全 文 ：没食子酸抑制白念珠菌生物膜作用的研究
汪长中，程惠娟，官　妍，王　艳，云　云
（安徽中医学院 中西医结合临床学院，安徽 合肥 ２３００３８）
［摘要］　目的：研究没食子酸对体外白念珠菌生物膜的影响。方法：采用ＸＴＴ减低法评价没食子酸对白念珠菌的生物膜
及黏附性的影响；镜下观察没食子酸对白念珠菌生物膜的形态学影响；细胞毒试验检测该药的毒副作用。结果：没食子酸抑
制白念珠菌生物膜最低药物浓度ＳＭＩＣ５０，ＳＭＩＣ８０分别是５００，１０００ｍｇ·Ｌ
－１；１００，１０００ｍｇ·Ｌ－１的没食子酸对白念珠菌的早期
黏附及菌丝生长有抑制作用；没食子酸对人细胞毒性较弱。结论：没食子酸对体外白念珠菌生物膜有较强的抑制作用。
［关键词］　白念珠菌；生物膜；没食子酸
［收稿日期］　２００８０９１０
［基金项目］　安徽省高校自然科学研究项目（ＫＪ２００８Ｂ２２３）；安徽省
自然科学基金项目（０７０２１００３）
［通信作者］　汪长中，副教授，在读博士生，主要从事细菌生物膜
研究。Ｔｅｌ：１３９５６０９６００７，Ｅｍａｉｌ：ａｈｗｃｚ６３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
　　近年来，随着广谱抗生素、免疫抑制剂的广泛应
用，导管插管、腹膜透析、器官移植、肿瘤放化疗等的
大量开展，以及艾滋病人的出现，免疫功能抑制人群
不断增多，以念珠菌尤其是白念珠菌为主的真菌感
染发生率呈逐年上升趋势。但目前临床上常用的抗
真菌药物很少有令人满意的疗效，其主要原因之一
在于白念珠菌容易形成生物膜（ｂｉｏｆｉｌｍ）。生物膜形
成后，膜内的菌细胞能够逃逸抗生素的杀伤作用和
机体免疫系统的清除，并成为潜在的感染源，从而造
成感染的反复发作。鉴于现有的抗真菌药物或毒副
作用大、或抗菌谱窄、或易产生耐药性，因此迫切需
要新型有效药物，而从我国丰富的中药资源中发掘
出具有抗真菌生物被膜的中药不失为一项重要的举
措。本课题组近期研究发现，部分中药及有效成分
具有较强抗白念珠菌生物膜的功效。本试验即探讨
中药有效成分没食子酸对体外白念珠菌生物膜的作
用，以期为中药治疗由白念珠菌生物膜引起的难治
性、复发性真菌感染提供新的治疗途径。
１　材料
１．１　菌株　白念珠菌标准株 ＡＴＣＣ１０２３１购于合肥
市疾病控制中心。
１．２　药物　没食子酸对照品购于安徽芜湖甙尔塔
医药科技有限公司［批号２００７０５２５，纯度 ＞９８５％
（ＨＰＬＣ级）］，两性霉素 Ｂ对照品购于美国 Ａｍｒｅｓｃｏ
公司（批号ＢＭ１０４４１，纯度
%
９９％）。
１．３　培养基　ＲＰＭＩ１６４０培养基（ＧＩＢＣＯ公司），
ＹＰＧ培养基、沙氏培养基依据文献［３］配制。
１．４　试剂　ＸＴＴ［２，３ｂｉｓ（２ｍｅｔｈｏｘｙ４ｎｉｔｒｏ５ｓｕｌｆｏ
ｐｈｅｎｙｌ）２Ｈｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ５ｃａｒｂｏｘａｎｉｌｉｄｅ］（加拿大 ＢＢＩ
公司），维生素 Ｋ３（美国 Ａｌｅｘｉｓ公司），ＴｒｉｔｏｎＸ１００
（美国Ａｍｒｅｓｃｏ公司），丙酮（蚌埠化学试剂厂），均
为分析纯。
１．５　仪器　３１８酶标仪（上海三科仪器有限公司），
９６孔微量培养板（美国Ｃｏｒｎｉｎｇ公司），ＣＫＸ４１３２型
倒置显微镜（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司）。
２　方法
２．１　白念珠菌生物膜的制备［３４］　将白念珠菌接种
于ＹＰＧ培养基中，３５℃摇床过夜培养，收集菌体，用
ＲＰＭＩ１６４０培养基稀释，调整菌液细胞密度为１×１０６
个／ｍＬ。将１００μＬ菌悬液接种于９６孔微量培养板
中，３７℃培养２４ｈ，使白念珠菌完全黏附于平底的９６
孔板基底表面，形成白念珠菌生物膜的结构。倒置显
微镜下初步鉴定白念珠菌生物膜的形成。
２．２　没食子酸抑制白念珠菌生物膜最低药物浓度
（ｓｅｓｓｉｌｅｍｉｎｉｍａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＳＭＩＣ）的测
定［３４］生物膜形成后，弃去培养基及悬浮菌，用ＰＢＳ洗
３次，将药物按２倍稀释加到各孔中，继续培养４８ｈ。
用ＸＴＴ减低法检测抑制生物膜５０％（ＳＭＩＣ５０）及８０％
（ＳＭＩＣ８０）的药物浓度：ＸＴＴ用０５ｇ·Ｌ
－１林格液稀释
及０２２μｍ孔径的滤器过滤除菌，分装后存放
－７０℃冰箱备用。临用前，加入维生素 Ｋ３（ｍｅｎａｄｉ
ｏｎｅ，用丙酮稀释至终浓度１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１）。取ＸＴＴ
ｍｅｎａｄｉｏｎｅ溶液１００μＬ加到已形成生物膜的培养孔
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中（ｍｅｎａｄｉｏｎｅ在ＸＴＴ中的终浓度为１μｍｏｌ·Ｌ－１）。
继续３７℃避光培养２ｈ。在酶标仪波长４９０ｎｍ处检
测各孔吸光度（Ａ）。另设对照孔（只加菌液与ＸＴＴ溶
液，不含药物）。
２．３　没食子酸抗白念珠菌黏附作用的测定［５６］　将
１００μＬ的菌液（１×１０６个细胞／ｍＬ）接种于９６孔板中
３７℃培养，分别培养１，２，４ｈ。吸弃培养基，ＰＢＳ洗去
未黏附菌，加入按１０倍连续稀释（１０００，１００，１０，０ｍｇ
·Ｌ－１）的没食子酸。ＸＴＴ减低法检测４９０ｎｍＡ。
２．４　没食子酸对白念珠菌生物膜作用的形态学观
察　将１００μＬ的菌液（１×１０６个细胞／ｍＬ）接种于
９６孔板中，分别加入１０００，１００，１０，０ｍｇ·Ｌ－１的没
食子酸，３７℃培养２４ｈ。倒置显微镜下观察生物膜
形态的变化。
２．５　细胞毒性实验［５７］　取健康成人的肝素抗凝
血，２０℃离心２０００ｒ·ｍｉｎ－１×１０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗３遍，
配成１０％的细胞／ＰＢＳ悬液，再用 ＰＢＳ将该悬液１∶
１０稀释，取１００μＬ置于ＥＰ管中，加入１００μＬ的经
二倍连续稀释的没食子酸或阳性对照两性霉素 Ｂ。
完全溶血则以１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００处理红细胞来获得。
ＥＰ管于３７℃孵育１ｈ，２０℃离心２０００ｒ·ｍｉｎ－１×
１０ｍｉｎ，取１５０μＬ上清转移至平底９６孔板中，用酶
标仪在４５０ｎｍ波长处测Ａ。溶血百分率＝（没食子
酸或两性霉素Ｂ孔Ａ４５０－缓冲液孔Ａ４５０）／（ＴｒｉｔｏｎＸ
１００孔Ａ４５０－缓冲液孔Ａ４５０）×１００％。
２．６　统计学方法　实验结果采用 ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ
４０３统计软件ｓｔｕｄｅｎｔ＇ｓ检验。实验重复３次，每个
药物浓度均设８个复孔，取平均值。数据均以 珋ｘ±ｓ
表示，Ｐ＜００５为有显著性差异。
３　结果
３．１　白念珠菌生物膜的初步鉴定　倒置显微镜下
白念珠菌细胞与其出芽延伸所形成的菌丝密集交
织，并可沿着菌丝形成团块状聚集，呈现多层膜状结
构（图１）。
３．２　没食子酸对白念珠菌生物膜的ＳＭＩＣ　随着没
食子酸浓度递增，其对白念珠菌生物膜的抑制作用
呈增强趋势，ＳＭＩＣ５０，ＳＭＩＣ８０分别是５００，１０００ｍｇ·
Ｌ－１。两性霉素 Ｂ的 ＳＭＩＣ５０和 ＳＭＩＣ８０分别是０４９，
１９５ｍｇ·Ｌ－１。
３．３　没食子酸对白念珠菌黏附功能的影响　与未
加药对照孔相比，１０００ｍｇ·Ｌ－１的没食子酸对１，２，
　　
图１　白念珠菌生物膜（×２００）
４ｈ内的白念珠菌细胞黏附均有抑制作用，１００ｍｇ·
Ｌ－１的没食子酸对１，２ｈ的黏附有抑制作用。１０ｍｇ
·Ｌ－１的没食子酸对黏附则无抑制作用（表１）。
表１　不同剂量没食子酸对白念珠菌细胞黏附影响（Ａ）
比较（珋ｘ±ｓ，ｎ＝８）
组别
剂量
／ｍｇ·Ｌ－１
培养时间
１ｈ ２ｈ ４ｈ
对照　　 － ０６２±０１１ ０６２±０１３ ０６４±０１２
没食子酸 １０ ０４５±０１０ ０４９±０１２ ０６０±０１４
　 １００ ０３７±０１１１） ０３９±０１３１） ０５４±０１２
　 １０００ ０１２±００１２） ０１４±００２２） ０２０±００４２）
　　注：与空白对照比较１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１。
３．４　没食子酸对白念珠菌生物膜形态学的影响　
在１０００ｍｇ·Ｌ－１的没食子酸作用下，只出现少数的
酵母细胞，无明显菌丝出现；在１００ｍｇ·Ｌ－１没食子
酸作用下，可见较多的酵母细胞并始见菌丝出现，剂
量降至１０ｍｇ·Ｌ－１时，可见由更多酵母细胞与菌丝
组成的较密集的生物膜（图２）。
３．５　细胞毒试验　两性霉素Ｂ在质量浓度１２５ｍｇ
·Ｌ－１时发生 １００％溶血，没食子酸在 １０００ｍｇ·
Ｌ－１时只引起３３％的溶血。
４　讨论
没食子酸是存在于山茱萸等多种中药里的一种
有机酸。体外实验表明，没食子酸对多种致病菌如
金黄色葡萄球菌、奈色氏球菌、铜绿假单胞菌及部分
真菌有抑制作用［８］，但其对细菌生物膜尤其是白念
珠菌生物膜的影响，尚未见报道。白念珠菌容易黏
附在生物组织和非生物物体表面形成一种不同于悬
浮菌的细胞群体结构———生物膜。生物膜的形成可
明显降低其对抗菌药物的敏感性甚至产生耐药，且
也是构成难治性真菌感染的病灶中的感染源［９］。
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Ａ．对照；Ｂ．１０ｍｇ·Ｌ－１没食子酸；
Ｃ．１００ｍｇ·Ｌ－１没食子酸；Ｄ．１０００ｍｇ·Ｌ－１没食子酸。
图２　不同浓度没食子酸对白念珠菌生物膜
形态的影响（×２００）
本试验在前期研究的基础上采用定量检测白念
珠菌生物膜的最常用方法即 ＸＴＴ减低法进一步探
讨没食子酸对体外抗白念珠菌生物膜的影响，该方
法在不破坏生物膜的条件下能检测出生物膜中菌细
胞的活性。近期 Ｈｅ等证实，白念珠菌标准株
ＡＴＣＣ１０２３１具有较强的形成生物膜功能［５］。本试
验所用即为此标准菌株。结果显示，没食子酸对白
念珠菌生物膜ＳＭＩＣ５０与ＳＭＩＣ８０分别为５００，１０００ｍｇ
·Ｌ－１，显示出良好的抗生物膜功能。
研究已证实，生物膜的发育循环要经过黏附、微
菌落形成、微菌落融合、生物膜成熟、菌细胞从生物
膜中释放出来等 ５个阶段［９］。初始的黏附尤为重
要，随着培养时间的延长，生物膜逐渐发育成熟。本
实验发现，１００，１０００ｍｇ·Ｌ－１的没食子酸对白念珠
菌的早期黏附有明显的抑制功能，提示其对白念珠
菌生物膜的发育有明显的干预作用。
白念珠菌是具有酵母菌丝二相性的真核微生
物，菌丝的出现对其致病性与生物膜的形成均至关
重要［１０］。本实验从形态学上进一步验证没食子酸
对白念珠菌生物膜的影响。在没食子酸质量浓度为
１０ｍｇ·Ｌ－１时，可见由大量酵母细胞与菌丝组成的
较密集的生物膜。在１００ｍｇ·Ｌ－１时，仍可见较多
数量的酵母细胞及少数菌丝。在１０００ｍｇ·Ｌ－１的
没食子酸作用下，只出现少数的酵母细胞，无菌丝出
　　
现。提示一定浓度的没食子酸能通过影响白念珠菌
的菌丝形成进而抑制其生物膜的形成及其致病性。
因人红细胞容易获得，其膜的生物学特征为人
们所熟知，血红素释放容易检测，故溶血试验常作为
检测抗真菌药物细胞毒性的一个指标［５，７］。本实验
发现，两性霉素Ｂ在质量浓度１２５ｍｇ·Ｌ－１时便发
生溶血，而没食子酸在 １０００ｍｇ·Ｌ－１时只引起
３３％的溶血。可见，较之于最常用的抗真菌药物之
一的两性霉素Ｂ，没食子酸具有较弱的细胞毒性。
近期，Ｈｅ等发现中药有效成分丁香酚具有体外
抗白念珠菌生物膜功能［５］。本实验证实没食子酸
也有类似的作用，因而提示中药某些有效成分不仅
毒性较低，且具有抗白念珠菌生物膜功能。因此，没
食子酸等中药有效成分对治疗白念珠菌生物膜相关
感染性疾病具有潜在临床治疗价值。
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ＩｎｖｉｔｒｏａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｇａｌｉｃａｃｉｄａｇａｉｎｓｔＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓｂｉｏｆｉｌｍｓ
ＷＡＮＧＣｈａｎｇｚｈｏｎｇ，ＣＨＥＮＧＨｕｉｊｕａｎ，ＧＵＡＮＹａｎ，ＷＡＮＧＹａｎ，ＹＵＮＹｕｎ
（ＳｃｈｏｏｌｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌａｎｄＷｅｓｔｅｒｎＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＡｎｈｕｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｆｅｉ２３００３８，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｇａｌｉｃａｃｉｄａｇａｉｎｓｔＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓｂｉｏｆｉｌｍｓｉｎｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＸＴＴｒｅｄｕｃ
ｔｉｏｎａｓｓａｙｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｅｆｅｃｔｏｆｇａｌｉｃａｃｉｄｏｎＣ．ａｌｂｉｃａｎｓｂｉｏｆｉｌｍｓａｎｄｉｔｓａｄｈｅｒｅｎｃｅ，ａｎｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ
ｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｔｏａｓｓｅｓｓｔｈｅｅｆｅｃｔｏｆｇａｌｉｃａｃｉｄｏｎｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆＣ．ａｌｂｉｃａｎｓｂｉｏｆｉｌｍｓ；ａｎｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃａｓｓａｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｍｅａｓｕｒｅｔｈｅ
ａｄｖｅｒｓｅｅｆｅｃｔｓｏｆｇａｌｉｃａｃｉｄ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＳＭＩＣ５０，ＳＭＩＣ８０ｏｆｇａｌｉｃａｃｉｄａｇａｉｎｓｔＣ．ａｌｂｉｃａｎｓｂｉｏｆｉｌｍｓｗｅｒｅ５００，１０００ｍｇ·Ｌ
－１，ｒｅｓｐｅｃ
ｔｉｖｅｌｙ；１００ｍｇ·Ｌ－１ａｎｄ１０００ｍｇ·Ｌ－１ｏｆｇａｌｉｃａｃｉｄｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｉｎｉｔｉａｌａｄｈｅｒｅｎｃｅａｎｄｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｇｒｏｗｔｈ，ａｎｄｔｈｅａｇｅｎｔ
ｓｈｏｗｅｄｐｏｏｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ｇａｌｉｃａｃｉｄｄｉｓｐｌａｙｅｄｐｏｔｅｎｔａｃｔｉｖｉｔｙａｇａｉｎｓｔＣ．ａｌｂｉｃａｎｓｂｉｏｆｉｌｍ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ；ｂｉｏｆｉｌｍ；ｇａｌｉｃａｃｉｄ
［责任编辑　古云侠］
全国中医痛证论坛征文通知
中华中医药学会主办的“全国中医痛证论坛”将于２００９年８月在广西桂林召开，会议将邀请中西医有
关方面的权威专家学者作专题报告。现将有关征文事宜通知如下：
一、征文内容：（１）针对头面痛、颈肩痛、腰背痛、四肢骨关节痛、软组织痛、妇科痛证、癌症痛等各种疼痛
的临床研究；（２）治疗手段的研究，如微创介入治疗、麻醉镇痛、中药镇痛、针灸推拿镇痛、针刀镇痛、气功镇
痛；（３）痛证的基础研究；（４）其他与痛证有关的研究。
二、征文要求：（１）未正式公开发表过的论文。（２）论文力求主题鲜明、论据充分、资料详实。（３）稿件篇
幅在４０００字以内，关键词３－８个，注明作者姓名、职称、单位、具体通讯地址、邮政编码、电子信箱等。（４）
论文请寄打印稿并网络发送电子版，请在信封上注明“痛证论坛征文”，邮件以“作者姓名 ＋痛证论坛征文”
命名。请用ｗｏｒｄ文档以附件的形式发送，收到必复，若无回复，请与编辑部联系。（５）每篇论文共收审稿费、
版面费３８０元，稿件请自留底稿，恕不退稿。投稿时请同时寄出审稿费及版面费，截止日期：２００９年５月３０
日。
三、其他事宜：稿件经审稿录用后将在国家级中文核心期刊《中华中医药杂志》（原《中国医药学报》）
２００９年增刊上刊出。参加大会学术交流者，由中华中医药学会颁发论文证书和国家Ⅰ类继续教育学分。
四、联系方式：北京市朝阳区和平街北口樱花路甲４号《中华中医药杂志》社（收）；邮编：１０００２９；电话：
０１０－６４２１６６５０；Ｅ－ｍａｉｌ：６４２１６６５０＠１６３．ｃｏｍ。
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