全 文 ：

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Vol.34，Issue 4
February，2009
第 34 卷第 4 期
2009 年 2 月
葡萄籽提取物对乳腺癌细胞增殖和
Survivin 基因表达的影响
陈昌杰*，刘臣彪，章 菊，杨清玲，藤风猛
(蚌埠医学院，安徽 蚌埠 233030)
[摘要] 目的：观察葡萄籽提取物（GSE）对乳腺癌 MCF-7 细胞增殖抑制及对 Survivin 基因表达的影响，探讨 GSE 抑
制肿瘤的分子生物学机制。方法：GSE 剂量分别为 40，80，120，160，200 mg·L-1，在不同时间段，MTT 法检测 GSE 对乳
腺癌 MCF-7 细胞的增殖抑制作用，计算 IC50，流式细胞术检测细胞周期变化。RT-PCR 方法检测肿瘤细胞中 Survivin mRNA
表达水平。荧光素酶试剂盒观察 GSE 作用于含 Survivin 核心启动子的 pGL3 荧光报告载体后 Survivin 核心启动子的活性变
化，并利用生物信息学软件分析 Survivin 核心启动子序列上的转录因子结合位点。结果：GSE 能有效抑制乳腺癌 MCF-7 细
胞的增殖，具有剂量和时间依赖性（P<0.05）；GSE 使细胞周期停滞于 S 期；GSE 能有效抑制 Survivin mRNA 的表达（P<0.01）；
GSE 明显降低 Survivin 基因核心启动子活性（P<0.01）。结论：GSE 使细胞周期停滞于 S 期，从而抑制乳腺癌 MCF-7 细胞
的增殖，其作用机制之一可能是通过调控与 Survivin 核心启动子活性相关的转录因子的活性，进而降低 Survivin 基因的表达
水平而实现的。
[关键词] 葡萄籽提取物；乳腺癌；细胞周期；Survivin；Survivin 核心启动子

葡萄籽提取物(GSE）是一种多酚类复合物，主
要成分是聚合多酚即原花青素（ grape seed
proanthocyanidins，GSP），还包括儿茶素和表儿茶
素的二聚体、寡聚体和多聚体以及没食子酸酯等单
体多酚[1]。近年来，人们发现 GSE 对人类肿瘤具有
广泛的抑制作用[2]，各种相关的体内外实验均显示
其对许多肿瘤有显著的抑制作用。Survivin 是凋亡
抑制蛋白家族的一个新成员，是迄今发现最强的凋
亡抑制因子[3]，研究表明 Survivin 与肿瘤的发生、
发展、预后以及多药耐药密切相关[4]，是目前抗肿
瘤研究的一个热点。本研究进一步证实 GSE 对肿瘤
细胞生长的抑制作用，并初步探讨其对 Survivin 基
因表达的影响机制。
1 材料
1.1 细胞株
人乳腺癌细胞 MCF-7 细胞株，由本实验室冻
存(南京凯基生物科技发展有限公司)。
1.2 药物与试剂
葡萄籽提取物（乙醇提取，原花青素≥95%，

[收稿日期] 2008-08-15
[通信作者] *陈昌杰，Tel：（0552）3715239，E-mail：bbmcccj@sohu.com
深圳市安心久久科技有限公司，批号 070316)，
DMEM 培养基（Gibco 公司，Lot 1320158），新生
牛血清（杭州四季青公司，批号 070125），0.25%
胰蛋白酶(Gibco 公司) ，四甲基偶氮唑蓝(MTT)
( Sigma 公司，Lot 4081397)，DEPC（焦碳酸二乙酯）
(Invitrogen 公司，Lot 2010/08)，Trizol（Invitrogen
公司，Lot 1199177）M-MuLV 第一链 cDNA 合成实
剂盒(MBI Fermentas 公司，Lot 00022141)，Survivin、
GAPDH 引物(上海生工生物工程技术服务有限公
司 ) ， Dual-Luciferase®Reporter Assay System
（Promega 公司，Lot 256146），pGL3 系列载体（蚌
埠医学院第一附属医院陈余清博士惠赠）。
1.3 仪器
SHEL LAB型CO2培养箱(日本科学株式会社)，
CX-201 超净工作台(蚌埠净化设备厂)，Multiskan
Ascent 酶标仪(芬兰)，温度梯度 PCR 仪（美国
Biometra 公司），FR-200 紫外-可见分析仪（上海复
日科技公司），2030-100 型荧光仪（美国 Turner
Biosystems 公司），FACSCalibur 流式细胞仪（美国
BD 公司）。
2 方法
2.1 细胞培养


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第 34 卷第 4 期
2009 年 2 月
人乳腺癌细胞株 MCF-7 培养于含 10%新生牛
血清的 DMEM 培养基中，置于 37 ℃，5% CO2 饱
和湿度的细胞培养箱中培养。
2.2 GSE 对细胞增殖的抑制作用
GSE 终浓度分别为 40，80，120，160，200
mg·L-1，作用时间 12，24，48，72 h。肿瘤细胞按
每孔 3 000 个细胞接种于 96 孔板，对照孔加等量无
菌蒸馏水。每组 6 个复孔。24 h 后加各浓度 GSE，
然后在不同时间段每孔加入 MTT(5 g·L-1)20 μL，孵
育 4 h 后每孔加入 200 μL DMSO，避光震荡摇匀，
在酶标仪上检测 530 nm 处的吸光度（A），肿瘤细
胞生长抑制率(%)=(1–A 实验组 / A 对照组 )×100%。根
据 MTT 结果设计后续实验 GSE 实验剂量为 50，
100，200 mg·L-1，作用时间为 24 h。
2.3 细胞周期测定
MCF-7 细胞按每孔 2.0×105个细胞接种于 6 孔
板，24 h 后加 50，100，200 mg·L-1 剂量的 GSE，
设对照孔，加等量无菌蒸馏水。。作用 24 h 后收集
细胞，PBS 洗 2 遍，70%乙醇固定 1 h，PBS 洗 2
遍后各管加 300 μL PBS，加入 RNA 酶作用 30 min，
PI 避光染色 30 min 后用流式细胞仪检测细胞周期
变化。
2.4 半定量 RT-PCR
2.4.1 总 RNA 提取 MCF-7 细胞按每孔 1.0×106
个细胞接种于 6 孔板，培养 24 h，试验分组同 2.3
项下测定。24 h 后收集细胞，PBS 洗细胞 2 遍后，
各加 1 mL Trizol，反复吹打后置室温 10 min，使核
蛋白体复合体完全解离。加 0.2 mL 氯仿，剧烈混匀
15 s，室温孵育 3 min。4 ℃，12 000 r·min-1 离心
15 min。离心后，混合物分成 3 个相：底层红色的
酚-氯仿相；中间相；上层的无色水相。RNA 全都
在水相，小心转移水相至另一个 Ep 管中，加入等
体积异丙醇，4 ℃孵育 10 min。4 ℃，12 000 r·min-1
离心 l0 min。小心移去上清液，加 l mL 75%乙醇，
混匀，在 4 ℃，7 500 r·min-1 离心 5 min，弃乙醇。
将 RNA 自然干燥后溶解在无 RNase 的水中。
2.4.2 cDNA 的合成 以提取的总 RNA 为模板合
成 cDNA，操作方法参考说明书进行。
2.4.3 PCR 扩增 用 Primer 5.0 设计 Survivin 基因
引物上游 5’-GGACCACCGCATCTCTACATTC-3’，
下游 5’-AGAAACACTGGGCCAAGTC-3’，（产物
130 bp）。GAPDH 引物：上游 5-GGGAAGGTGA
AGGTCGGAGTC-3：下游 5-A GCAGAGGGGGC
AGAGATGAT-3（产物 375 bp）。取 4 μL PCR 产物、
3 μL Marker、2 μL 溴酚蓝指示剂，1.5%琼脂糖凝胶
电泳约 45 min(电压 100 V)，FR-200 紫外-可见分析
仪扫描拍照，Smart view 图像分析软件半定量分析
扫描灰度值，以 GAPDH 表达量为对照计算并比较
各组 Survivin 基因的相对表达量。
2.5 Survivin 核心启动子活性检测
MCF-7 细胞接种于 6 孔板中，用含 10%新生牛
血清的 DMEM 培养基于 37 ℃，5% CO2 条件下培
养至 90%~95%融合；转染质粒包括含有 SV40 增强
子/启动子的 pGL3-Control 阳性对照质粒；无启动
子的 pGL3-Basic 阴性对照质粒；含 Survivin 核心启
动子的待测质粒，在 LipofectinamineTM 2000 的介导
下，按等摩尔浓度将 3 种报告载体与内参质粒
LAC-Z 分别共转染上述细胞；转染程序按
LipofectinamineTM 2000 操作说明书进行；每种质粒
的用量为 2 μg/孔，内参质粒用量为 0.2 μg/孔，
LipofectinamineTM 2000 用量为 10 μL/孔，37 ℃继
续培养 6 h，试验分组同 2.3 项下，阴性质粒与阳性
质粒组的处理同对照组，继续培养 24 h 后收集细
胞，按荧光素酶试剂盒说明书检测报告基因的荧光
素酶活性。以上实验均重复 3 次。
2.6 统计学处理
实验数据用 x ±s 表示，用 SPSS 软件进行统计
学分析，采用单因素方差分析，两两比较用 q 检验。
3 结果
3.1 各组 MCF-7 细胞抑制率的比较
MTT 检测 GSE 对 MCF-7 细胞生长抑制作用，
结果显示，各剂量 GSE 对 MCF-7 细胞的抑制率均
明显高于对照组，具有剂量依赖性。同时 24，48，
72 h组抑制率与12 h组比较明显升高具有时间依赖
性（表 1）。
根据 24 h 组抑制率绘制生长抑制率曲线，得
GSE 抑制乳腺癌细胞 MCF-7 生长的 IC50 在 100
mg·L-1。
3.2 GSE 对细胞周期的影响
由流式细胞仪检测结果可见，GSE 使 MCF-7
细胞阻滞于 S 期，同时 G2 期细胞显著降低
（P<0.01），而 G1 期无明显变化（表 2）。


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表 1 GSE 对 MCF-7 细胞的生长抑制率（ ±x s ，n=3）
生长抑制率/%
分组 剂量/mg·L-1 12 h 24 h 48 h 72 h
对照 - 0 0 0 0
GSE 40 12.50±3.031） 18.94±4.312,3) 22.10±2.912,3) 23.68±4.742,3)
80 30.90±3.551) 40.26±4.342,3) 55.44±13.502) 59.18±4.512,3)
120 50.65±8.471) 54.09±5.582,3) 66.38±7.352,3) 70.13±4.792,3)
160 54.60±9.141) 60.66±2.972,4) 75.30±4.792,4) 79.42±7.362,4)
200 61.01±10.521) 73.27±4.222,3) 81.69±6.342,3) 85.58±9.282,3)
注：作用时间相同时与对照组比 1)P<0.05，2)P<0.01；GSE 剂量相同时与对照组比 3)P<0.05，4)P<0.01。

表 2 GSE 作用后 MCF-7 细胞周期变化（ ±x s ，n=3） %
组别 剂量/mg·L-1 G0/G1 S G2/M
对照 - 54.10±4.69 18.92±1.11 26.98±4.32
GSE 50 54.38±6.65 30.57±6.041） 11.05±5.071）
100 52.01±1.94 43.06±2.21） 4.87±3.291）
200 47.84±1.55 51.12±1.901） 1.08±0.321）
注：与对照组比 1)P<0.01（表 3 同）。

3.3 半定量 RT-PCR 结果
经RT-PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳后，凝胶
成像可见MCF-7细胞Survivin基因mRNA的表达随
GSE剂量的升高逐渐降低（图1）；经扫描分析后，
Survivin基因mRNA的表达与正常对照组比较，GSE
各剂量组A明显降低（P<0.01）。

1.对照； 2.GSE 50 mg·L-1；3.GSE 100 mg·L-1；4.GSE 200 mg·L-1。
图1 GSE作用后各组细胞Survivin基因mRNA的表达

3.4 GSE 对 Survivin 核心启动子活性的影响
3.4.1 荧光素酶试剂盒检测结果 含 Survivin 核心
启动子的荧光素酶报告载体的荧光强度在 GSE 作
用后与对照组相比显著降低，具有剂量依赖性
（表 3）。
3.4.2 Survivin 核心启动子片段序列分析 利用生
物信息学软件分析发现，Survivin 核心启动子序列
表3 GSE对Survivin核心启动子活性的影响（ ±x s ，n=3）
分组 剂量/mg·L-1 相对活性
pGL3-Basic - 0.97±0.18
pGL3-对照 - 60.34±5.77
对照 - 75.76±7.47
GSE 50 21.69±6.011)
100 8.56±2.311)
200 2.32±0.741)

上含有潜在的 CDE，CHR，Sp1，E2F，p53，HIF-1α
等转录因子结合位点。
4 讨论
目前，肿瘤仍然是威胁人类健康的主要疾病，
化疗作为传统的肿瘤治疗手段仍是临床治疗肿瘤
的主要方法之一。最近研究发现，GSE 对许多肿瘤
具有抑制作用。Praveen 等的研究显示 GSE 可通过
抑制 MAPK 和 NF-κB 途径并减少相关的基质金属
蛋白酶的表达而抑制前列腺癌细胞的增殖[5]。体内
和体外实验显示，GSE 能促进结肠直肠癌细胞凋
亡，具有时间和剂量依赖性。GSE通过增加Cip1/p21
蛋白合成和降低 G1 期相关性细胞周期蛋白和细胞
周期蛋白依赖性激酶而使肿瘤细胞停滞于 G1 期[6]。
有研究发现，GSE 抑制乳腺癌细胞的作用与乳腺癌
化疗药物阿霉素类似，并且 GSE 与阿霉素具有明显
的联合作用[7]。本实验的结果也证实 GSE 对乳腺癌
细胞生长有较强的抑制作用。
细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞的
增殖、凋亡、分化均是细胞周期依赖性的。有研究
表明细胞停滞于 S期可抑制细胞的增殖并促进细胞
的凋亡[8]，许多化疗药物也是通过阻滞肿瘤细胞于
S 期而达到抗肿瘤疗效的[9]。GSE 使 MCF-7 细胞停


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滞于 S 期，同时 G2 期细胞显著降低，而 G1 期无明
显变化。所以笔者认为，GSE 通过将 MCF-7 细胞
停滞于 S 期而抑制细胞的增殖，并有可能诱导细胞
的凋亡，这有待于进一步的研究证实。
Survivin 是已鉴定的 IAPs 家族成员中最小、
最具有基础与临床意义的分子[10]。其表达具有高度
的肿瘤特异性，在调节肿瘤细胞分化、抑制凋亡、
影响细胞分裂等过程中具有重要作用。有研究表
明，将含有 Survivin 基因的表达载体转染入 MCF-7
细胞可降低细胞对多种化疗药物的敏感性，诱导细
胞多药耐药性的形成，将含 Survivin 干扰片段的载
体转入细胞后可明显增加细胞对化疗药物的敏感
性[11]。Al-Joudi F S 等的研究表明 Survivin 的临床检
测有助于乳腺癌的临床诊断以及评估肿瘤进展情
况和对化疗药物的反应性[12]。Survivin 这些特点使
它可能成为一个肿瘤的分子标志和理想的治疗靶
点。在实验中发现，未经 GSE 作用的 MCF-7 细胞
中 Survivin 基因 mRNA 高表达，经 GSE 作用后，
其表达明显降低，表明 GSE 可能通过降低 Survivin
基因的表达水平而抑制 MCF-7 细胞的增殖。为了
更好的了解 GSE 抑制 Survivin 基因表达的机制，进
一步观察GSE对Survivin核心启动子活性是否有影
响，结果发现 GSE 能明显降低 Survivin 核心启动子
的活性，通过生物信息学软件分析发现，Survivin
核心启动子序列上含有潜在的 CDE，CHR，Sp1，
E2F，p53，HIF-1α等转录因子结合位点。提示 GSE
可能是通过调控这些转录因子的活性而抑制
Survivin 核心启动子的活性。
综上所述，GSE 能有效抑制乳腺癌 MCF-7 细
胞的增殖，并使细胞停滞于 S 期，同时，GSE 能显
著降低 Survivin 基因的表达水平，其作用可能是通
过调控与 Survivin 核心启动子序列相关的转录因子
的活性而实现的。本实验证实，GSE 能有效抑制乳
腺癌细胞的增殖并降低肿瘤相关凋亡抑制基因的
表达，提示 GSE 是一种有效的乳腺肿瘤治疗药物，
值得进一步深入研究。
[参考文献]
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February，2009
第 34 卷第 4 期
2009 年 2 月

Grape seed extract inhibit proliferation of breast cancer cell MCF-7 and
decrease the gene expression of Survivin

CHEN Changjie1*，LIU Chenbiao2，ZHANG Ju2，YANG Qingling1，TENG Fengmeng2
（Bengbu Medical College, Bengbu 233030，China）

[Abstract] Objective： To observe the effect of grape seed extract （GSE） on breast cancer cell MCF-7 about the of
proliferation and the gene expression.of survivin，and to investigate the molecular biological mechanism of inhibition by GSE.
Method： MTT was used to measure the role of proliferated inhibition of GSE at the dosage of 40，80，120，160，200 mg·L-1 with
different time. To calculate the IC50 of GSE and to select the suitable concentration and treatment time. The change of cell cycle was
detected by flow cytometry. mRNA espression of Survivin was observed by RT-PCR. Luciferase kit was used to observe the change
of core promoter of survivin which was inserted in the flourescence report vector. And further to analyse the bind side of
transcription factor on the sequence of core promoter of survivin was further analysed by using the microsoft of bioinformatics.
Result：GSE could inhibit the proliferation of breast cancer cell MCF-7 with time and dosage-dependent（P<0.05）. GSE could arrest
the cell cycle in S periods（P<0.05）and also inhibit the mRNA expression of survivin effectively（P<0.01）；GSE could down-regulate
the activity of core promoter of survivin significantly（P<0.01）. Conclution： GSE can inhibit the proliferation of breast cancer cell
MCF-7 through arresting the cell cycle in S periods. The mechanism may be that GSE regulate the activity of transcription factor
which are related to the activity of core promoter of survivin and decrease the gene expression of survivin.
[Key words] GSE; breast cancer；cell cycle；Survivin；core promoter of survivin
[责任编辑 古云侠]





《中国中药杂志》被国内外数据库收录情况和引证数据

1 国外数据库收录
美国 SciFinder 数据库：进入医学索引 MEDLINE；进入《化学文摘》（CA）；荷兰 Elsevier 公司 Scopus
数据库；《国际药学文摘》(IPA)；《毒物学文摘》（ToxFile）；俄罗斯《文摘杂志》（AJ）；波兰《哥白尼索引》
（IC）；WHO 西太平洋地区医学索引(WPRIM)。
2 国内数据库收录
“中国科学引文数据库”来源期刊；“中国学术期刊综合评价数据库”来源期刊；中国自然科学核心
期刊；中国中文核心期刊；中国科技核心期刊；《中国学术期刊文摘》中、英文版。
3 主要引证数据或数据库统计结果
《中国中药杂志》在中国知网（CNKI）的 2007 年浏览量为 37 万，下载量为 21 万，国内外用户达到
2000 余家。　
据中国科学技术信息研究所分析研究中心发布的中国科技期刊核心版引证报告(2007)：影响因子为
0.693，总被引频次 3 937，基金论文比 0.53，被引半衰期 5.68；扩展版：影响因子 1.052；引文频次 6 853。