全 文 :竹节参 HPLCELSD指纹图谱和化学成分分析
胡远浪,袁丁,何毓敏,王洪武,孙志伟,张长城
(三峡大学 医学院,湖北 宜昌 443002)
[摘要] 目的:建立竹节参药材HPLCELSD液相指纹图谱,分离纯化鉴定其主要特征峰的单体化合物,客观评价竹节参
内在质量差异。方法:采用高效液相色谱蒸发光散射检测器(HPLCELSD),梯度洗脱,测定了10批竹节参样品。色谱条件为
YMCpackODSAQ色谱柱(46mm×250mm,5μm),乙腈(A)05%乙酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱(0~5min,20% ~
40%A;5~20min,40%~40%A),流速为10mL· min-1,柱温30℃。ELSD检测器:漂移管温度为40℃,氮气释放压力为
33Psi。通过采用反复硅胶柱色谱和半制备HPLC的方法分离纯化竹节参的化学成分,并根据理化性质和波谱数据进行结构
鉴定。结果:建立了10批竹节参样品HPLCELSD指纹图谱,分离纯化鉴定了5个主要化学成分,分别为人参皂苷Re,竹节参
皂苷Ⅳ,Ⅳa,Ⅴ,Pjs2。结论:综合竹节参指纹图谱和化学成分分析,能较全面的表征不同产地竹节参内在成分的差异,为竹节
参内在质量评价提供依据。
[关键词] 竹节参;HPLCELSD;指纹图谱;化学成分
[收稿日期] 20091209
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30873383)
[通信作者] 张长城,博士,副教授,Tel:(0717)6397501,Email:
greatwal@ctgueducn
竹节参RhizomaPanaxJaponicus系五加科人参
属植物竹节参 PanaxjaponicusCAMey的竹鞭
状根茎,具有滋补强壮、散瘀止痛、止血祛痰等功
效[1]。其原植物主要分布于长江以南,西起云南西
部,东至日本的广泛区域,在我国主要产于云南、四
川、湖北、贵州等省。目前在我国鄂西地区已实现人
工种植。竹节参化学成分以齐墩果烷型皂苷为主,
尚有少量达玛烷型皂苷,另含有竹节参多糖、挥发油
等。日本学者从竹节参的根茎提取物中分离得到竹
节参皂苷Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅰb,Ⅰa,Ⅳa及甾体皂苷 P[2]。
蔡平[23]等从四川产竹节参根茎提取物中分离得到
Pjs1,Pjs2,Pjs3,Pjs4,Pjs6等5种皂苷单体。有
关竹节参药材的质量控制方法,本课题组曾报道了
对其苷元齐墩果酸的含量测定[4]。本文建立了竹
节参药材的HPLCELSD指纹图谱,并对指纹图谱主
要特征峰成分进行分离纯化和结构鉴定,旨在为竹
节参的质量分析提供有价值的参考。
1 材料
Waters600E液相色谱仪,2424ELSD检测器,
EMPOWER色谱工作站;Gilson半制备型高效液相
(305,306pump,806manometricmodule;Dynamax
modelUV1检测器);AB204N电子天平;KQ250B
型超声波清洗器;INOVA600型核磁共振仪(TMS
内标);LCQadvantage型ESIMS质谱测定仪。
柱色谱所用试剂均为分析纯,高效液相色谱所
用试剂为色谱纯,柱色谱及薄层色谱硅胶均为青岛
海洋化工厂产品,水为双重蒸馏水。
竹节参药材由三峡大学医学院中药学教研室谭
复成教授鉴定为五加科人参属植物竹节参 Pja
ponicus的干燥根茎,其来源见表1。
表1 竹节参药材的来源
No 产地来源 No 产地来源
S1 四川峨眉(野生品) S6 湖北神农架(野生品)
S2 湖北恩施(栽培品) S7 四川汶川(野生品)
S3 湖北恩施(野生品) S8 湖北五峰(栽培品)
S4 陕西秦岭(野生品) S9 湖北五峰(野生品)
S5 云南邵通(野生品) S10 四川雅安(野生品)
2 方法与结果
21 色谱条件
YMCPackODSAQ色谱柱(46mm ×250
mm,5μm),流动相为乙腈(A)05%乙酸水溶液
(B)梯度洗脱[0~5min,20% ~40%A;5~20min,
40%~40%A],流速为10mL·min-1,柱温为30
℃。ELSD检测器;氮气压力为33Psi;漂移管温度
40℃。进样量10μL。
22 供试品溶液的制备
竹节参药材粉碎,过4号筛,取约05g,精密称
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定,置具塞锥形瓶中,精密加入60%甲醇50mL,称
定质量,超声提取30min后,加60%甲醇补足减失
的质量,摇匀,过滤,取续虑液即得。
23 指纹图谱的建立
231 测定方法 精密吸取对照品溶液与供试品
溶液各10μL,按21项色谱条件分析得到色谱图,
考察60min供试样品的色谱分离情况,记录 200
min色谱图。
图1 竹节参药材S2样品的HPLC图
232 精密度考察 精密称取 S2号样品 1份,
按22项下方法制备供试品溶液,按 21项色谱
条件进行分析,连续进样 5次,考察色谱峰保留
时间和峰面积的一致性,结果各主要色谱峰的相
对保留时间 RSD为006% ~13%,相对峰面积
RSD为26% ~44%,说明仪器精密度良好,符
合指纹图谱要求。
233 稳定性考察 精密称取 S2号样品1份,按
22项下方法制备供试品溶液,按21项色谱条件
进行分析,分别在0,4,8,12,24,36h进样。结果表
明,各主要色谱峰的相对保留时间RSD为005%~
014%,相对峰面积 RSD为16% ~46%,表明供
试品溶液在常温下 36h内较稳定,符合指纹图谱
要求。
234 重复性考察 精密称取 S2号样品5份,按
22项下方法制备供试品溶液,按21项色谱条件
进行分析。结果表明,各主要色谱峰的相对保留时
间 RSD为 004% ~013%,相对峰面积 RSD为
31%~48%,表明方法重复性较好,符合指纹图谱
要求。
24 结果
241 竹节参药材的HPLCELSD指纹图谱 通过
考察色谱柱、流动相、柱温,以及 ELSD检测器的漂
移管温度、雾化气体流速(以氮气压力表示)等条件
参数对色谱分离效果的影响后优化所得色谱图见图
1。通过比较其色谱图的检测结果,确定特征峰为9
个。因6号峰峰面积较大,且较稳定,后鉴定为竹节
参皂苷Ⅴ,为竹节参中的代表成分之一,选其为参比
峰,标为s,以其各色谱峰对参比峰的相对保留时间
和相对峰面积定性。
242 系统聚类分析结果 对10批竹节参药材样
品HPLCELSD图谱中的9个特征峰的峰面积数据
进行量化,得到9×10阶原始数据,运用 SPSS100
软件对其进行系统聚类分析,采用组间距法,利用夹
角余弦距离作为样品的测度,见图2。由此确实10
批样品大致可以分为 2类,第Ⅰ类为 S6~S10,其
HPLCELSD指纹图谱重叠图见图 3;Ⅱ类为 S1~
S5,其HPLCELSD指纹图谱重叠图见图4。聚类谱
系图见图2。
图2 10批竹节参药材样品的聚类树状图
图3 第Ⅰ类竹节参样品的HPLCELSD指纹图谱
图4 第Ⅱ类竹节参样品的HPLCELSD指纹图谱
25 指纹图谱主要色谱峰化学成分分析
251 提取分离 因恩施产竹节参(S2号样品)色
谱峰相对较多,且有大面积的种植,所以对其进行化
学成分分离。恩施产竹节参(S2号样品)5kg,碾
碎,60%乙醇回流提取3次,每次2h,合并提取液,
减压浓缩,所得浸膏悬浮于水,依次用石油醚、乙酸
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乙酯、正丁醇萃取,得正丁醇萃取物750g。取正丁
醇萃取物240g溶于水,过D101大孔树脂,依次用水,
30%,60%,90%乙醇冲洗,取 60%洗脱部位(195
g),经硅胶柱色谱分离,采用氯仿甲醇(7∶3~1∶1)
梯度洗脱,得6部分(Fr1~Fr6),Fr1经硅胶柱色
谱,以氯仿甲醇水(8∶2∶025,7∶3∶05)梯度洗脱,
得两部分(Fr1a和Fr1b)。Fr1a经半制备高效液
相色谱分离,流动相为乙腈005%乙酸水(7∶18),
得化合物1(12mg);Fr1b采用半制备高效液相色
谱分离,流动相为乙腈005%乙酸水(19∶31),得化
合物2(70mg)和化合物3(36mg)。Fr6采用半制
备高效液相色谱分离,流动相为乙腈005%乙酸水
(7∶13),得化合物4(74mg)和化合物5(64mg)。
252 竹节参HPLCELSD指纹图谱特征峰的指认
比较竹节参 HPLCELSD指纹图谱特征峰和分离
得到的化合物HPLCELSD图谱的保留时间,指纹图
谱中1,6~9号色谱峰分别为化合物1,4~5,2~3。
253 结构鉴定
化合物 1 白色粉末,1HNMR(C5D5N,600
MHz)δ:644(1H,d,J=72Hz,RhaH1),557
(1H,brs,H24),523(1H,d,J=65Hz,GlcH1),
515(1H,J=77Hz,GlcH1),201(3H,s,H
21),175(3H,d,J=62Hz,H6),160(6H,s,H
26,H27),158,135,118,097,095(each3H,s,
5×CH3);经HPLC与对照品对照和参考文献[5]鉴
定化合物1为人参皂苷 Re。
化合物 2 白色粉末,ESIMSm/z925[M-
H]-。1HNMR(C5D5N,600MHz)δ:633(1H,d,
J=84Hz,GlcH1),617(1H,brs,1H,AraH1),
542(1H,s,H12),502(1H,d,J=36Hz,GlcAH
1),333(1H,dd,J=108,36Hz,H3),319(1H,
dd,J=138,36Hz,H18),129(6H,s,2×CH3),
109,098,092,089,083(each3H,s,5×
CH3),
13CNMR(C5D5N,150MHz)数据见表2。化
合物2的 ESIMS,1HNMR,13CNMR数据与文献报
道[3]的基本一致,故鉴定为竹节参皂苷Ⅳ。
化合物 3 白色粉末,ESIMSm/z793[M-
H]-。1HNMR(600MHz,C5D5N)δ:634(1H,d,
J=78Hz,GlcH1),542(1H,brs,H12),504
(1H,d,J=78Hz,GlcAH1),337(1H,brd,J=
99Hz,H3),319(1H,dd,J=102,24Hz,H
18),131,128,106,100,091,089,083(each
3H,s,7×CH3)。
13CNMR(C5D5N,150MHz)数据见
表2。化合物 3的1HNMR,13CNMR数据与文献
[6]报道的基本一致,故鉴定为竹节参皂苷Ⅳa。
化合物 4 白色粉末,ESIMSm/z955[M-
H]-。1HNMR(C5D5N,600MHz)δ634(1H,d,J=
78Hz,GlcH1),542(1H,brs,H12),541(1H,
s,GlcH1),502(1H,d,J=66Hz,GlcAH1),
328(1H,dd,J=114,42Hz,H3),318(1H,dd,
J=132,24Hz,H18),128,126,111,109,
091,088,083(each3H,s,7×CH3)。
13CNMR
(C5D5N,150MHz)数据见表 2。化合物 4的
1H
NMR,13CNMR数据与文献报道[7]的基本一致,故
鉴定为竹节参皂苷Ⅴ。
化合物 5 白色粉末,ESIMSm/z925[M-
H]-。1HNMR(C5D5N,600MHz)δ:633(1H,d,
J=84Hz,GlcH1),542(1H,brs,H12),528
(1H,d,J=60Hz,XylH1),499(1H,d,J=30
Hz,GlcAH1),329(1H,brd,J=84Hz,H3),
320(1H,brd,J=108Hz,H18),129(6H,s,2×
CH3),110,110,092,089,085(each3H,s,5×
CH3)。
13CNMR(C5D5N,150MHz)数据见表2。化
合物5的1HNMR,13CNMR数据与文献报道[3]的基
本一致,故鉴定为pjs2。
3 讨论
本实验采用 HPLCELSD对竹节参药材进行分
析,并对10批竹节参进行了系统聚类分析。根据系
统聚类分析可大致将竹节参分为2类,比较这两类
竹节参的指纹图谱,发现其化学成分组成和共有峰
的峰面积存在较大的差异。相对第Ⅱ类样品,第Ⅰ
类样品的指纹图谱多数缺失3~5,7号峰,而且8,9
号峰的峰面积明显降低,提示2类药材质量间存在
差异。为了进一步明确两类竹节参内在质量的差
异,对竹节参指纹图谱1,5~8号特征峰对应的成分
进行了分离纯化和结构鉴定,分别为人参皂苷 Re,
竹节参皂苷Ⅴ,Pjs2,竹节参皂苷Ⅳ,Ⅳa。相对第Ⅱ
类竹节参样品,第Ⅰ类样品中竹节参皂苷Ⅴ含量较
高,而人参皂苷 Re,Pjs2,竹节参皂苷Ⅳ,Ⅳa的含
量明显降低。两类药材之间主要成分的差异对药效
的影响,有待进一步研究。作者将通过系统的竹节
参谱效关系研究,明确竹节参药效密切相关的指纹
峰,以此作为评价竹节参质量的特征峰,建立竹节参
标准指纹图谱将更加合理和科学。
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表2 化合物2~5的13CNMR数据(C5D5N,150MHz)
No 齐墩果酸 2 3 4 5 No 2 3 4 5
C1 389 374 386 374 375 3OGlcAC1′ 1058 1072 1041 1040
C2 280 253 266 254 254 C2′ 742 755 816 823
C3 779 880 890 883 881 C3′ 750 777 759 761
C4 392 383 395 383 384 C4′ 775 735 721 720
C5 557 545 557 546 546 C5′ 753 781 766 766
C6 187 173 185 173 173 C6′ 1718 1727 1717 1714
C7 332 320 331 320 320 GlcC1″ 1048
C8 396 387 399 387 387 C2″ 767
C9 481 468 480 468 468 C3″ 771
C10 373 357 369 357 357 C4″ 699
C11 237 222 234 222 222 C5″ 761
C12 1224 1217 1229 1217 1217C6″ 610
C13 1446 1429 1441 1429 1429 XylC1″ 1058
C14 421 409 421 409 409 C2″ 754
C15 282 270 282 269 267 C3″ 770
C16 237 225 237 225 225 C4″ 699
C17 465 458 470 458 458 C5″ 663
C18 418 405 417 405 405 AraC1″ 1074
C19 465 450 462 450 450 C2″ 813
C20 309 296 308 296 296 C3″ 757
C21 342 328 340 328 328 C4″ 864
C22 332 319 325 313 313 C5″ 610
C23 287 271 283 271 271 28OGlcC1 945 958 946 946
C24 163 158 170 155 152 C2 729 741 729 729
C25 155 143 155 143 144 C3 781 793 781 781
C26 173 163 175 163 163 C4 699 711 705 699
C27 261 249 261 249 249 C5 781 789 777 777
C28 1799 1753 1765 1753 1753 C6 610 622 615 601
C29 332 320 332 315 320
C30 237 226 238 226 226
[参考文献]
[1] 中国药典一部[S]2005:93
[2] 蔡平,肖倬殷,魏均娴竹节参化学成分的研究[J]中草药,
1982,13(3):1
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草药,1984,15(6):1
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果酸的测定[J]华西药学杂志,2008,23(6):692
[5] 苏健,李海舟,杨崇仁吉林产西洋参的皂苷成分研究[J]中国
中药杂志,2003,28(9):830
[6] 谢光,姜勇,雷连娣,等猫儿刺叶中的三萜皂苷类成分[J]
中国天然药物,2009,7(3):206
[7] 孟大利,李铣,熊印华,等中药牛膝中化学成分的研究[J]
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HPLCELSDfingerprintandchemicalconstituentsof
RhizomaPanacisJaponici
HUYuanlang,YUANDing,HEYumin,WANGHongwu,SUNZhiwei,ZHANGChangcheng
(MedicalColegeofChinaThreeGorgesUniversity,Yichang443002,China)
[Abstract] TheaimwastoestablishthechromatographicfingerprintofRhizomaPanacisJaponiciforitsqualityevaluation.
AnalysiswasperformedonaYMCPackODSAQcolumn(46mm×250mm,5μm)elutedwiththemobilephasesofacetonitrile(A)
and5% aceticacidsolution(B)atingradientaflowrateof10mL·min-1.Theelutionprogramwasasfolow:05min,changed
from20%Ato40%A,520min,kept40%A.Thetemperatureofcolumnwas30℃.Thetemperateofdrifttubewas40℃,andthe
nitrogenpressurewas33Psi.TenbatchesofRhizomaPanacisjaponiciweredetermined.TheHPLCELSDchromatographicfingerprint
ofchemicalconstituentswasestablishedfromthe10batchesofRhizomaPanacisjaponiciandithad9characteristiccommonpeaks.
The10batchesofsampleswereclassifiedinto2clusterbyclusteranalysis.Furthermore,fiveknownchemicalconstuituentswereiden
tifiedafterisolationandpurificationbymeansofsilicagelcolumnchromatography,andsemipreparativehighperformanceliquidchro
matography.TheywerepanaxsaponinsRe,chikusetsusaponinsⅣ,Ⅳa,Ⅴandpjs2,respectively.Thisstudyprovidedexperimental
dataforcomprehensiveevaluationofthequalityofRhizomaPanacisjaponici.
[Keywords] RhizomaPanacisJaponici;HPLCELSD;fingerprint;chemicalcomposition
doi:10.4268/cjcmm20100815
[责任编辑 王亚君]
热烈祝贺《中国中药杂志》荣获2008年中国百种杰出学术期刊
据中国科学技术信息研究所最新发布的《中国科技期刊引证报告》(核心版)2008年期刊检索统计结果
表明:《中国中药杂志》总被引频次为4943,影响因子0.701,基金论文比0.59,综合评价总分80.3。
据中国知网(CNKI)“中国科技期刊影响因子年报(2009版)”公布结果表明:《中国中药杂志》2008年载
文量946篇,总被引频次6648,影响因子0931。
上述各项指标在我国药学以及中医药学等学科领域科技期刊中均名列前茅。
《中国中药杂志》荣获2008年中国百种杰出学术期刊。
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