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Vol.34，Issue 4
February，2009
第 34 卷第 4 期
2009 年 2 月
肝细胞萃取-HPLC 分析法的建立及其在栀子
保肝效应物质初步分析中的应用
洪 敏 1,2*，马宏宇 3，朱 荃 1
(1. 南京中医药大学 中医药研究院 国家规范化中药药理实验室，江苏 南京 210029；
2. 江苏省方剂研究重点实验室，江苏 南京 210046；3.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016)
[摘要] 目的：建立肝细胞萃取-HPLC 分析法（HE-HPLC），并应用其分析栀子中保肝作用的活性成分。方法：应用肝
细胞选择性地结合中药提取液中的活性成分，洗去未结合的其他成分后，使细胞靶点失活，被结合的活性成分从肝细胞中释
放出来，用高效液相色谱法对这些成分进行分析。结果：可检测到栀子水提液的主要保肝效应成分，初步确定为 2 个，其中
1 个为栀子苷，另 1 个有待进一步鉴定。结论：肝细胞萃取-HPLC 分析法基本可以反映化合物与细胞生物靶点(受体、通道、
酶等)的相互作用；该体系中的保留成分和其药理作用有显著的相关性，可用于中药复杂体系物质基础的分析。
[关键词] 肝细胞萃取-HPLC 分析法（HE-HPLC）；栀子；栀子苷

细胞色谱法是生物色谱的一种[1]，根据药物产
生的效应是通过药物与靶点(受体、通道、酶等)结合
的基本原理进行研究。推想如果以活的肝细胞为固
定相，使细胞的完整性、膜受体的立体结构、周围
环境和靶点得以保持，能够特异、选择性地与作用
于肝细胞的活性成分结合，排除非作用杂质成分的
干扰。因此，建立了肝细胞萃取 -HPLC 分析法
（HE-HPLC），并筛选研究以肝细胞为作用靶点的
中药的效应成分。
栀子是茵陈蒿汤中的组成药物，茵陈蒿汤保肝
作用的临床及药理报道确切。对于茵陈蒿汤保肝作
用的物质基础研究尚欠深入[2]，需要进一步地、有
针对性地寻找其效应成分。因此，分别对其中的组
成药物进行了研究，并报道应用此方法分析栀子的
保肝效应成分的结果。
1 材料
1.1 仪器
美国 Agilentl 1100 高效液相色谱（HPLC）仪系
统，由 G1315GAD 二极管阵列检测器、G1311 四元
梯度泵、自动进样器、柱温箱、在线真空脱气机等

[收稿日期] 2008-09-22
[基金项目] 国家自然科学基金项目（30300446）；江苏省高校自然科
学基金项目（03KJB360094）
[通信作者] *洪敏，博士，副研究员，Tel:（025）86798184，E-mail：
hongmin72@hotmail.com
组成；梯度滞后体积为 1.4 mL。SPE 固相萃取小柱
（B 型，G18 填料 500 mg）。
1.2 试药
栀子购于安徽省亳州市药材市场，经南京中医
药大学王春根教授鉴定为茜草科植物栀子 Gardenia
jasminoides Ellis.的干燥成熟果实。对照品栀子苷
（749-200108，供含量测定用，中国药品生物制品
检定所）。甲醇为色谱纯，纯水为 Millipore Milli Q
Plus 纯水系统所得，其余试剂均为分析纯。
1.3 试液
1.3.1 供试液的制备 栀子用水提取 3 次，每次 1.5
h，纱布过滤，醇沉，回收乙醇，浓缩至每毫升含
0.9 g 生药。放冷，离心，上清液经 0.45 μm 滤膜滤
过，供 HPLC 分析。
1.3.2 D-Hanks 缓冲液 NaCl 8 g，KCl 0.4 g，
KH2PO4 0.06 g，Na2HPO4 0.134 g，NaHCO3 0.35 g，
用双蒸水定溶至 1 L，pH 7.2。取该缓冲液 100 mL，
调 pH 4。
1.3.3 RPMI 1640 培养液 RPMI 1640 培养基粉末
10.4 g，用双蒸水定容至 1 L。
2 方法与结果
2.1 栀子水提液指纹图谱的 HPLC 测定
本实验建立的栀子水提液的 HPLC 图谱，作为
分析肝细胞萃取数据的背景资料，提示活性成分的


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色谱特征及其在指纹谱中的位置。
2.1.1 HPLC 图谱分析条件 Agilent Zorbax C18
色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；0.05%磷酸甲醇
为 A 液，0.05%磷酸水为 B 液；梯度洗脱，0~50 min，
10 %～60%A；50~65 min，60%～95%A；65~70 min，
95%～10%A。流速 1 mL·min-1；柱温 30 ℃。4 波长
检测，分别为 210，254，280，310 nm。
2.1.2 方法学考察 精密度试验：栀子供试液分别
在 0.2，4，10，12 h 检测指纹图谱，考察栀子水提
液的稳定性以及 HPLC 仪精密度。测得各共有峰相
对峰面积的 RSD 小于 3%，表明精密度良好，栀子
水提液在 12 h 内稳定。重复性试验：取同 1 批栀子，
平行制备 3 份供试溶液，检测 HPLC 指纹图谱，考
察栀子水提液及方法的重复性。结果表明，共有峰
相对保留时间及其中单峰面积占总峰面积大于或等
于 10%的峰面积的 RSD 均小于 3%，重复性良好。
2.1.3 指纹图谱检测波长及流动相梯度的确定 根
据栀子水提液中的成分特征及文献资料检索，对
210，254，280，310 nm 4 个波长的色谱条件进行考
察。综合考虑基线、色谱峰的数目、峰形及信号响
应强弱，确定 254，280 nm 为最佳检测波长，其中
254 nm 检测波长下出峰较多、各峰响应值均较大，
基线平稳，故选择 254 nm 作为栀子水提液指纹图谱
的检测波长。
2.1.4 图谱记录时间的确定 栀子水提液 2 h 记录
图和空白对照图，考察最佳记录时间。栀子水提液
和空白样品在 2 h 内的记录图，60 min 以后基本无
样品中的成分，因而确定最佳记录时间为 60 min。
2.1.5 对照试验 采用栀子苷为参照物，精密称定
适量，用水溶解，制成每毫升中含栀子苷 0.5 mg 的
溶液，记录色谱图。
2.1.6 栀子水提液 HPLC 指纹图谱及各项技术参数
3 批次栀子供试品，选择各批样品共有的、保留时
间及峰面积相对稳定的 19 个色谱峰作为栀子指纹
图谱的共有峰，栀子的 HPLC 指纹图谱见图 1。与
对照品比较，确定峰 14 为栀子苷，见图 2，以栀子
苷作为参照物峰，其余各色谱峰均与其比较计算相
对保留时间和相对峰面积比值。技术参数见表 1。
2.2 HE-HPLC 分析栀子作用于肝细胞的活性成分
2.2.1 肝细胞的获取及培养[3] 取大鼠，腹腔注
射 3%的戊巴比妥钠麻醉后固定，打开腹腔，结扎肝

图 1 栀子水提液指纹图谱


图 2 栀子水提液指纹图谱(I)与栀子苷对照品(II)对照图

表1 3批栀子水提液指纹图谱相对保留时间及相对峰面积
共有峰号 相对保留时间 相对峰面积 占总峰面积比例/%
1 0.294 0.010 4 0.47
2 0.399 0.018 2 0.82
3 0.450 0.008 8 0.40
4 0.507 0.103 9 4.70
5 0.521 0.026 6 1.20
6 0.541 0.009 1 0.41
7 0.575 0.032 0 1.45
8 0.579 0.047 6 2.16
9 0.650 0.027 5 1.24
10 0.670 0.010 4 0.47
11 0.712 0.031 3 1.42
12 0.800 0.030 0 1.36
13 0.859 0.371 8 16.84
14 1.000 1.000 0 45.29
15 1.169 0.016 9 0.76
16 1.312 0.018 9 0.86
17 1.489 0.017 4 0.79
18 1.636 0.269 9 12.22
19 2.020 0.023 6 1.07

门静脉下端，结扎处稍上方插入聚乙烯管。以恒流
泵灌入 D-Hank’s 缓冲液(流速 40 mL·min-1，37 ℃水
浴)，使其充盈，剪开下腔静脉，使血液流出。将肝
脏从大鼠体内分离，结扎上腔静脉，使灌流液由门
静脉进入，上腔静脉流出。继续灌流 10 min，冲干
净血液后，换用含 0.5%的胶原酶循环灌流（流速 20
mL·min-1，37 ℃水浴），肝脏移至托盘（37 ℃保温），
至肝脏质地柔软呈土黄色，细胞被充分消化时停止
灌流，以细胞梳梳理消化后的肝脏，过 300 目筛，
得到肝细胞。将所得的肝细胞加入 RPMI 1640 培养


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液中，离心（500 r·min-1，5 min）洗去过量的胶原
酶，共洗涤 4 次。肝细胞加入一定量的 RPMI 1640
培养液，置于细胞培养瓶中，37 ℃，5%CO2，相对
湿度 95%的培养箱中培养 3 h。
2.2.2 栀子效应成分与肝细胞的结合 取上述的栀
子水提液 1 mL，以 RPMI 1640 液稀释至 5 mL，加
入上述分离的细胞中，再加入 RPMI 1640 培养液至
20 mL，置于细胞培养瓶中，37 ℃，5%CO2，相对
湿度 95%的培养箱中培养 1.5 h。
2.2.3 未结合成分的洗脱 将培养后的细胞加入 20
mL D-Hank’s 缓冲液并用吸管轻轻吹打，洗涤，离
心（1 000 r·min-1，10 min）弃去上清液，如上操作
共洗涤 6 次直至洗涤液无保留峰。
2.2.4 肝细胞萃取栀子成分的解离 将洗涤后的肝
细胞加入 pH 4 的 D-Hank’s 缓冲液，37 ℃，5% CO2，
相对湿度 95%的培养箱中培养 1 h，使细胞上的靶点
失活，将结合的药物释放出来。解离后 1 000 r·min-1
离心 10 min，得上清解离液。
2.2.5 肝细胞活性成分解离液的色谱分析 将所得
最后一次洗涤液及解离液经 0.45 μm 滤膜过滤，过
活化的 SPE 固相萃取柱，SPE 柱用超纯水冲洗后，
以 1 mL 甲醇保留，再过 0.45 μm 滤膜，以上述条件
进行 HPLC 分析。分析条件与指纹图谱的条件相同。
2.2.6 空白对照试验 将 2.2.2 项中 1 mL 栀子水提
液改为 1 mL pH 7.2 的 D-Hanks 缓冲溶液，按以上方
法进行空白对照试验，得解离空白对照供试液，供
HPLC 指纹图谱分析 (均进样 20 μL)。
2.2.7 重复性试验 方法同上。
2.3 结果
图 3 为栀子肝细胞萃取解离液（Ⅲ）、最后一次洗
涤液（Ⅳ）和空白对照液（V）的色谱对照图；图 4
为栀子肝细胞萃取解离液（Ⅲ）与栀子指纹图谱（Ⅰ）
对照图。由图可见，栀子水提液肝细胞萃取解离液中
主要有 7 个可检测到的成分峰，与最后一次洗涤液和
空白对照液对比，认为栀子中的成分可与肝细胞膜的
靶点特异性结合，可检测到的结合成分主要有 2 个峰，
分别为峰 b 和 f。这 2 个峰仅在解离液中存在，与指
纹图谱对照，表明两者是栀子水提液中的成分，分别
对应峰 14 和 18。前面指纹图谱研究已知峰 14 为栀子
苷，故栀子水提液中与肝细胞结合的成分之一峰 b 为
栀子苷，另一成分峰 f（指纹图谱峰 18）有待鉴定。
因峰 a，c，d，e，g 在最后一次洗涤液里均出现，认
为其不是与肝细胞结合的成分，因其多次洗涤仍有较
多含量且空白对照液未检测到明显的峰，与指纹图谱
对照也初步显示这几个峰不是药物成分，故考虑为栀
子作用后某些细胞内源性物质增加的可能性，有待进
一步的实验证实。
由不同时间所做的栀子肝细胞萃取结果分析可
见，肝细胞特异结合的成分相同，且各成分的百分含
量的 RSD 小于 5%，证实了该方法稳定可靠，可以作
为一种筛选中药中作用于肝细胞的活性成分的方法。

图 3 栀子水提液肝细胞萃取解离液（Ⅲ）、最后
一次洗涤液（Ⅳ）和空白对照液（V）的 HPLC 对照图


图 4 栀子肝细胞萃取解离液 HPLC 图（Ⅲ）
与栀子指纹图谱（Ⅰ）对照图

3 讨论
本研究的 HE-HPLC 法思路来源于细胞生物色
谱(cell biochromatography)，模拟生理或病理状态下
药物在体内与受体、靶点的选择性结合过程，药物
的保留行为具有一定的药理学或生理学意义。但是
传统的细胞生物色谱存在一些问题，本实验室曾建
立了用红细胞膜包被的硅胶载体做固定相的 HPLC
生物色谱柱，但是由于红细胞膜包被硅胶的包被率
和柱内硅胶的均匀度较难控制，实验的重现性不能
保证；更为关键的是，HPLC 生物色谱柱内难以满
足细胞膜所需要的生物学环境，如温度、压力、离
子强度及溶液 pH 等要求，因此将细胞结合效应成
分与色谱分析分为 2 步，建立了红细胞色谱法[4]，


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血小板色谱法 [5]，取得了突破性进展。建立的
HE-HPLC，它的创造性在于应用活细胞选择性地结
合中药提取液中的活性成分，本方法旨在直接取用
效应器官的细胞对效应成分进行特异性结合，再进
行分析。由于肝细胞上有多种受体，能够特异地、
有选择性地与活性成分结合，可以满足中药作用多
靶点的活性成分的筛选，多次洗涤药物作用后的肝
细胞，可以排除大量非作用成分的干扰。
考察方法中的给药浓度、肝细胞预培养时间、
洗涤次数、药物与肝细胞结合时间，选择了文中所
用的最佳条件，在此条件下，使肝细胞活性保持良
好，既排除了非特异性结合成分，又可体现出各效
应成分与肝细胞受体结合的特异性。
根据栀子肝细胞萃取解离液、空白对照液和最
后一次洗涤液的图谱对照及解离液与指纹图谱对
照，认为栀子中的成分可与肝细胞膜的靶点特异性
结合，可检测到的结合成分主要有 2 个峰，其中之
一为栀子苷，另一成分有待分离鉴定。栀子苷被认
为是栀子的主要有效成分，对多种肝损伤具有良好
的保护作用[6]，可见 HE-HPLC 分析法是寻找保肝
效应成分的有效手段。解离液中检测到栀子提取液
指纹谱中不存在的峰，是栀子成分的肝细胞代谢产
物还是栀子效应成分作用与肝细胞后，肝细胞释放
的效应因子或肝细胞通透性增加内源性物质溢出，
这些都有待进一步的实验证实。至于栀子苷等结合
于肝细胞的什么靶点，它的生物学意义的阐明其意
义则更为重要。当然和所有的离体实验一样，
HE-HPLC 法有其局限性，对于在体内发生代谢转
化后发生作用的、不直接作用于肝细胞的一些效应
成分无法追踪。
[参考文献]
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using immobilized biopolymer： a new approach to the determination
of pharmacological properties [J]. J Pharmacol，1993，45： 367.
[2] 慕永平，刘 平，王 磊. 茵陈蒿汤的发展及现代研究 [J]. 中国
实验方剂学杂志，2006，12(2)：67.
[3] Seglen P O. Preparation of isolated rat liver cells [J]. Methods Cell
Bio，1976，13：29.
[4] Dong Z B，Li S P，Hong M，et al. Hypothesis of potential active
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[5] 樊宏伟，朱 荃，洪 敏，等. 血小板细胞膜固相色谱法在脉络
宁注射液效应物质分析中的应用 [J]. 中国药学杂志，2006，
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[6] 那 莎，郭国田，王宗殿，等. 栀子及其有效成分药理研究进展[J].
中国中医药信息杂志，2005，12(1)：90.


Establishment of hepatocyte extraction combined with HPLC(HE-HPLC)
and application in analysis of active components in the fruits of
Gardenia jasminoides extract

HONG Min1,2*，MA Hongyu3， ZHU Quan1
(1. National Standard Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmacology, Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing
210029, China; 2. Jiangsu Key Laboratory for Traditional Chinese Medicine Formulae Research, Nanjing 210046;
3. Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China)

[Abstract] To screen effective principles from traditional Chinese medicine, a method named hepatocyte extraction combined
with HPLC (HE-HPLC) was establish in this study. The active principles in the fruits of Gardenia jasminoides Ellis extract were
combined with the hepatocytes under imitated physiological environments. Then the unattached substances were washed off by PBS
with pH 7.4. After that the conjugated compounds were eluted by PBS with pH 4.0. These compounds released from target sites were
collected and handled through SPE to be condensed, and analyzed by HPLC. The results indicated that two characteristic active
compounds in the fruits of G. jasminoides extract binded to the hepatocytes. One of them is geniposide. The other is continued to be
identified. It is showed that active principles which could bind to hepotocyte (through receptors, Channels, enzymes, etc.) could be
detected, at least partly, by HE-HPLC analysis. There was a significant correlation between the retention properties of the active
compounds which was obtained by HE-HPLC and their pharmacological effects on hepotocytes.
[Key words] hepatocyte extraction combined with HPLC; Gardenia jasminoides; geniposide
[责任编辑 刘 ]