全 文 ：ＨＰＬＣ同时测定赤芝中４种三萜酸的含量
赵佳１，陈晓辉２，毕开顺２
（１．沈阳药科大学 中药学院，辽宁 沈阳 １１００１６；
２．沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 １１００１６）
［摘要］ 目的：建立ＨＰＬＣ同时测定赤芝药材中灵芝酸 Ｃ２、灵芝烯酸 Ａ、灵芝酸 Ａ和灵芝酸 Ｄ含量的方法。方法：采用
ＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８色谱柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相为乙腈００３％磷酸水溶液采用梯度洗脱，流速１０ｍＬ·ｍｉｎ
－１，检测波长
２５２ｎｍ，柱温３５℃。结果：灵芝酸Ｃ２、灵芝烯酸Ａ、灵芝酸Ａ和灵芝酸Ｄ的线性范围分别为：５０～５００ｍｇ·Ｌ
－１（ｒ＝０９９９９），
７２～７２ｍｇ·Ｌ－１（ｒ＝０９９９９），１１６７～１１６７ｍｇ·Ｌ－１（ｒ＝０９９９９）和５３２～５３２ｍｇ·Ｌ－１（ｒ＝０９９９８）；平均回收率（ｎ＝
３）分别为９８８％（ＲＳＤ１５％），９９１％（ＲＳＤ１９％），９９５％（ＲＳＤ１４％）和９８５％（ＲＳＤ１９％）。结论：该方法简便、准确，重复
性好，为赤芝药材的质量控制提供了实验依据。
［关键词］ 赤芝；灵芝酸Ｃ２；灵芝烯酸Ａ；灵芝酸Ａ；灵芝酸Ｄ；高效液相色谱法
［收稿日期］ ２００９０３２４
［通信作者］ 毕开顺，Ｔｅｌ：（０２４）２３９８６０１６，Ｅｍａｉｌ：ｂｉｋａｉｓｈｕｎ＠ｙａ
ｈｏｏｃｏｍ
赤芝Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍ（Ｌｅｙｓｓ．ｅｘＦｒ．）Ｋａｒｓｔ．
为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌［１］，是我国传统的
名贵滋补类药材，始载于汉代《神农本草经》，列为
上品，并且于２０００年正式收载于《中国药典》。现
代科学研究证明赤芝具有广泛的药理作用，能治疗
多种疾病，而三萜类为赤芝中的主要有效成分，具有
明显的抗癌、增强免疫力和保肝护肝等多种药理作
用［２］。灵芝三萜酸类化合物为该药材的活性成分，
本研究从赤芝子实体中分离得到了４种灵芝三萜
酸：灵芝酸 Ｃ２，灵芝烯酸 Ａ、灵芝酸 Ａ和灵芝酸 Ｄ，
建立测定该药材中这４种三萜酸含量的高效液相色
谱法，为赤芝药材的质量控制［３４］提供依据。
１ 仪器与试药
ＳＨＩＭＡＤＺＵＬＣ２０１０Ａ型高效液相色谱仪，ＳＰＤ
１０Ａ紫外检测器，ＳＨＩＭＡＤＺＵＣＬＡＳＳＶＰ色谱工作
站，ＫＱ１００ＤＢ型超声波清洗器（昆山市超声仪器有
限公司），ＡＧＢＰ２１０Ｓ１／１万电子天平（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司），
ＡＢ１３５Ｓ１／１０万电子天平（瑞典 ＭｅｔｌｅｒＴｏｌｅｄｏ公
司）。
对照品灵芝酸 Ｃ２、灵芝烯酸 Ａ、灵芝酸 Ａ和灵
芝酸Ｄ为本实验室自制［５］，以峰面积归一化法计算
其纯度均大于９９０％；赤芝药材共１３批，经沈阳药
科大学药用植物教研室孙启时教授鉴定为多孔菌科
灵芝属真菌赤芝 Ｇ．ｌｕｃｉｄｕｍ的干燥子实体。甲醇、
乙腈和磷酸为色谱纯，水为二次重蒸水。
２ 方法与结果
２．１ 色谱条件 ＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８色谱柱（４６ｍｍ×２５０
ｍｍ，５μｍ）；流动相 Ａ相为乙腈，Ｂ相为００３％磷
酸水溶液；梯度洗脱程序：０～３５ｍｉｎ，３２％～３３％Ａ；
３５～３８ｍｉｎ，３３％～３７％Ａ；３８～６０ｍｉｎ，３７％ ～４０％
Ａ；６０～６５ｍｉｎ，４０％Ａ；流速１０ｍＬ·ｍｉｎ－１；检测波
长２５２ｎｍ；柱温３５℃；进样量２０μＬ。在此色谱条
件下，灵芝酸Ｃ２、灵芝烯酸Ａ、灵芝酸Ａ和灵芝酸 Ｄ
与相邻色谱峰分离度均大于１５，理论塔板数按灵
芝酸Ａ计算不低于５０００，拖尾因子在０９５～１０５。
色谱图见图１。
１．灵芝酸Ｃ２；２．灵芝烯酸Ａ；３．灵芝酸Ａ；４．灵芝酸Ｄ。
图１ 混合对照品（Ａ）和赤芝样品（Ｂ）ＨＰＬＣ图
２．２ 对照品溶液的制备 精密称取各对照品适量，
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第３４卷第１７期
２００９年９月
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ １７
Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２００９
分别置１０ｍＬ量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇
匀，制成灵芝酸Ｃ２、灵芝烯酸Ａ、灵芝酸Ａ和灵芝酸
Ｄ质量浓度分别为 ０５０，０７２，１１７和 ０５３ｍｇ·
ｍＬ－１的单一成分对照品储备液。精密量取上述储
备液各５０ｍＬ置同一２５ｍＬ量瓶中，用甲醇定容至
刻度，摇匀，制成灵芝酸 Ｃ２、灵芝烯酸 Ａ、灵芝酸 Ａ
和灵芝酸 Ｄ的混合对照品溶液，质量浓度分别为
１０００，１４４０，２３３４和１０６４ｍｇ·Ｌ－１。
２．３ 供试品溶液的制备 取赤芝药材粉末约１０
ｇ，精密称定，置具塞三角瓶中，加入三氯甲烷 ３０
ｍＬ，超声提取 ３０ｍｉｎ。提取液过滤后减压回收溶
剂，残渣用少量甲醇溶解定量转移至１０ｍＬ量瓶中，
并定容至刻度，摇匀，经０４５μｍ微孔滤膜过滤，取
续滤液，即得。
２．４ 线性关系考察 分别精密量取混合对照品溶
液０５，１０，１５，２０，３０，５０ｍＬ至１０ｍＬ量瓶中，
用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得系列对照品溶液。取
上述混合溶液各２０μＬ进样，在上述色谱条件下进
行分析。以对照品质量浓度 Ｘ（ｍｇ·Ｌ－１）为横坐
标，峰面积 Ｙ为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归
计算，结果表明，灵芝酸 Ｃ２、灵芝烯酸 Ａ、灵芝酸 Ａ
和灵芝酸Ｄ的回归方程分别为Ｙ＝１７１００Ｘ＋４２１３，
ｒ＝０９９９９；Ｙ＝３６４６０Ｘ＋５８４０，ｒ＝０９９９９；Ｙ＝
１６５７０Ｘ＋７１７３，ｒ＝０９９９９；Ｙ＝１７１００Ｘ＋７１４８，
ｒ＝０９９９８。灵芝酸Ｃ２、灵芝烯酸Ａ、灵芝酸Ａ和灵
芝酸Ｄ分别在５０～５００，７２～７２，１１６７～１１６７，
５３２～５３２ｍｇ·Ｌ－１线性关系良好。
２．５ 精密度试验 精密量取灵芝酸 Ｃ２、灵芝烯酸
Ａ、灵芝酸Ａ和灵芝酸Ｄ的混合对照品溶液，在上述
色谱条件下，连续进样６次，分别测定峰面积。灵芝
酸Ｃ２、灵芝烯酸Ａ、灵芝酸 Ａ和灵芝酸 Ｄ峰面积的
ＲＳＤ分别为１１％，１２％，０９％和１２％。表明仪
器精密度良好。
２．６ 重复性试验 精密称取同一样品６份，按２．３
供试品溶液制备项下方法操作，在２．１色谱条件下
进行分析测定，计算灵芝酸 Ｃ２、灵芝烯酸 Ａ、灵芝酸
Ａ和灵芝酸 Ｄ含量的 ＲＳＤ分别为 ２０％，１９％，
１７％和１７％。表明该方法的重复性良好。
２．７ 稳定性试验 取供试品溶液，室温下放置，分
别于０，２，４，６，８，１０，１２，２４ｈ测定，记录峰面积，结
果表明，供试品溶液在２４ｈ内稳定性良好，灵芝酸
Ｃ２、灵芝烯酸 Ａ、灵芝酸 Ａ和灵芝酸 Ｄ峰面积的
ＲＳＤ分别为１６％，０８％，１５％和１６％。
２．８ 回收率试验 取已知含量的赤芝药材约０５ｇ
共９份，精密称定，３份为一组，每组按低、中、高浓
度分别精密加入灵芝酸 Ｃ２、灵芝烯酸 Ａ、灵芝酸 Ａ
和灵芝酸Ｄ对照品溶液，按２．３供试品溶液制备项
下方法操作，在上述色谱条件下进样分析。计算回
收率，结果见表１。
表１ ４种三萜酸加样回收率（ｎ＝３）
成分 样品中量／μｇ 加入量／μｇ 回收率／％ ＲＳＤ／％
灵芝酸Ｃ２ ６５４７ ３２５０ ９７５ １３
６５０４ ６５００ ９８５ ２０
６４６１ ９７５０ １００３ １３
灵芝烯酸Ａ ５０８６ ２５２０ ９７８ １２
５０５２ ５０４０ ９９０ ２８
５０１８ ７５６０ １００６ １７
灵芝酸Ａ ３６２７ １８００ ９８２ １４
３６０３ ３６０６ ９９１ １４
３５７９ ５４０３ １０１３ １６
灵芝酸Ｄ １２５４ ６２２４ ９８７ ２２
１２４５ １２４５ ９７８ １０
１２３７ １８６７ ９９１ ２５
２．９ 样品的测定 取收集到的不同产地的赤芝干
燥药材粉末，按２．３供试品溶液制备项下操作，在上
述色谱条件下进行分析。１３批赤芝样品测定结果
见表２。
表２ 不同产地赤芝中４种三萜酸质量分数（ｎ＝３）
μｇ·ｇ－１
Ｎｏ． 产地 灵芝酸Ｃ２ 灵芝烯酸Ａ 灵芝酸Ａ 灵芝酸Ｄ
１ 贵州 ２５２８ １９５９ １１０４ ４５２９
２ 河南 １１３１ １０９７ ８７７ ４６９７
３ 山东 ２０７２ １４３９ ８５７ ２９３６
４ 广州 ２７３３ １２１２ １０９５ ４３６０
５ 云南 ９４２ １１４１ ７３２４ ２５１９
６ 陕西 ７３３ ９８３２ ７５６４ ４８１３
７ 西安 ９５６ １１９８ ８０２ ３９６９
８ 河北 １２４９ ９４５ ９３０ ４９９８
９ 江西１ １４５２ １１６２ １０２９ ５２４６
１０ 江西２ １７０２ １３６８ ８６７ ３６５６
１１ 吉林１ ８０７ ９８３ ７０５７ ３４７４
１２ 吉林２ １３０１ １０１０ ７２０５ ２４９０
１３ 吉林３ ８８７ ２１２８ ７８５９ ２９１０
３ 讨论
３．１ 样品的处理 本实验首先分别比较了乙醇、甲
醇、三氯甲烷和三氯甲烷甲醇等不同提取溶剂，结
果表明，乙醇、甲醇和三氯甲烷甲醇提取后得到的
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图谱极性部分提取量较大，对三萜类成分测定影响
大；三氯甲烷提取后可消除极性较大部分的干扰，而
三萜类成分色谱峰明显，因此确定提取溶剂为三氯
甲烷。又进一步比较了超声振荡提取和加热回流提
取两种方法，结果表明两种方法提取得到的待测物
含量无明显差别，因超声提取法更为简便，且不易破
坏有效成分，适合大量样品的快速提取，最终确定采
用超声振荡提取法。在此基础上，设计正交试验 Ｌ９
（３４）对三氯甲烷溶液超声提取工艺条件进行优选，
考察提取溶剂倍量、提取时间和提取次数３因素的
３个水平。结果表明，最佳提取方法为加入３０倍量
三氯甲烷，超声提取１次，３０ｍｉｎ。
３．２ 色谱条件的优化 由紫外光谱图可知，灵芝酸
Ｃ２、灵芝烯酸Ａ、灵芝酸 Ａ和灵芝酸 Ｄ均在２５２ｎｍ
有最大吸收，故选择２５２ｎｍ作为检测波长。本实验
比较了文献报道的多种流动相系统：甲醇醋酸水溶
液系统、乙腈醋酸水溶液系统等［６８］，但样品中待测
成分与相邻色谱峰的分离度均较差，经过反复多次
试验，最终确定了以乙腈００３％磷酸水溶液为流动
相进行梯度洗脱，可使待测成分得到满意的分离，其
中加入００３％磷酸可抑制色谱峰拖尾。
３．３ 测定结果 本实验采用 ＲＰＨＰＬＣ法测定了
１３批不同产地的赤芝药材中４种灵芝三萜酸的含
量。结果表明，灵芝酸Ｃ２、灵芝烯酸Ａ、灵芝酸Ａ和
灵芝酸Ｄ为不同产地赤芝药材的共有成分，虽然不
同产地的赤芝中４种三萜酸含量差异较大，但是所
有药材均以灵芝酸 Ａ的含量最高，灵芝酸 Ｄ次之；
灵芝酸Ｃ２、灵芝烯酸Ａ含量相对较低。
［参考文献］
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ＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓＨＰＬＣｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｆｏｕｒｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄａｃｉｄｓｉｎ
Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍ
ＺＨＡＯＪｉａ１，ＣＨＥＮＸｉａｏｈｕｉ２，ＢＩＫａｉｓｈｕｎ２
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭａｄｉｃａ，ＳｈｅｎｙａｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１００１６，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＳｈｅｎｙａｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１００１６，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅ４ｋｉｎｄｓｏｆｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄａｃｉｄｓｉｎＧａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍ，ｎａｍｅｌｙｇａｎｏｄｅｒｉｃａｃｉｄＣ２，ｇａｎｏｄｅ
ｒｅｎｉｃａｃｉｄＡ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃａｃｉｄＡａｎｄｇａｎｏｄｅｒｉｃａｃｉｄＤｑｕａｎｔｉｔｉｖｅｌｙ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＴｈｅＲＰＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄｗａｓａｐｐｌｉｅｄａｎｄｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｗａｓ
ｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｎａＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８ａｎａｌｙｔｉｃａｌｃｏｌｕｍｎ（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）．Ｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｗａｓａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（Ａ）ｗａｔｅｒｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
００３％Ｈ３ＰＯ４（Ｂ）ｗｉｔｈｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎｍｏｄｅａｔｔｈｅｆｌｏｗｒａｔｅｏｆ１０ｍＬ·ｍｉｎ
－１．Ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｓｓｅｔａｔ２５２ｎｍ，ａｎｄｔｈｅｃｏｌｕｍｎ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ３５℃．Ｒｅｓｕｌｔ：ＴｈｅｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅｓｏｆｇａｎｏｄｅｒｉｃａｃｉｄＣ２，ｇａｎｏｄｅｒｅｎｉｃａｃｉｄＡ，ｇａｎｏｄｅｒｉｃａｃｉｄＡａｎｄｇａｎｏｄｅｒｉｃａｃｉｄＤ
ｗｅｒｅ５０５００μｇ·ｍＬ－１（ｒ＝０９９９９），７２７２ｍｇ·Ｌ－１（ｒ＝０９９９８），１１６７１１６７ｍｇ·Ｌ－１（ｒ＝０９９９９），５３２５３２ｍｇ·
Ｌ－１（ｒ＝０９９９６），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ（ｎ＝９）ｗｅｒｅ９８８％ （ＲＳＤ１５％），９９１％ （ＲＳＤ１９％），９９５％ （ＲＳＤ
１４％），９８５％ （ＲＳＤ１９％），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｉｓｓｉｍｐｌｅａｎｄａｃｃｕｒａｔｅｗｉｔｈａｇｏｏｄｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｃａｎｂｅ
ｕｓｅｄａｓａｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒＧ．ｌｕｃｉｄｕｍｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｓｏｕｒｃｅｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍ；ｇａｎｏｄｅｒｉｃａｃｉｄＣ２；ｇａｎｏｄｅｒｅｎｉｃａｃｉｄＡ；ｇａｎｏｄｅｒｉｃａｃｉｄＡ；ｇａｎｏｄｅｒｉｃａｃｉｄＤ；ＨＰＬＣ
［责任编辑 王亚君］
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