全 文 :当归多糖协同 Epo对造血干/祖细胞 JAK2/STAT5
信号传导通路的影响
华自森,宋姝丹,罗春燕,王建伟,王亚平
(重庆医科大学,1干细胞与组织工程研究室,2组织学与胚胎学教研室,重庆 400016)
[摘要] 目的:探讨当归多糖(APS)对调控红系血细胞增殖分化有关的细胞内JAK2/STAT5信号传导通路的影响,阐述
当归多糖促进血细胞发生的可能机制。方法:分离纯化胎儿脐带血单个核细胞,在常规体外培养体系加入 APS(200mg·
L-1)作用细胞24h,促红细胞生成素(Epo)分别刺激0,2,5,30min,免疫细胞化学与激光共聚焦显微镜观察细胞STAT5的表
达;Westernbloting增强化学发光法检测细胞JAK2与浆和核中 STAT5的表达。结果:APS协同 Epo对 STAT5的表达影响显
著,对照组与APS组在4个时间点STAT5的表达水平有显著差异,JAK2、细胞浆和核中 STAT5表达较对照组显著增加,且在
Epo刺激5min时表达最强。结论:APS能协同Epo促进造血细胞增殖分化,其机制与影响细胞内的JAK2/STAT5信号传导通
路有关。
[关键词] 当归多糖;单个核细胞;造血;STAT5;JAK2;促红细胞生成素
[收稿日期]
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(30572429)
[通信作者] 王亚平,Email:ypwangcq@yahoocn
[作者简介] 华自森,Email:zisen526@yahoo.cn
在有外源性造血生长因子(Epo,GMCSF,IL
3等)存在的条件下,当归多糖(angelicapolysac
charides,APS)对小鼠造血干细胞(CFUS)和小
鼠与人髓系造血祖细胞(BFUE,CFUE,CFU
GM,CFUMK)的增殖分化有显著促进作用,具有
类似造血生长因子样活性[12]。但 APS对血细胞
调控的分子生物学机制迄今尚不清楚。近年来
研究表明,很多细胞生长因子通过调节 JAK/
STATs信号传导通路影响细胞的增殖与分化过
程。本研究在既往工作基础上,探讨了经 APS作
用后脐带血造血干细胞和造血祖细胞内 JAK2与
STAT5的表达变化,旨在阐述当归多糖调控血细
胞发生的信号传导机制。
1材料
11 药品 当归多糖由重庆医科大学药学院从甘
肃岷县当归中分离、提取,纯度 >90%,以 RPMI
1640培养液配制成所需浓度,正压过滤除菌。
12 脐血单个核细胞的分离纯化 用密封式无菌
采血袋采集正常足月妊娠分娩胎儿脐带血约40~
60mL,速送超净台将脐血移到广口瓶内,并加入等
体积的3‰明胶混匀、沉淀05h,吸取上清液放入
大离心管加入等体积的PBS洗3遍,用PBS将血细
胞制成悬液,准备小离心管每管加入5mLFicol,每
只小离心管加入2mL血细胞悬液,2500r·min-1
高速离心25min,吸取云雾状单个核细胞沉淀,PBS
洗1遍,用RPMI1640将细胞制成悬液并计数备用。
13 试剂 RPMI1640培养基(美国 GIBICO公
司);小牛血清(杭州四季青公司);兔抗人 Anti
JAK2抗体相对分子量130、兔抗人AntiSTAT5相对
分子质量90;PI(CelSignaling公司);FITC标记山
羊抗兔IgG、山羊抗兔辣根过氧化物酶标记的 IgG
抗体(SantaCruz公司);DAB显色试剂盒(中山生物
试剂公司);actin抗体、通用型 SP系列工作液试剂
盒(中杉金桥公司);PageRuler?PrestainedProtein
Ladder(FermentasInc),PVDF膜(美国 DUPONT公
司);Nuclear/CytosalFractionationKit、全细胞蛋白提
取液 (BioVisionInc);Westernbloting凝胶试剂盒、
Western荧光检测试剂(碧云天)。
2 方法
21 实验分组 对照组,常规培养细胞24h;APS
组,常规培养基础上加入APS(200μg·mL-1)培养
24h,2组细胞培养结束后分别加入 Epo刺激0,2,
5,30min,收集细胞。
22 免疫细胞化学检测 STAT5的表达 选择实验
组与对照组经 EPO刺激0,5min的细胞,500r·
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min-1离心5min收集细胞,PBS洗3次,每次5min。
4%多聚甲醛固定15min,调节细胞密度为1×106
个/mL,甩片备用。采用通用型SP系列工作液试剂
盒检测STAT5在细胞内的分布,操作步骤按照试剂
盒使用说明进行,封片,观察并采集图片。
23 激光共聚焦扫描显微镜观察 STAT5的表达
制片过程同上,05%小牛血清室温封闭05h,加入
1‰TritonPBS稀释的一抗 STAT5抗体,4℃过夜,
PBS洗涤3次,加入 FITC标记的二抗1:100(pH=
74的PBS稀释),4℃ 放置15h,PI复染3s,PBS
洗涤后封片,激光共聚焦扫描显微镜(MRC1024
BioRad,Watford,UK)观察采图。
24 Westernbloting增强化学发光法)检测 JAK2、
STAT5的表达 ①蛋白提取:以2×106个/mL体系
培养每组细胞。按BioVision公司的Nuclear/Cytosol
FractionationKit操作步骤提取细胞质和细胞核蛋
白;Bradford法测定蛋白浓度,用相应的蛋白提取液
将各组蛋白总蛋白浓度调整一致。②Westernblot
ting:取各组样品各20μL与等体积2倍上样缓冲液
混匀,煮沸5~10min使蛋白变性,SDSPAGE电泳
(积层胶60V,分离胶80V),电转到硝酸纤维素膜
上,电转2h,恒流250mA。5%脱脂奶粉室温封闭2
h,加入兔抗人 STAT5一抗和 actin抗体(1∶500),4
℃过夜,洗膜数次,加入辣根过氧化物酶标记的 IgG
二抗(1∶500),室温孵育30min,洗膜数次,按说明
加入 Western荧光检测试剂,然后用高敏感光胶片
曝光,自显影而确定抗原抗体抗体在硝纤膜上的
位置。采用QuantityOne440图像分析软件进行
光密度值分析比较。
25 统计学处理 所有数据以 珋x±s表示,采用
SAS统计软件进行重复测量资料的方差分析。P<
005为差别有统计学意义。
3 结果
31 APS对单个核细胞表达 STAT5的影响 经
APS(200mg·L-1)作用后,脐血单个核细胞胞核中
STAT5较对照组增多,经 Epo刺激5min细胞浆和
核中STAT5的表达较0min增多(图1)。
32 激光共聚焦显微镜观察APS对STAT5表达的
影响 经 APS(200mg·L-1)作用后,脐血单个核
细胞的细胞浆和核中STAT5的表达较对照组增强,
两组细胞中Epo刺激5min时 STAT5表达较0min
增强(图 2)。
A0min对照组;B0minAPS组;C5min对照组;
D5minAPS组。
图1 APS对脐血单个核细胞表达STAT5
的影响 (ICC×1000)
1绿色荧光为细胞内表达的STAT5;2红色荧光表示PI
复染的细胞核;3图1和2的合成图;A0min对照组;
B0minAPS组;C5min对照组;D5minAPS组。
图2 APS对脐血单个核细胞表达STAT5的影响
(LCSM,Bar=375μm)
33 WesternblotingECL法检测 APS对 JAK2、
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STAT5表达的影响 Epo刺激不同时间,对照组与
APS组STAT5表达有差异(P<001),药物与时间
点有交互作用(P<001)。综合表1组间差别的检
验结果和时间水平的变化趋势,对照组与 APS组的
主效应有差别(P<005)。APS协同 Epo对 STAT5
的表达影响显著,对照组与 APS组在 4个时间点
STAT5的表达水平有显著差异(图3,表1)。
A对照组和APS组中JAK2、细胞浆中STAT5的表达;
B对照组和APS组细胞核中STAT5的表达;1~4泳道0,
2,5,30min对照组;5~8泳道0,2,5,30minAPS组。
图3 APS对JAK2、细胞浆和核中STAT5表达的影响
(WesternblotingECL)
4 结论与讨论
既往研究证明,APS能直接和/或间接途径诱导
造血微环境中的基质细胞、淋巴细胞等分泌造血生
长因子如GMCSF,IL3,IL6,Epo等,进而促进造血
干祖细胞增殖分化等过程[3]。近年研究表明,多数
造血生长因子通过 JAK/STATs信号通路调节血细
胞的增殖与分化[4]。STATs蛋白作为EpoEpoR信
号传导的下游分子,在红细胞生成调控中起了重要
作用,红系祖细胞膜上的 EpoR与 Epo结合后被激
活,STATs与EpoR上磷酸化的酪氨酸结合,并且自
身发生酪氨酸磷酸化,这导致二聚体形成并转位于
细胞核,然后启动把基因转录,从而调节红细胞的生
存、增殖、分化与凋亡。STAT5是 STATs家族的重
要成员,是 Epo敏感蛋白,潜伏于胞质内能被 Epo
激活,在正常和白血病造血系统中,作为 EpoEpoR
下游分子对原始造血干祖细胞的维持和扩增是必需
的[5]。
本实验结果显示:经 APS(200mg·L-1)作用
后,脐血单个核细胞的 JAK2和细胞浆和核中
STAT5的表达较对照组各时间点均增多,而 Epo刺
激5min,实验组与对照组造血细胞中JAK2、浆和核
表1 APS对JAK2,STAT5表达的影响(珋x±s,n=3)
蛋白
0min 2min 5min 30min
对照组 APS组对照组 APS组 对照组 APS组 对照组 APS组
JAK 20186±00060292±00202)0260±00150324±00012)0294±00180479±00052)0249±00060034±00171)
浆中STAT5 0223±00110264±00002)0204±00000282±00162)0266±00000468±00432)0203±00010286±00111)
核中STAT5 0050±00000055±00002)0050±00002)0060±00002)0058±00000068±00002)0059±00000061±00002)
注:与对照组相比1)P<005,2)P<001。
中STAT5表达最强。EpoEpoRJAK2STAT5途径
是促进红系造血的主要途径,结果提示,APS能协同
Epo促进红系造血相关的信号传导因子 JAK2、
STAT5表达,且在Epo刺激5min时最强。为何Epo
刺激5min时JAK2,STAT5表达最强呢?APS能否
影响细胞膜上 EpoR的表达?对 STAT1和 STAT3
的表达是否也有影响?这还有待于进一步研究证
明。Giacomo等[6]在观察人原始红细胞分化中发现
在前体红细胞分化成熟过程中,在嗜碱性、多色性和
正色性有核红细胞阶段都可以检测到 STAT1表达,
STAT5和它的靶基因 BCLXL,IRF1从嗜碱性到多
色性阶段持续表达,而在正色性有核红细胞阶段起
表达降低;而STAT3表达从嗜碱性有核红细胞阶段
就开始降低。这表明 stat1,stat3,stat5作为红细胞
EpoR下游区的信号分子,可能分别在红细胞发育
的各阶段发挥其重要作用,从而调节红细胞的生存、
增殖、分化与凋亡。RaneSG,ReddyEP[7]发现
STAT5还可作为祖红细胞表面EpoR下游区抗凋亡
信号子发挥抗凋亡作用,而维持祖红细胞的生存。
由此可见,APS协同 Epo刺激造血细胞过程中,
JAK2,STAT5表达增加对细胞生存、增殖、分化与凋
亡具有积极意义;APS组未加入 Epo也能增强
JAK2、STAT5的表达,尚不能肯定 APS单独应用即
能启动JAK2酪氨酸磷酸化,因为实验在用 Epo刺
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激前未使细胞处于饥饿状态,血清中的少量细胞因
子可能对细胞增殖有影响。
综上所述,当归多糖调控血细胞发生的机制与
其对JAK2、STAT5表达影响密切相关。目前造血干
细胞移植已成为治疗某些血液病、恶性肿瘤、遗传性
疾病和自身免疫性疾病的有效方法之一,但在临床
细胞移植实践中尚存在很多问题如优化治疗流程、
改造体内造血微环境、提高造血干细胞动员等问题
需要解决,而能解决这些问题的多靶点多效应药物
甚少,APS具有多靶点多效应的生物学功效,研究
APS体外调控造血的信号传导途径,为指导其临床
合理应用和提高造血干细胞体外动员提供实验依据
具有重要意义。
[参考文献]
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esis[J]Oncogene,2002,21:3334
EfectofangelicapolysaccharidescoerythropoietinonJAK2/STAT5signal
transductionpathwayinhematopoieticstem/progenitorcels
HUAZisen,SONGShudan,LUOChunyan,WANGJianwei,WANGYaping
(LaboratoryofStemCelandTisueEngineering,DepartmentofHistologyandEmbryology,
ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)
[Abstract] Objective:ToinvestgatethesignaltransductionandregulationinerythropoiesisbyAngelicapolysaccharides(APS)
toclarifythemechanismforAPSpromotinghematopoiesis.Method:Toisolatemononuclearcelsfromfoetusumbiliccordblood(Mono
nuclearcels,MNCs),AfterMNCswereincubatedinthepresenceofAPSgroup(APS200mg·L-1)andcontrolgroupfor24h,the
celswerestimulatedwithEpo(5IU/mL)for0,2,5,30min;STAT5wasmeasuredbyICCandlaserconfocalscanningmicroscope,
JAK2、STAT5innucleusandcytoplasmweremeasuredbywesternblotingECLineachgroupatdiferentgroupsResult:Angelica
polysaccharidecooperatedEpohavesignificantimpactontheexpressionofSTAT5,expressionofSTAT5havesignificantdiferencebe
tweenAPSgroupandthecontrolgroupat4timepoints,JAK2、STAT5expressedincytoplasmandnuclearofAPSgroupincreasedsig
nificantlythanthatofcontrolgroup,andtheyexpressedthestrongestat5minConclusion:JAK2,STAT5signaltransductionmole
culeplaysanimportantroleintheefectofAPScooperatedwithEpoonpromotinghematopoiesis
[Keywords] Angelicapolysaccharides(APS);mononuclearcels(MNCs);hematopoiesis;STAT5;JAK2;erythropoietin
(Epo)
[责任编辑 吕冬梅]
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