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HPLC-ELSD fingerprint and chemical constituents of Rhizoma Panacis Japonici

竹节参HPLC-ELSD指纹图谱和化学成分分析



全 文 :竹节参 HPLCELSD指纹图谱和化学成分分析
胡远浪,袁丁,何毓敏,王洪武,孙志伟,张长城
(三峡大学 医学院,湖北 宜昌 443002)
[摘要] 目的:建立竹节参药材HPLCELSD液相指纹图谱,分离纯化鉴定其主要特征峰的单体化合物,客观评价竹节参
内在质量差异。方法:采用高效液相色谱蒸发光散射检测器(HPLCELSD),梯度洗脱,测定了10批竹节参样品。色谱条件为
YMCpackODSAQ色谱柱(46mm×250mm,5μm),乙腈(A)05%乙酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱(0~5min,20% ~
40%A;5~20min,40%~40%A),流速为10mL· min-1,柱温30℃。ELSD检测器:漂移管温度为40℃,氮气释放压力为
33Psi。通过采用反复硅胶柱色谱和半制备HPLC的方法分离纯化竹节参的化学成分,并根据理化性质和波谱数据进行结构
鉴定。结果:建立了10批竹节参样品HPLCELSD指纹图谱,分离纯化鉴定了5个主要化学成分,分别为人参皂苷Re,竹节参
皂苷Ⅳ,Ⅳa,Ⅴ,Pjs2。结论:综合竹节参指纹图谱和化学成分分析,能较全面的表征不同产地竹节参内在成分的差异,为竹节
参内在质量评价提供依据。
[关键词] 竹节参;HPLCELSD;指纹图谱;化学成分
[收稿日期] 20091209
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30873383)
[通信作者] 张长城,博士,副教授,Tel:(0717)6397501,Email:
greatwal@ctgueducn
  竹节参RhizomaPanaxJaponicus系五加科人参
属植物竹节参 PanaxjaponicusCAMey的竹鞭
状根茎,具有滋补强壮、散瘀止痛、止血祛痰等功
效[1]。其原植物主要分布于长江以南,西起云南西
部,东至日本的广泛区域,在我国主要产于云南、四
川、湖北、贵州等省。目前在我国鄂西地区已实现人
工种植。竹节参化学成分以齐墩果烷型皂苷为主,
尚有少量达玛烷型皂苷,另含有竹节参多糖、挥发油
等。日本学者从竹节参的根茎提取物中分离得到竹
节参皂苷Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅰb,Ⅰa,Ⅳa及甾体皂苷 P[2]。
蔡平[23]等从四川产竹节参根茎提取物中分离得到
Pjs1,Pjs2,Pjs3,Pjs4,Pjs6等5种皂苷单体。有
关竹节参药材的质量控制方法,本课题组曾报道了
对其苷元齐墩果酸的含量测定[4]。本文建立了竹
节参药材的HPLCELSD指纹图谱,并对指纹图谱主
要特征峰成分进行分离纯化和结构鉴定,旨在为竹
节参的质量分析提供有价值的参考。
1 材料
Waters600E液相色谱仪,2424ELSD检测器,
EMPOWER色谱工作站;Gilson半制备型高效液相
(305,306pump,806manometricmodule;Dynamax
modelUV1检测器);AB204N电子天平;KQ250B
型超声波清洗器;INOVA600型核磁共振仪(TMS
内标);LCQadvantage型ESIMS质谱测定仪。
柱色谱所用试剂均为分析纯,高效液相色谱所
用试剂为色谱纯,柱色谱及薄层色谱硅胶均为青岛
海洋化工厂产品,水为双重蒸馏水。
竹节参药材由三峡大学医学院中药学教研室谭
复成教授鉴定为五加科人参属植物竹节参 Pja
ponicus的干燥根茎,其来源见表1。
表1 竹节参药材的来源
No 产地来源 No 产地来源
S1 四川峨眉(野生品) S6 湖北神农架(野生品)
S2 湖北恩施(栽培品) S7 四川汶川(野生品)
S3 湖北恩施(野生品) S8 湖北五峰(栽培品)
S4 陕西秦岭(野生品) S9 湖北五峰(野生品)
S5 云南邵通(野生品) S10 四川雅安(野生品)
2 方法与结果
21 色谱条件
YMCPackODSAQ色谱柱(46mm ×250
mm,5μm),流动相为乙腈(A)05%乙酸水溶液
(B)梯度洗脱[0~5min,20% ~40%A;5~20min,
40%~40%A],流速为10mL·min-1,柱温为30
℃。ELSD检测器;氮气压力为33Psi;漂移管温度
40℃。进样量10μL。
22 供试品溶液的制备
竹节参药材粉碎,过4号筛,取约05g,精密称
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定,置具塞锥形瓶中,精密加入60%甲醇50mL,称
定质量,超声提取30min后,加60%甲醇补足减失
的质量,摇匀,过滤,取续虑液即得。
23 指纹图谱的建立
231 测定方法 精密吸取对照品溶液与供试品
溶液各10μL,按21项色谱条件分析得到色谱图,
考察60min供试样品的色谱分离情况,记录 200
min色谱图。
图1 竹节参药材S2样品的HPLC图
232 精密度考察 精密称取 S2号样品 1份,
按22项下方法制备供试品溶液,按 21项色谱
条件进行分析,连续进样 5次,考察色谱峰保留
时间和峰面积的一致性,结果各主要色谱峰的相
对保留时间 RSD为006% ~13%,相对峰面积
RSD为26% ~44%,说明仪器精密度良好,符
合指纹图谱要求。
233 稳定性考察 精密称取 S2号样品1份,按
22项下方法制备供试品溶液,按21项色谱条件
进行分析,分别在0,4,8,12,24,36h进样。结果表
明,各主要色谱峰的相对保留时间RSD为005%~
014%,相对峰面积 RSD为16% ~46%,表明供
试品溶液在常温下 36h内较稳定,符合指纹图谱
要求。
234 重复性考察 精密称取 S2号样品5份,按
22项下方法制备供试品溶液,按21项色谱条件
进行分析。结果表明,各主要色谱峰的相对保留时
间 RSD为 004% ~013%,相对峰面积 RSD为
31%~48%,表明方法重复性较好,符合指纹图谱
要求。
24 结果
241 竹节参药材的HPLCELSD指纹图谱 通过
考察色谱柱、流动相、柱温,以及 ELSD检测器的漂
移管温度、雾化气体流速(以氮气压力表示)等条件
参数对色谱分离效果的影响后优化所得色谱图见图
1。通过比较其色谱图的检测结果,确定特征峰为9
个。因6号峰峰面积较大,且较稳定,后鉴定为竹节
参皂苷Ⅴ,为竹节参中的代表成分之一,选其为参比
峰,标为s,以其各色谱峰对参比峰的相对保留时间
和相对峰面积定性。
242 系统聚类分析结果 对10批竹节参药材样
品HPLCELSD图谱中的9个特征峰的峰面积数据
进行量化,得到9×10阶原始数据,运用 SPSS100
软件对其进行系统聚类分析,采用组间距法,利用夹
角余弦距离作为样品的测度,见图2。由此确实10
批样品大致可以分为 2类,第Ⅰ类为 S6~S10,其
HPLCELSD指纹图谱重叠图见图 3;Ⅱ类为 S1~
S5,其HPLCELSD指纹图谱重叠图见图4。聚类谱
系图见图2。
图2 10批竹节参药材样品的聚类树状图
图3 第Ⅰ类竹节参样品的HPLCELSD指纹图谱
图4 第Ⅱ类竹节参样品的HPLCELSD指纹图谱
25 指纹图谱主要色谱峰化学成分分析
251 提取分离 因恩施产竹节参(S2号样品)色
谱峰相对较多,且有大面积的种植,所以对其进行化
学成分分离。恩施产竹节参(S2号样品)5kg,碾
碎,60%乙醇回流提取3次,每次2h,合并提取液,
减压浓缩,所得浸膏悬浮于水,依次用石油醚、乙酸
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乙酯、正丁醇萃取,得正丁醇萃取物750g。取正丁
醇萃取物240g溶于水,过D101大孔树脂,依次用水,
30%,60%,90%乙醇冲洗,取 60%洗脱部位(195
g),经硅胶柱色谱分离,采用氯仿甲醇(7∶3~1∶1)
梯度洗脱,得6部分(Fr1~Fr6),Fr1经硅胶柱色
谱,以氯仿甲醇水(8∶2∶025,7∶3∶05)梯度洗脱,
得两部分(Fr1a和Fr1b)。Fr1a经半制备高效液
相色谱分离,流动相为乙腈005%乙酸水(7∶18),
得化合物1(12mg);Fr1b采用半制备高效液相色
谱分离,流动相为乙腈005%乙酸水(19∶31),得化
合物2(70mg)和化合物3(36mg)。Fr6采用半制
备高效液相色谱分离,流动相为乙腈005%乙酸水
(7∶13),得化合物4(74mg)和化合物5(64mg)。
252 竹节参HPLCELSD指纹图谱特征峰的指认
 比较竹节参 HPLCELSD指纹图谱特征峰和分离
得到的化合物HPLCELSD图谱的保留时间,指纹图
谱中1,6~9号色谱峰分别为化合物1,4~5,2~3。
253 结构鉴定
化合物 1 白色粉末,1HNMR(C5D5N,600
MHz)δ:644(1H,d,J=72Hz,RhaH1),557
(1H,brs,H24),523(1H,d,J=65Hz,GlcH1),
515(1H,J=77Hz,GlcH1),201(3H,s,H
21),175(3H,d,J=62Hz,H6),160(6H,s,H
26,H27),158,135,118,097,095(each3H,s,
5×CH3);经HPLC与对照品对照和参考文献[5]鉴
定化合物1为人参皂苷 Re。
化合物 2 白色粉末,ESIMSm/z925[M-
H]-。1HNMR(C5D5N,600MHz)δ:633(1H,d,
J=84Hz,GlcH1),617(1H,brs,1H,AraH1),
542(1H,s,H12),502(1H,d,J=36Hz,GlcAH
1),333(1H,dd,J=108,36Hz,H3),319(1H,
dd,J=138,36Hz,H18),129(6H,s,2×CH3),
109,098,092,089,083(each3H,s,5×
CH3),
13CNMR(C5D5N,150MHz)数据见表2。化
合物2的 ESIMS,1HNMR,13CNMR数据与文献报
道[3]的基本一致,故鉴定为竹节参皂苷Ⅳ。
化合物 3 白色粉末,ESIMSm/z793[M-
H]-。1HNMR(600MHz,C5D5N)δ:634(1H,d,
J=78Hz,GlcH1),542(1H,brs,H12),504
(1H,d,J=78Hz,GlcAH1),337(1H,brd,J=
99Hz,H3),319(1H,dd,J=102,24Hz,H
18),131,128,106,100,091,089,083(each
3H,s,7×CH3)。
13CNMR(C5D5N,150MHz)数据见
表2。化合物 3的1HNMR,13CNMR数据与文献
[6]报道的基本一致,故鉴定为竹节参皂苷Ⅳa。
化合物 4 白色粉末,ESIMSm/z955[M-
H]-。1HNMR(C5D5N,600MHz)δ634(1H,d,J=
78Hz,GlcH1),542(1H,brs,H12),541(1H,
s,GlcH1),502(1H,d,J=66Hz,GlcAH1),
328(1H,dd,J=114,42Hz,H3),318(1H,dd,
J=132,24Hz,H18),128,126,111,109,
091,088,083(each3H,s,7×CH3)。
13CNMR
(C5D5N,150MHz)数据见表 2。化合物 4的
1H
NMR,13CNMR数据与文献报道[7]的基本一致,故
鉴定为竹节参皂苷Ⅴ。
化合物 5 白色粉末,ESIMSm/z925[M-
H]-。1HNMR(C5D5N,600MHz)δ:633(1H,d,
J=84Hz,GlcH1),542(1H,brs,H12),528
(1H,d,J=60Hz,XylH1),499(1H,d,J=30
Hz,GlcAH1),329(1H,brd,J=84Hz,H3),
320(1H,brd,J=108Hz,H18),129(6H,s,2×
CH3),110,110,092,089,085(each3H,s,5×
CH3)。
13CNMR(C5D5N,150MHz)数据见表2。化
合物5的1HNMR,13CNMR数据与文献报道[3]的基
本一致,故鉴定为pjs2。
3 讨论
本实验采用 HPLCELSD对竹节参药材进行分
析,并对10批竹节参进行了系统聚类分析。根据系
统聚类分析可大致将竹节参分为2类,比较这两类
竹节参的指纹图谱,发现其化学成分组成和共有峰
的峰面积存在较大的差异。相对第Ⅱ类样品,第Ⅰ
类样品的指纹图谱多数缺失3~5,7号峰,而且8,9
号峰的峰面积明显降低,提示2类药材质量间存在
差异。为了进一步明确两类竹节参内在质量的差
异,对竹节参指纹图谱1,5~8号特征峰对应的成分
进行了分离纯化和结构鉴定,分别为人参皂苷 Re,
竹节参皂苷Ⅴ,Pjs2,竹节参皂苷Ⅳ,Ⅳa。相对第Ⅱ
类竹节参样品,第Ⅰ类样品中竹节参皂苷Ⅴ含量较
高,而人参皂苷 Re,Pjs2,竹节参皂苷Ⅳ,Ⅳa的含
量明显降低。两类药材之间主要成分的差异对药效
的影响,有待进一步研究。作者将通过系统的竹节
参谱效关系研究,明确竹节参药效密切相关的指纹
峰,以此作为评价竹节参质量的特征峰,建立竹节参
标准指纹图谱将更加合理和科学。
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表2 化合物2~5的13CNMR数据(C5D5N,150MHz)
No 齐墩果酸 2 3 4 5 No 2 3 4 5
C1 389 374 386 374 375 3OGlcAC1′ 1058 1072 1041 1040
C2 280 253 266 254 254 C2′ 742 755 816 823
C3 779 880 890 883 881 C3′ 750 777 759 761
C4 392 383 395 383 384 C4′ 775 735 721 720
C5 557 545 557 546 546 C5′ 753 781 766 766
C6 187 173 185 173 173 C6′ 1718 1727 1717 1714
C7 332 320 331 320 320 GlcC1″ 1048
C8 396 387 399 387 387 C2″ 767
C9 481 468 480 468 468 C3″ 771
C10 373 357 369 357 357 C4″ 699
C11 237 222 234 222 222 C5″ 761
C12 1224 1217 1229 1217 1217C6″ 610
C13 1446 1429 1441 1429 1429 XylC1″ 1058
C14 421 409 421 409 409 C2″ 754
C15 282 270 282 269 267 C3″ 770
C16 237 225 237 225 225 C4″ 699
C17 465 458 470 458 458 C5″ 663
C18 418 405 417 405 405 AraC1″ 1074
C19 465 450 462 450 450 C2″ 813
C20 309 296 308 296 296 C3″ 757
C21 342 328 340 328 328 C4″ 864
C22 332 319 325 313 313 C5″ 610
C23 287 271 283 271 271 28OGlcC1 945 958 946 946
C24 163 158 170 155 152 C2 729 741 729 729
C25 155 143 155 143 144 C3 781 793 781 781
C26 173 163 175 163 163 C4 699 711 705 699
C27 261 249 261 249 249 C5 781 789 777 777
C28 1799 1753 1765 1753 1753 C6 610 622 615 601
C29 332 320 332 315 320
C30 237 226 238 226 226
[参考文献]
[1] 中国药典一部[S]2005:93
[2] 蔡平,肖倬殷,魏均娴竹节参化学成分的研究[J]中草药,
1982,13(3):1
[3] 蔡平,肖倬殷,魏均娴竹节参化学成分的研究(Ⅱ)[J]中
草药,1984,15(6):1
[4] 袁丁,何毓敏,鲁科明,等竹节参中总皂苷和三萜苷元齐墩
果酸的测定[J]华西药学杂志,2008,23(6):692
[5] 苏健,李海舟,杨崇仁吉林产西洋参的皂苷成分研究[J]中国
中药杂志,2003,28(9):830
[6] 谢光,姜勇,雷连娣,等猫儿刺叶中的三萜皂苷类成分[J]
中国天然药物,2009,7(3):206
[7] 孟大利,李铣,熊印华,等中药牛膝中化学成分的研究[J]
沈阳药科大学学报,2002,19(1):27
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HPLCELSDfingerprintandchemicalconstituentsof
RhizomaPanacisJaponici
HUYuanlang,YUANDing,HEYumin,WANGHongwu,SUNZhiwei,ZHANGChangcheng
(MedicalColegeofChinaThreeGorgesUniversity,Yichang443002,China)
[Abstract] TheaimwastoestablishthechromatographicfingerprintofRhizomaPanacisJaponiciforitsqualityevaluation.
AnalysiswasperformedonaYMCPackODSAQcolumn(46mm×250mm,5μm)elutedwiththemobilephasesofacetonitrile(A)
and5% aceticacidsolution(B)atingradientaflowrateof10mL·min-1.Theelutionprogramwasasfolow:05min,changed
from20%Ato40%A,520min,kept40%A.Thetemperatureofcolumnwas30℃.Thetemperateofdrifttubewas40℃,andthe
nitrogenpressurewas33Psi.TenbatchesofRhizomaPanacisjaponiciweredetermined.TheHPLCELSDchromatographicfingerprint
ofchemicalconstituentswasestablishedfromthe10batchesofRhizomaPanacisjaponiciandithad9characteristiccommonpeaks.
The10batchesofsampleswereclassifiedinto2clusterbyclusteranalysis.Furthermore,fiveknownchemicalconstuituentswereiden
tifiedafterisolationandpurificationbymeansofsilicagelcolumnchromatography,andsemipreparativehighperformanceliquidchro
matography.TheywerepanaxsaponinsRe,chikusetsusaponinsⅣ,Ⅳa,Ⅴandpjs2,respectively.Thisstudyprovidedexperimental
dataforcomprehensiveevaluationofthequalityofRhizomaPanacisjaponici.
[Keywords] RhizomaPanacisJaponici;HPLCELSD;fingerprint;chemicalcomposition
doi:10.4268/cjcmm20100815
[责任编辑 王亚君]
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