全 文 ：黄连解毒汤半仿生提取法提取药材
组合方式的优选
窦锦明! 孙秀梅!! 张兆旺! 于定荣! 李超
山东中医药大学! 山东 济南 +$$&#
摘要#!目的$优选黄连解毒汤药效物质提取时方药最佳组合方式) 方法$将方药排列组合成 组$用半仿生提取法提
取+以小檗碱%黄芩素%栀子苷%总生物碱%总黄酮%EFG<总面积%
$
$$$ 提取物为指标$将各指标测得值进行标准化处理$并
经加权求和后得综合评价3值$3值大者为优) 结果$% 个指标综合评价 3值以 4XkR<最大) 结论$黄连解毒汤的提取$以
黄连和栀子%黄芩和黄柏分别合提$再将提取液合并为最佳)
关键词#!黄连解毒汤+半仿生提取法+方药组合方式
稿件编号#!+$$*+$)$)
基金项目#!国家科技部国际合作项目!+$$%XQ4)($
通信作者#!!孙秀梅$教授$博士生导师$主要从事中药新药研究
与中药炮制原理研究$PMS#!$) (+#+($($ I50BNS#UL27NL0MN(3
#)d./0
!!中药复方用半仿生提取法研究$方药组合方
式的优选是该技术平台的重要步骤 .5)/ ) 本实验
以黄连解毒汤为例$探讨复方药效物质提取方药
较佳组合方式) 黄连解毒汤由黄连%黄芩%黄柏%
栀子组成$先将方药分成,君臣佐使- & 部分$再
排列组合成 组#以有效成分%有效部位%
$
$$$提取物为指标$综合评判$优选该方药提取
时药材较佳组合方式)
!材料
精密 AE计!AE85)<型$上海雷磁仪器厂+电
子分析天平!94$ 型$上海第二分析仪器厂+高
效液相色谱仪!$$ 系列美国 4DNGM2@公司+紫外
分析仪!_[)$$ 型$日立公司+医用超声波清洗器
!c^ 5+$I型$昆山市超声仪器有限公司+XE5系列
中空纤维超滤膜!上海德宏生物医学科学科技发展
有限公司)
中药经山东中医药大学张兆旺教授鉴定黄连为
毛茛科植物黄连1%;,-?A>-)9)?-?QCB2.? 的干燥根茎+
黄芩为唇形科植物黄芩 GA*,9&7/-7 :7-A7&9)?-?OM/CDN
的干燥根+关黄柏为芸香科植物黄檗 $>9&%<9)7+*/9)?9>LAC的干燥树皮+栀子为茜草科植物栀子
L7/<9)-7 H7?+-)%-<9?ISNU的干燥成熟果实)
盐酸小檗碱!批号 *5+$$#$&%黄芩素!批
号 $%5+$$(%栀子苷!批号 $%&*5+$$#)
均购自中国药品生物制品检定所+甲醇%乙腈均为色
谱纯$水为超纯水$其余试剂均为分析纯)
(!方法与结果
(_!方药组合方式
将黄连解毒汤分成 & 部分#4 !黄连$R!黄
芩$!4R
离心%超滤%浓缩后$合并 ) 种浓缩液$定容) 其余类
推)
(_(!样品液的制备
按处方比例称4$R$<$X粗粉!$ g+$ 目$按
(_ 项下组合方式$分别用 8RI法煎提 ) 次!加水量
依次为药材重 $$($( 倍$) 煎 AE依次为 #d$$%d$
(d$提取时间依次为 +$$#$$)$ 0N2) 分别将 ) 煎
提取液依次粗滤$离心!) $$ C*0N2f$+ 0N2 $
一定规格的中空纤维膜滤过$浓缩$合并$定容至
+$ 0G$即得方药不同组合的 $$$) 提取物的样品
液 g 号!质量浓度为 +d$ i$+ D*Gf)
按上述方法$分别制备方药缺黄连%黄柏+方药
缺黄芩+方药缺栀子的阴性样品液)
(_&!供试液的制备
*#+*
第 ) 卷第 $ 期
+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[/Sd)$ :UULM!$
9B6$ +$$
精密吸取 (_( 项下样品液 g 各 $d$ 0G$
加硅藻土 $d( D$蒸干$研匀$精密加甲醇 + 0G$称
重$超声 )$ 0N2$放冷$补足失重$滤除硅藻土$得滤
液甲)
精密吸取滤液甲各 $d$ 0G$蒸干$残渣用甲醇
溶解并定容至 0G$得供试液4
g4
!质量浓度为
d# i$
+
D*G
f
$供小檗碱含量测定及EFG<总面
积测定)
精密吸取滤液甲各 d$ 0G$另器保存$得供试
液R
gR
!质量浓度为 (d$ i$ D*Gf$供总生
物碱含量测定)
精密吸取滤液甲各 d$ 0G$用甲醇定容至 $
0G$得供试液 <
g<
!质量浓度为 &d$ i$ D*
G
f
$供栀子苷含量测定)
精密吸取 (_( 项下样品液 g 号各 $d$
0G$拌聚酰胺 $d D$加入已处理的聚酰胺柱上) 分
别依次以蒸馏水 )$$ 0G$+$e乙醇 $$ 0G$%$e乙
醇 ($ 0G洗脱至无色$收集洗脱液$浓缩$再用 %$e
乙醇定容至 $ 0G$得溶液乙)
精密吸取溶液乙各 +d$ 0G$蒸干$残渣用甲醇
溶解$定容至 $ 0G$得供试液X
gX
!质量浓度为
d$ i$
+
D*G
f
$供黄芩素含量测定)
精密吸取溶液乙各 $d) 0G$用 %$e乙醇定容
至 $ 0G$得供试液 I
gI
!质量浓度为 d& D*
G
f
$供总黄酮含量测定)
按上述方法$分别制备方药缺黄连%黄柏+方药
缺黄芩+方药缺栀子的阴性供试品)
(_Q!对照品溶液的制备
精密称取盐酸小檗碱对照品 *d(($d$ 0D$分
别依次用甲醇和 AE%d$ 的缓冲溶液配制$得对照液
*
!$d)* D*G
f
和对照液
+
!$d$ D*G
f
)
精密称取黄芩素对照品 %d)($)d#( 0D$分别依
次用甲醇和 %$e乙醇配制成对照液
#
!$d+* D*
G
f
和对照液
$
!$d&% D*G
f
)
精密称取栀子苷对照品 %d)) 0D$用甲醇配制
成对照液
,
!$d+*) D*G
f
)
(_$!含量测定
(_$_!盐酸小檗碱含量测定!XNB0/2UNG<
(
色谱
柱!&d# 00i+$ 00$
0+流动相乙腈5$d$ 0/G
*G
f
cE
+
FH
&
!)$o%$+波长 +# 20+流速 d$ 0G
*0N2
f
+进样量 +$
G+柱温 )$ h.&/ $见图 )
4d对照品+Rd样品+
图 !盐酸小檗碱对照品及样品EFG<图
标准曲线绘制#精密吸取 (_Q 项下对照液
!
$按
上述色谱条件$进样 +$&$#$($$
G) 以峰面积为
纵坐标$盐酸小檗碱的含量!
D为横坐标$得回归
方程3j ##+d*4k+%d&&$/j$d*** #!) j$线
性范围 $d%* g)d*
D)
含量测定#精取 (_& 项下供试液 4
g4
$各进
样 +$
G$按上述色谱条件$依法测定计算盐酸小檗
碱的含量$结果见表 )
(_$_(!总生物碱含量测定!标准曲线绘制 精密吸
取 (_Q 项下对照液
#
$d&$$d#$$d($d$$d+ 0G$用
AE%d$ 的缓冲液稀释至 +d$ 0G) 加入 $d$$%e溴
麝香草酚蓝 (d$ 0G$摇匀$加入氯仿 $d$ 0G$振摇$
静置分层 + 0N2) 分取氯仿层$用干燥滤纸滤过$相
应试剂为空白$在 &) 20测定$以浓度为横坐标$吸
收度为纵坐标$回归方程3j*d($+4f$d$$* &$/j
$d*** !)j$线性范围 &d$& g+d+ 0D*
G
f ./
)
精密吸取 (_& 项下供试液R
gR
各 $d 0G$
按上述方法$依次加入氯仿 $d$$$d$$d$ 0G萃
取$依法测定$总生物碱含量以盐酸小檗碱计算$结
果见表 )
(_$_&!黄芩素含量测定!XNB0/2UNG<
(
色谱柱
!&d# 00i+$ 00$
0+流动相甲醇5$d&e醋酸
水!%$o)$+检测波长 +% 20+流速 d$ 0G*0N2f+
进样量 +$
G+柱温 )$ h.#/ $见图 +)
4d对照品+Rd样品+
*%+*
第 ) 卷第 $ 期
+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
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9B6$ +$$
!!标准曲线的绘制#精密吸取 (_Q 项下对照液
$
$+$)$&$
G$按上述色谱条件测定) 以峰面积为
纵坐标$黄芩素的含量 !
D为横坐标$回归方程
3j& +*d&4f+&d$*$/j$d*** ! ) j$线性范
围 $d+* gd&%
D)
含量测定#精密吸取 (_& 项下供试液 X
gX
$
各进样 +$
G$按上述色谱条件$依法测定计算黄芩
素的含量$结果见表 )
(_$_Q!总黄酮含量测定!标准曲线的绘制!精密
吸取 (_Q 项下对照液
%
$d$$d+$$d)$$d&$$d 0G$
用 %$e乙醇稀释至 $ 0G) 以 %$e乙醇为空白$在
+%( 20处测定$浓度为横坐标$吸收度为纵坐标$回
归方程 3j$d++4k$d$+& &$/j$d*** &!) j$
线性范围 d&% g%d) 0D*Gf).%/
精密吸取 (_& 项下供试液 I
g
$按上述方法$
依法测定$以黄芩素计算总黄酮$见表 )
(_$_$!栀子苷含量测定!XNB0/2UNG<
(
色谱柱
!&d# 00i+$ 00$
0+流动相乙腈5水 !o
(+检测波长 +)( 20+流速 d$ 0G*0N2f+进样量
+$
G+柱温 )$ h.(/ $见图 ))
4d对照品+Rd样品+
标准曲线的绘制#精密吸取 (_Q 项下对照液
,
$$$$$+$
G$按上述色谱条件测定) 以峰面积
为纵坐标$栀子苷量 !
D为横坐标$回归方程为
3j d(4f&+d$/j$d*** (!)j$线性范围
$d+*) gd(#
D)
含量测定#精密吸取 (_& 项下供试液 <
g<
号$各进样 +$
G$按上述色谱条件$依法测定计算
栀子苷的含量$结果见表 )
(_$_Y!EFG<总面积测定!XNB0/2UNG<
(
色谱柱
!&d# 00i+$ 00$
0+流动相!4 $d$ 0/G*
G
f
cE
+
FH
&
5!R乙腈+线性梯度洗脱时间程序#$ g
#$ 0N2$e g)eR+检测波长 ++ 20+流速 d$ 0G
*0N2
f
+进样量 $
G+柱温 )$ h)
精密吸取 (_& 项下供试液 4
g4
号$各进样
$
G$按上述色谱条件$依法测定计算总面积$结果
见表 )
(_$_%!提取物测定!
$
$$$!精密吸取 (_( 项下
样品液 g 号$各 $d$ 0G$置干燥至恒重的蒸发
皿中$水浴蒸干$$ h烘至恒重$计算
$
$$$ 提取
物干膏得率$结果见表 )
(_Y!数据处理
以小檗碱%黄芩素%栀子苷%总生物碱%总黄
酮%EFG<总面积%
$
$$$ 提取物为指标$按下列
公式进行标准化处理 MU
-$H
j!M
-$H
f
#
M
H
T?
H
$式中
MU
-$H
是标准化后得值$M
-$H
为样品液 -中成分 H的含
量$
#
M
H
为各种样品液 -中成分 H的平均值$G
H
为成
分 H的标准偏差) 根据各指标在工艺选择中的主
次$给予不同的加权系数$即得综合评价指标 3
值$3j.!小檗碱 k黄芩素k栀子苷 s)/ i k
.!总生物碱k总黄酮kEFG<总面积 s)/ i) k
$
$$$ 提取物 i+) 3值大者为佳) 结果 号
!4XkR<3值最大$见表 )
(_%!药材组合方式的验证性试验
按照 (_Y 项下优选出的最佳组合方式$照
(_ c(_$项下各指标的测定方法%(_% 项下数据处
理方法$依法测定和计算$即得综合评价 3值$见表
+) 结果表明$验证实验提取液的综合评价 3值#
4XkR<为 %d() *$4XkRk<为 %d+** +$4kRk
&!小结与讨论
本实验将黄连解毒汤方药排列组合成 组$以
小檗碱%黄芩素%栀子苷%总生物碱%总黄酮%EFG<
总面积%
$
$$$ XB提取物为综合评判指标$结果以
4XkR<组合的综合评判 3值最大$表明该方药提
取时以黄连和栀子%黄芩和黄柏分别合提$再将 + 种
提取液合并为最佳)
在多指标实验中$通常采用,综合评分法-或
,综合平衡法-进行数据分析) 本实验对各单个指
标数据进行标准化处理$求得数据的相对值$再对标
准化后的数值作加权求和处理$得到一个综合评判
3值) 这样做可以消除各指标之间的单位和量纲的
不同$以及指标变量范围相差悬殊所造成的,拉平
效应-影响$提高了组间综合评判数据的相关性和
可比性$更科学%合理)
*(+*
第 ) 卷第 $ 期
+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
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9B6$ +$$
表 !黄连解毒汤方药 种组合方式各指标成分含量及标准化处理结果
;/d
小檗碱
=0D*D
f
黄芩素
=0D*D
f
栀子苷
=0D*D
f
总生物碱
=0D*D
f
总黄酮
=0D*D
f
EFG<
总面积
$
$$$ 提取物
=0D*D
f
3
$-**$ -+% +&-& &- %-%)% &)&%-#$ * f)-&& (
! f-$$ ) ! f-)) ! f-#+( $ ! f-% # ! f-+** ! f-$%# ! f-&(
+ %-)+) %-% )$-% +*-#$+ (-+$& *#**-$$ +)( #-)$ )
!-$ + !$-$( # !$-$*% + !$-*+& !-+# * !-)% !$-$) &
) +-%#% $-+& +%-)(# +&-#( $-$# &(#)-%% +)) f$-++ &
! f$-&& !-(+ ! f$-%$ ) !$-$&( ( !$-%) # ! f$-*( + ! f$-$%)
& +-))# -#+( ))-&# +-&)) &$-++ &%+##-$% +&% $-)$ &
! f$-*+ + ! f$-$*& !$-*$ !$-++ % !$-+#+ & ! f$-*(& !$-%$ $
#-&+& (-#+ )-#($ +#-#( &(-$&& #(**-$% +&* #-*)( &
!$-%** & !$-%# * !-#%# # !$-&&) # !$-#)( !$-$&+ ( !$-++ (
# *-+$& *-&+ +%-+*& )$-$%( #)-)+ #$*%-+$ +&$ -$* (
!-%& & !$-** # ! f$-%+% % !-$$ + !-)#) ( ! f$-)( ) !$-$% +
% #-%# -($# )-*% )-$& &&-+$( *#*%%-)% +& -#+
!$-*+ ! f$-$&) ( !$-#$* ) !-( & !$-&& !-&$* $ !$-$#( )
( #-+)& *-+# +-%& )+-% )-$(+ #(#&-($ +& +-*#% &
!$-%)& # !-$+ % ! f-($ ( !-))# !$-$ & !$-$& + !$-) +
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!$-(%$ ! f$-$( % ! f$-%& !$-* # !$-&)# $ !-&%) ) ! f$-&#+ #
$ +-& %-(% ))-)% +)-*+ )+-#*& )+$)-)% +$) f$-+)$ &
! f$-( !$-)( ( !-$#+ ) !$-$$% # ! f$-$** ) ! f$-#*( ! f$-#++ %
#-$*( $-#$$ )&-*( +#-##& $-&# #%*-+) +&) %-+)+ (
!$-#(( # !-)% !-&%% & !$-& !$-%& * !$-$$* % !$-$ #
+ $-**+ +-)& )-++ %-)+( -* #(*)+-$$ )* f-((* $
! f-$&* ! f-$) !$-&$% $ ! f-$) ) ! f- ) !$-$( * !-$( &
) $-#* -($) +(-%+ *-&( %-&) &)(*#-$ () f*-(*
! f-+ + ! f-($ ! f$-&% * ! f$-%# ! f-)) ( ! f-&# ) ! f-$$ $
& -&(% +-) +*-$# #-&#* +-$( %&#*$-+% +$+ f#-*+ *
! f$-(( ! f-$(# $ ! f$-+++ ! f-* ( ! f-$*) ) !$-))# ! f$-## %
$-#&# $-#$* +-+( )-#+& -+&) &($$&-+) +$& f-*)
! f-#% ) ! f-* + ! f-)$) ! f-#$ + ! f-&( * ! f$-*&( # ! f$-#++ %
!!注#3j.!小檗碱k黄芩素k栀子苷 s)/ i k.!总生物碱k总黄酮kEFG<总积分面积 p)/ i) k
$
$$$ 提取物 i++括号内为标准
化处理后数值!表 + 同)
表 +!验证性实验各指标成分含量的标准化值及综合评价值
实验组
小檗碱
=0D*D
f
黄芩素
=0D*D
f
栀子苷
=0D*D
f
总生物碱
=0D*D
f
总黄酮
=0D*D
f
EFG<
总面积
$
$$$ 提取物
=0D*D
f
3
4XkR< #-++ $-)+ )&-*&+ +#-%& -#&+ #%*-+) +* %-() *
!$-#* !-+*( !-&& !$-&#) & !$-(+ & !$-$( & !$-)%( &
4XkRk< #-)*+ (-(( )-&*% +#-#(+ &(-+%& #%**-$% +)( %-+** +
!$-%(( ) !$-( !-#) !$-&) * !$-%) !$-$*+ !$-)+& )
4kRk
!!本实验加权系数的确定是根据,中药半仿生提
取法-的理论$即在中药提取中坚持,有成分论$不
惟成分论$重在机体药效学反应-的观点) 按照各
指标在提取工艺选择中的主次地位$给予不同的加
权系数$以标准化后的值加权后求和$即得综合评价
值./ ) 在多指标综合评判中$给予单体成分%有效
部位的加权系数较大$其理由是因为单体成分%有效
部位%
$
$$$ 提取物得率 !相对分子质量
$
**+*
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+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
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9B6$ +$$
$$$ 提取物的干浸膏的各数据相差较大$若将各
指标数据以,同等对待进行加合作为综合评分指
标-$ 则
$
$$$ 提取物得率等数据较大的指标数值
稍有变化$就会掩盖单体成分%有效部位等数据较小
指标的数值+目前中药及其制剂的质量标准制订中$
仍多以单体成分%有效部位为追求的目标$这也是揭
示药效物质基础的主要部分)
本研究是对提取纯化的最终产物, $$$ 提取
物!相对分子质量
$
$$$ 提取物的干浸膏-$作小
檗碱%黄芩素%栀子苷%总生物碱%总黄酮%EFG<总
面积的测定$较通常以粗提物为最终产物$不仅提取
物收得率大大降低$可缩小服用剂量$而且为选用软
胶囊%滴丸等现代药物剂型提供了可能$同时提高了
技术含量) 以相对分子质量
$
$$$ 的提取物量为
指标能体现中药整体%综合%客观%模糊的特点$这是
中药药效物质提取研究设计中一种新思路$对中药
现代化研究是很有借鉴意义的)
参考文献#
./!张兆旺d中药药剂学专论.9/d北京#人民卫生出版社$+$$*#
#(d
.+/!张瑞亭$张兆旺$孙秀梅d思维方式的转换与中药,半仿生提
取法-.W/d中国中药杂志$**%$++!*#&+d
.)/!张兆旺$孙秀梅d中药方剂药效物质提取新技术&&&对,半仿
生提取模式-的探讨.W/d世界科学技术&&&中药现代化$
+$$$$+!&#)d
.&/!王晓林$钟方丽dEFG<测定复肾宁片中盐酸小檗碱的含量
.W/d中成药$+$$($)$!)#&#)d
./!张学兰$张兆旺$孙秀梅d黄柏 8RI法与 ZI法的成分比较
.W/d中国中药杂志$***$+$!+$##$$d
.#/!范全民$孙冬云$周慧娟$等dEFG<测定黄连上清片中黄芩苷
的含量.W/d中药材$+$$#$+(!$#&d
.%/!李云鹏$黄芸$魏春娥$等d紫外分光光度法测定黄芩中总黄
酮含量.W/d河北中医药学报$+$$%$++!#)#d
.(/!雷鹏$刘韶$李新忠$等d对中国药典(+$$ 年版一部栀子药
材栀子苷含量测定方法的探讨.W/d中药新药与临床药理$
+$$%$(!)#++d
5JA-+-W,A-?@?IT?+K-@,A-?@+?E>H?I+>E-T,.+,A>D-,.H-@>MAD,TA
?I0F,@S.-,@4->EFE>T?TA-?@KC H>+-*K-?@-T>MAD,TA-?@
XH_WN20N2D$ 8_;TNL0MN
!
$ ]E4;O]?B/,B2D$ _`XN2DC/2D$ G:!G>7)<%)( I)-J9/?-,%.=/7<-,-%)7&1>-)9?9@9<-A-)9$ V-)7) +$$&$ 1>-)7
.3KHAD,TA/!5K\>TA-O># P//A@N0NYM@?M./0\N2B@N/2 0/JMU/V0MJN.BS0B@MCNBSUN2 M7@CB.@/VELB2DSNB2 WNMJL JM./.@N/2-;>AB*
?E# XNlNJMJ @?M0MJN.BS0B@MCNBSU/VELB2DSNB2 WNMJL JM./@N/2 N2@/ DC/LAUB2J M7@CB.@MJ \6UM0N5\N/2N.MU@CB.@N/2 !8RI$ @?M./25
@M2@U/V\MC\MCN2M$ \BN.BSN2$ DM2NA/UNJM$ @/@BSBSKBS/NJ$ @/@BSVSBl/2/NJ$ @/@BSN2@MDCBS.BS.LSLUBCMB/VEFG
,BU4XkR<-/?@T.FH-?@# P?M/A@N0BS./0\N2B@N/2 0/JM/V@?MAMCU.CNA@N/2 NU@?B@>?NY/0BBJN7
8.L@MSBCNBMB2J .a>C V?DEH/!ELB2DSNB2 WNMJL JM./.@N/2+ UM0N5\N/2N.M7@CB.@N/2+ M7@CB.@N2D0/JM
E?-# bQ(Y`NT\T++(#
责任编辑!周驰#
*$#+*
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