r k
.
) H o o e t T s e n g T N F N O
f r e e e a le i u m a n t i
一
i n f la m m a t io n N e u
一
[ C
a Z+ 〕i
罗布麻叶浸膏对脑内单胺类递质含量
及细胞膜流动性的影响△
苏州医学院药理学教研室 ( 2 1 5 0 0 7) 潘建新 介 顾振纶 钱曾年 秦正红 许美凤 石 琳
摘 要 罗 布麻叶浸膏可使脑内 5一H T 及 D A 含量升高 ,其水溶性成分可使 5 一H T 、 5 一H I A A 及 D A
含量 升高 , 而 N E 含量降低 ,醇溶性成分上述作用更为明显 。 提示 罗布麻叶浸膏可能含有兴奋中枢
5
一
H T 神经元功能及抑制中枢肾上腺素神经元功能的化学物质 , 这些化学 物质为水溶性及醇溶性 。
脑神经细胞膜脂质流动性 测定结果提示罗布麻 叶浸膏水溶性部分 可使膜流动性增加 。
关健词 罗布麻叶浸膏 单胺类递质 脑神 经细胞膜流动性
罗布麻为夹竹桃科植物 AP o叹y n u m ve ne -
ut m L
. , 广泛 野生于盐 碱沙荒地 区 , 其根有
强心利尿作用 ; 叶具有降血压 , 治哮喘 lj[ 及加
强免疫功能等作用 。 以往我们研究还发现罗
布麻叶浸膏有一定程度 的镇静 ,镇痛作用 。为
此我们进一步测定 了罗布麻叶浸膏 、 水溶性 、
醇溶性或脂溶性部分对脑 内单胺类递质含量
以及对神经细胞膜脂质流动性的影响 , 以探
索其 中枢作用机制及其有效成分所在部位 。
l 实验材料
1
.
1 动物 : 昆明种小 鼠 , 雌雄 兼有 , 体重 18
一 2 2 9 ; W i s t a r 大 鼠 , 雌雄 兼有 , 体 重 1 5 0 ~
2 0 0 9
,均 由苏州医学院实验动物中心提供 。
1
.
2 药物 : 罗布麻叶浸 膏 , 由江苏省东台县
罗布麻厂提供 , 为棕色干浸膏 ,每克相当原生
药 7 . 7 9 , 临 用时用 0 . 5%淡 甲基纤 维素钠
A d d r e
潘建新
S 8
:
P a n J i a n x i男 , 4 4 岁 ,主
沌 p a r t me n t o f p l l a r m a c o lo g y
,
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师 , 1 9 7 8 年毕业于苏州医学 院附一 院卫校药剂专业 , 19 8 9 年毕业于苏州医字皖夜大宇医 宇基础专
业 , 获大专学历 。 主要从事心血管 、 神经药理及新药临床前药理 、药效 、 毒理等研究工作 ,共发表论文 5 篇 。
△江苏省医药总公司资助项目
《中草药 》 19 99 年第 3 0 卷第 7 期 . 5 1 7 .