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第 34卷第 1期
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蝙蝠葛碱对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经元
细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响
杨晓燕 1，张 力 1，蒋诗琴 2，龚培力 1*，曾繁典 1
（1. 华中科技大学 同济医学院 药理学系，湖北 武汉 430030；
2. 郧阳医学院 药理学教研室，湖北 十堰 442000）
[摘要] 目的：探讨蝙蝠葛碱对暂时性局灶性脑缺血再灌注损伤后大鼠脑半暗带区神经元细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达
的影响。方法：SD大鼠随机分成伪手术组，模型组和蝙蝠葛碱低、中、高剂量组。线栓法制备右侧大脑中动脉局灶性脑缺
血模型，缺血 1 h后再灌注 24 h。于大鼠脑缺血后即刻及复灌后 11 h及 23 h蝙蝠葛碱组腹腔注射蝙蝠葛碱（2.5，5，10 mg·kg-1），
伪手术组和模型组则注射生理盐水对照。再灌注 24 h后，多聚甲醛灌流固定大鼠脑组织，制作病理切片。TUNEL染色法原
位检测大鼠脑半暗带区神经元细胞凋亡情况，免疫组化法检测半暗带区细胞色素 C释放情况和 caspase-3，caspase-9的表达。
结果：与模型组细胞凋亡数（25.5±3.3）个/mm2比，蝙蝠葛碱中剂量组（18.9±2.02）个/mm2和高剂量组（15.9±2.9）个/mm2
大鼠脑缺血再灌注区神经元细胞凋亡程度明显改善（P<0.05），蝙蝠葛碱中、高剂量组半暗带区细胞色素 C释放减少，caspase
-3和 caspase-9表达亦明显降低（P<0.01）。结论：蝙蝠葛碱对脑缺血再灌注损伤保护作用的机制可能与其抑制神经元细胞
凋亡有关。
[关键词] 蝙蝠葛碱；脑缺血再灌注；细胞凋亡；细胞色素 C；capsase-3；caspase-9

*
缺血性脑血管疾病以其高发病率、高致残率和
高死亡率严重危害人们的健康，预防和治疗此病是
当今医学研究的热点。发病后尽早恢复缺血区脑血
流是目前治疗此种疾病最有效的方案，但再灌注同
时存在着不利一面，即其可导致严重的迟发性神经
元损伤，影响患者的预后和功能恢复。蝙蝠葛碱
（dauricine）是自防己科植物蝙蝠葛 Menispermum
dauricum，DC根茎中提取的 1种双苄基异喹啉类生
物碱，脂溶性高，易透过血脑屏障，在脑组织中有
较高的浓度分布[1]。作者前期的实验研究证实，蝙
蝠葛碱可减轻缺血性脑损伤，改善动物脑缺血再灌
注损伤后神经功能缺失症状，甚至明显缩小脑梗死
体积[2-4]。在其作用机制方面，虽然作者已证实低浓
度的蝙蝠葛碱即可减轻缺血区脑组织的能量衰竭
和氧化损伤[3
，5]，但其对缺血再灌注区神经元细胞
的生物学影响仍不清楚。很多研究提示神经元细胞
凋亡在脑缺血再灌注损伤的发病机制中具有重要

[收稿日期] 2008-07-23
[通信作者] *龚培力，教授，主要从事心脑血管药理学研究。Tel: (027)
83657702, E-mail: peiligong@hotmail.com
意义[6-10]，而蝙蝠葛碱的保护作用是否也与此有联
系尚不清楚。本实验拟从神经元细胞凋亡的角度，
探讨蝙蝠葛碱保护脑缺血再灌注损伤可能的作用
机制，旨在为蝙蝠葛碱治疗脑缺血疾病进一步提供
实验依据。
1 材料
1.1 动物 清洁级健康雄性 SD 大鼠 27 只，体重
250～300 g，由华中科技大学同济医学院实验动物
中心提供（动物合格证号 19-050）。
1.2 药物 蝙蝠葛碱自中药北豆根（产自黑龙江省
尚志市）中提取。采用氯仿溶解和碱液萃取的方法，
使蝙蝠葛碱得到初步分离，再利用色谱和重结晶方
法进一步精制蝙蝠葛碱。所得蝙蝠葛碱系白色粉
末，相对分子质量 624.7，纯度>98%。称取适量蝙
蝠葛碱，用 0.1 mol·L-1盐酸溶解，用生理盐水配成
0.5，1，2 g·L-1的溶液（用氢氧化钠调 pH 6.8）。
1.3 主要试剂 TUNEL 检测试剂盒（德国宝灵曼
公司，Cat.1684795）；兔抗鼠 caspase-3多克隆抗体
（美国 Neo Markers公司，Cat.MS-1121-P1）；兔抗
鼠 caspase-9 （ 美 国 Neo Markers 公 司 ，


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Cat.RB-1205-B）；兔抗鼠细胞色素 C（cytochrome C，
Cyt-C）多克隆抗体（美国 Neo Markers 公司，
Cat.MS-1191-P104 ）； 抗 兔 SP （ Streptavidin/
peroxidase）二抗试剂盒（北京中山生物技术有限公
司，批号 30577389）。3,3’-二氨基联苯胺（DAB）
（Fluka公司，批号 64B630）。
1.4 仪器 JM2005 型 AO 石蜡切片机（德国莱卡
公司）；HPLAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系
统（同济千屏影像工程公司）；RM6240C生理记录
系统（成都仪器厂）。
2 方法
2.1 分组与给药 动物随机分成 5组：①伪手术组
（n=3）：只暴露颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，
不插入尼龙线阻断 MCA 的血液供应；②模型组
（n=6），③④⑤分别为蝙蝠葛碱低、中、高剂量组
（均为 n=6）。伪手术组和模型组于脑缺血后即刻、
再灌注 11 h和 23 h后腹腔注射给予生理盐水（0.5
mL·kg-1）；蝙蝠葛碱低、中、高剂量组均于脑缺血
后即刻、再灌注 11 h 和 23 h后分别腹腔注射 2.5，
5，10 mg·kg-1蝙蝠葛碱，手术后 24 h内各组给药总
剂量分别为 7.5，15，30 mg·kg-1。
2.2 局灶性脑缺血再灌注模型的制备 如文献[4]
方法制备大鼠右侧大脑中动脉栓塞（middle cerebral
artery occlusion，MCAO）暂时性局灶性脑缺血再灌
注模型。大鼠称重，10%水合氯醛溶液（350 mg·kg-1）
腹腔注射麻醉，仰卧固定于恒温手术台上，同时监
测大鼠脑电图。将 2.5 号的单丝尼龙线经颈外动脉
主干切口缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动
脉分叉处为标记，推进 17～20 mm 感到轻微阻力
时，即达到较细的大脑前动脉，阻断 MCA 所有血
液供应，此时在脑电图上可观察到缺血侧大鼠脑电
图节律基本消失，生理波减少，波幅降低。缺血 1 h
后，轻轻拔出尼龙线，结扎颈外动脉残端并缝合皮
下筋膜及皮肤，即为再灌注模型，再灌注时间为 24
h。伪手术组除不插尼龙线阻塞血管外，其他操作
与手术组相同。实验期间室温 25.5～26.5 ℃。再灌
注前按如下标准对神经病学症状进行评分[7]：0＝无
神经损伤；1＝左前肢无力，不能完全伸直；2＝行
走时向左转圈；3＝行走时向左侧倾倒；4＝不能自
发行走，意识昏迷。评分为 1～3分者为模型成功，
余者剔除。
2.3 脑组织处理及切片 脑缺血 1 h再灌注 24 h后
（期间按方案给药），大鼠用 10%水合氯醛（350
mg·kg-1）腹腔注射麻醉，迅速开胸暴露心脏，将灌
注针头从左心室插入升主动脉，剪开右心房作为出
口。先用 0.9% NaCl 200 mL快速冲洗血液，再用
4%多聚甲醛（用 1×PBS配制，pH 7.4）400 mL灌
流固定。断头取脑，用 4%多聚甲醛固定过夜，常
规石蜡包埋，视交叉前缘处作 6 μm厚冠状切片。
2.4 TUNEL 法原位检测细胞凋亡 按试剂盒说明
操作，脑组织切片常规脱蜡入水，用蛋白酶 K（20
mg·L-1溶于 10 mmol·L-1 Tris-HCl中，pH 7.4～8.0）
室温孵育 15～30 min，PBS洗 2次；滤纸吸干样品
周围的水，滴加 TUNEL反应混合液 50 μL，在湿盒
中 37 ℃孵育 60 min，PBS洗 3次；擦干样品周围
的水，加入转化剂-POD 50 μL，在湿盒中 37 ℃孵
育 30 min，PBS洗 3次；滴加 50～100 μL DAB底
物溶液，室温孵育 10 min，水洗；乙醇梯度脱水，
二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察。同时设置
阴性对照：以核苷酸混合液代替 TUNEL反应混合
液，其他操作与上述相同。凋亡细胞计数时，每张
切片在镜下（´200）于缺血侧皮质半暗带随机采集
5 个视野，采用 HPIAS-1000 图像分析系统摄入计
算机，直接计数每个视野的凋亡细胞个数，以平均
值作为凋亡细胞数。
2.5 免疫组化法检测 Cyt-C 释放、caspase-9 和
caspase-3 的表达 将脑组织切片进行免疫组化染
色，并设立 3 种对照实验。阳性对照实验：以已知
阳性组织切片做阳性对照；空白对照实验：用 1×
PBS代替一抗，其余步骤不变；置换实验：用正常
羊血清代替一抗同样进行免疫组织化学染色。采用
HPIAS-1000 图像分析系统对免疫组化结果进行分
析，每张切片在镜下（´200）随机选取 5个视野，
并通过 HPLAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系
统分析缺血侧皮质半暗带区各组间阳性着色的平
均吸光度（A）（反映阳性着色强弱）。
2.6 统计学处理 用 SPSS 12.0软件进行统计，实
验数据以 ±x s表示，多组间均数以 ANOVA方差分
析进行组间比较，两两间比较以 SNK 法进行 q 检
验。P<0.05表示组间差异有统计学意义。
3 结果
3.1 对神经细胞凋亡的影响 光镜下可见，伪手术


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组大鼠皮层神经细胞几乎全为 TUNEL阴性反应细
胞，核着色浅黄，细胞疏散且界限较为不清，偶见
阳性反应细胞。模型组大鼠皮层半暗带可见大量
TUNEL阳性反应细胞即凋亡细胞，胞核固缩浓染，
呈显棕黄色或深棕色，胞体缩小，形状不规则，凋
亡细胞数明显高于伪手术组（P<0.01）。蝙蝠葛碱低
剂量组大鼠皮层半暗带凋亡细胞数有降低趋势，但
与模型组相比差异无统计学意义。蝙蝠葛碱中、高
剂量组神经细胞凋亡数明显少于模型组（P<0.05）。
结果见表 1、图 1。
表 1 蝙蝠葛碱对大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡、caspase -3和 caspase- 9表达、Cyt-C释放的影响（ ±x s）
分组 剂量/mg·kg-1 n positive/ 个/mm2 caspse-3/A caspse-9/A Cyt-C/A
伪手术 - 3 4.2±1.2 0.113±0.028 0.132±0.023 0.099±0.027
模型 - 6 25.5±3.31) 0.308±0.0351) 0.268±0.0231) 0.274±0.0331)
蝙蝠葛碱 2.5 6 20.0±1.91 0.277±0.029 0.246±0.056 0.239±0.025
5 6 18.9±2.022) 0.227±0.0423) 0.212±0.0273) 0.205±0.0303)
10 6 15.9±2.92) 0.188±0.0353) 0.195±0.0403) 0.183±0.0403)
注：与伪手术组比 1)P<0.01；与模型组比 2)P<0.05，3)P<0.01。

A．伪手术组；B. 模型组；C.蝙蝠葛碱低剂量组；D.蝙蝠葛碱中剂量组；E. 蝙蝠葛碱高剂量组（图 2~4同）。
图 1 蝙蝠葛碱对大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响（TUNEL，×200）

3.2 对 Cyt-C 释放的影响 采用免疫组化法检测
皮质半暗带区 Cyt-C的释放，典型的 Cyt-C阳性细
胞为弥散性胞浆染色。伪手术组几乎未见 Cyt-C表
达阳性细胞，平均 A很低，与文献报道一致[11]。模
型组大鼠皮质半暗区 Cyt-C阳性细胞数显著增加，
着色棕黄或深棕色，平均 A较高，与伪手术组比有
显著差异（P<0.01）。蝙蝠葛碱低剂量组皮质半暗带
区细胞 Cyt-C阳性细胞数减少，平均 A有下降趋势，
但与模型组比无统计学意义。蝙蝠葛碱中、高剂量
组皮质半暗带区细胞 Cyt-C阳性细胞数明显减少，
与模型组相比，平均 A 值均明显下降（P<0.05 或
P<0.01）。结果见表 1、图 2。
3.3 蝙蝠葛碱对大鼠缺血再灌注后脑组织对
caspase-3 及 caspase-9 蛋白表达的影响 伪手术组
大鼠皮质半暗带区仅见少量 caspase-3及 caspase-9
蛋白表达阳性细胞，以胞浆表达为主，且着色很浅，
几乎接近背景颜色，平均 A 均很低。模型组皮质
caspase-3及 caspase-9表达阳性细胞均增多，着色
棕黄或深棕色，平均 A 均较高，与伪手术组比有
显著差异（P<0.01）。蝙蝠葛碱低剂量组皮质半暗
带区 caspase-3及 caspase-9阳性细胞数减少，平均
A有下降趋势，但与模型组比无统计学意义。蝙蝠
葛碱中、高剂量组皮质半暗带区 caspase-3 及
caspase-9 阳性细胞数明显减少，与模型组相比，
平均 A均明显下降（P<0.05或 P<0.01）。结果见表
1，图 3，4。


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图2 蝙蝠葛碱对大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞色素C释放的影响（免疫组化，×200）

图 3 蝙蝠葛碱对大鼠脑缺血再灌注损伤后 caspase- 3表达的影响（免疫组化，×200）

图 4 蝙蝠葛碱对大鼠脑缺血再灌注损伤后 caspase-9表达的影响（免疫组化，×200）


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4 讨论
过去认为坏死是脑缺血后神经细胞丢失的唯
一方式。近年的研究表明，脑缺血再灌注时缺血半
暗带神经元死亡的主要形式为凋亡，且细胞凋亡的
程度与最终梗死体积的大小关系密切。缺血神经元
凋亡具有延迟性，且呈可逆过程，这就为脑缺血的
治疗提供了时间，使得药物治疗以减轻神经元的损
伤进而减少脑梗死体积成为可能[6-10]。
在脑缺血的过程中，线粒体产生大量的自由
基，特别是超氧阴离子，在组织损伤面积的扩展过
程中扮演着重要角色。在体外实验中已经证实线粒
体通过释放触发凋亡的蛋白——Cyt-C，从而介导
细胞凋亡的发生[12]。目前认为在脑缺血时线粒体释
放的 Cyt-C 主要通过激活其下游的 caspase 家族蛋
白引起细胞凋亡，从而导致细胞死亡[13]。Cyt-C 下
游的 caspase 蛋白家族是一组 ICE（interleukin-1β
convert enzyme，IL-1β转化酶）类蛋白，均是半胱
氨酸蛋白酶，在细胞凋亡中扮演了重要角色。某些
濒死细胞由于其线粒体跨膜电势的崩溃及线粒体
渗透性改变可导致 Cyt-C释放至胞浆，在辅助因子
Apaf-1 的协助下，激活 caspase-9 酶原，激活的
caspase-9 进一步酶解 caspase-3 的前体，使其成为
有活性的形式。活化的 caspase-3可使参与维持细胞
结构、调控细胞骨架以及染色体修复等重要功能的
蛋白质（如核纤层蛋白，凝集素，FAK，DNA-PKCS
等）酶解，最终导致细胞凋亡[14-17]。目前已在大鼠
局灶性脑缺血再灌注模型中观察到，caspase二肽抑
制剂MX1013可使脑梗死体积降低约 50%[18]。还有
研究发现应用 caspase-9抑制剂 Z-LEHD-FMK可降
低梗死体积，改善神经症状，提示依赖 Cyt-C 的
caspase- 9在凋亡发生中具有重要作用[19]。
蝙蝠葛碱具有多重药理作用，包括减缓跨膜离
子交换，抑制缺氧所致的去极化过程以及清除氧自
由基[20]，这些作用均可能影响凋亡引起神经细胞死
亡的病理过程。作者前期的研究证实蝙蝠葛碱对缺
血所致的线粒体氧化应激具有保护作用[3]，其对脑
缺血再灌注后神经功能缺失症状具有明显的改善
作用[2,4]。在此基础上，为进一步探讨蝙蝠葛碱的神
经保护机制，作者采用 TUNEL法检测脑缺血再灌
注后大鼠脑皮质半暗带区神经细胞凋亡，并采用免
疫组化法检测 caspase-3，caspase-9及 Cyt-C蛋白表
达，了解蝙蝠葛碱是否有助于减轻神经细胞凋亡。
结果显示模型组大鼠在脑缺血 1 h再灌注 24 h后，
缺血侧皮层可见大量凋亡细胞，在缺血中心区散在
分布，而在梗塞边缘区较为密集。而蝙蝠葛碱治疗
后，凋亡细胞数明显减少。蝙蝠葛碱还可抑制 Cyt-C
释放至胞浆，明显降低凋亡的关键执行分子
caspase-3 的表达，并对其上游调控蛋白 caspase-9
的表达也有抑制作用，其效果均以中、高剂量较佳。
本研究结果提示蝙蝠葛碱能明显减轻脑缺血再灌
注后大鼠脑皮质半暗带区细胞凋亡程度，抑制皮质
半暗带区 Cyt-C的释放，以及 caspase -3，caspase -9
的表达，有利于抑制损伤性机制，减少神经元细胞
凋亡发生。综上所述，蝙蝠葛碱减轻脑缺血再灌注
组织的细胞凋亡可能是其脑保护作用的机制之一。
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Effect of dauricine on apoptosis and expression of apoptogenic protein after
transient focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

YANG Xiaoyan1，ZHANG Li1，JIANG Shiqin2，GONG Peili1*，ZENG Fandian1
(1. Department of Pharmacology，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China;
2. Department of Pharmacology，Yunyang Medical Collegey，Shiyan 442000，China)

[Abstract] Objective：To investigate the effect of dauricine on the apoptosis of neuronal cells and the expression of
apoptosis-related proteins in the brain penumbra of rats induced by transient focal cerebral ischemia-reperfusion injury. Method:
Male SD rats were randomly divided into five groups: sham group (Sham)，model group (Model)，and Dauricine groups of low，
middle and high doses. To make the transient focal cerebral ischemia-reperfusion injury model，the middle cerebral artery on the
right side of rat was occluded by inserting a nylon suture through the internal carotid artery for 1 h，followed by reperfusion for 24 h
after withdrawing the suture. Dauricine groups，different doses of Dauricine (2.5，5，10 mg·kg-1 as low，middle and high dose
respectively) were administered intraperitoneally at the beginning of the cerebral ischemia，and at 11 h and 23 h after reperfusion. At
the same time，Sham group and Model group was administered saline as controls. Brain samples of rats were treated with paraforma
ldehyde perfusion fixation 24 h after blood reperfusion and then collected for making pathological sections. Apoptotic changes of
neuronal cells in the brain penumbra of rat were evaluated in situ by terminal deoxyribonucleotidyl transferasemediated
dUTP–digoxigenin nick end-labelling (TUNEL). Cytochrome C (Cyt-C) release and the expression of caspase -3 and caspase -9
proteins of the ischemic-reperfusion brain tissue were determined by immunohistochemistry assay. Result: TUNEL-positive cells in
groups of middle and high doses of dauricine (18.9±2.02 and 15.9±2.9 cells/mm2 respectively) decreased significantly compared with
model group (25.5±3.3 cells/mm2，P<0.05). Cyt-C release and the expression of caspase- 3 and caspase -9 proteins in groups of
middle and high doses of dauricine were also inhibited compared with Model group (P<0.01). Conclusion: The mechanism of the
neuroprotective effect of dauricine after cerebral ischemia-reperfusion injury may parly，related with an inhibition of neuronal cells
apoptosis in the penumbra.
[Key words] dauricine; transient focal cerebral ischemia; apoptosis; cytochrome c; capsase -3; caspase -9
[责任编辑 古云侠]