全 文 ：整体毛细管电色谱测定冬虫夏草中胞苷
与腺苷的含量
郭怀忠１，２，毕开顺３，孙毓庆３
（１．河北大学 药学院，河北 保定 ０７１００２；
２．河北省药物质量研究重点实验室，河北 保定 ０７１００２；
３．沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 １１００１６）
［摘要］　目的：采用聚甲基丙烯酸丁酯（ＰＢＭＡ）整体柱毛细管电色谱法测定冬虫夏草中胞苷和腺苷的含量。方法：采用
自制的ＰＢＭＡ电色谱整体柱（总长为３４５ｃｍ，有效长度２６０ｃｍ），流动相２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１硼砂水溶液（ｐＨ３５），运行电压１５
ｋＶ，压力进样（６×１０５）Ｐａ×０１ｍｉｎ；柱温３０℃，检测波长２１４ｎｍ，内标溶液１００μｇ·ｍＬ－１甲氧苄啶（ＴＭＰ）溶液（乙醇流动相
１∶１为溶剂）。结果：两核苷的在１２５～１２５ｍｇ·Ｌ－１线性关系良好。检测限（Ｓ／Ｎ＝３）及定量限（Ｓ／Ｎ＝１０）分别为：胞苷
２１４，７１４ｍｇ·Ｌ－１；腺苷１８８，６２５ｍｇ·Ｌ－１。两核苷加样回收率在９７２％～１０３５％，ＲＳＤ在０９％～２６％。结论：该方法
可用于冬虫夏草中胞苷和腺苷的含量测定。
［关键词］　整体毛细管电色谱法；冬虫夏草；胞苷；腺苷；含量测定
［收稿日期］　２００８０５１６
［通信作者］　孙毓庆，教授，博士生导师，Ｔｅｌ：（０２４）２３８４２６０２，Ｅ
ｍａｉｌ：ｓｕｎｙｕｑ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
　　冬虫夏草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）为麦角菌科Ｃｌａｖｉｃｉｐｉｔａｃｅ
ａｅ真菌冬虫夏草菌Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｂｅｒｋ．）Ｓａｃｅ．
寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫蝙蝠蛾 Ｈｅｐｉａｌｕｓａｒｍｏｒｉ
ｃａｎｕｓＯｂｅｒｔｈüｒ幼虫上的干燥子座和虫体尸体的复
合物，益肾补肺，止血化痰，为我国名贵传统的强壮
滋补药材。冬虫夏草的化学成分复杂，含碱基及核
苷类、多糖、甘露醇、多种氨基酸、维生素类、甾醇类、
多种无机元素和烷烃类等。现代药理研究表明，冬
虫夏草具有抗炎、抗肿瘤、降血糖、免疫调节、保护受
损肝肾、镇静和抗疲劳等作用［１５］。
核苷类是冬虫夏草的主要成分，２００５年版《中
国药典》［６］采用ＨＰＬＣ，以腺苷的含量为指标对冬虫
夏草进行质量控制。另外，采用ＨＰＬＣ［７１３］和毛细管
电泳［１４１９］测定冬虫夏草中的核苷类成分多有报道，
但一般集中在腺苷、鸟苷、尿苷和有关碱基的测定
上，尚未见冬虫夏草中胞苷的测定报道。该文采用
整体柱毛细管电色谱测定冬虫夏草中胞苷和腺苷的
含量，为冬虫夏草的质量评价和控制提供参考。
１　仪器与试药
ＡｇｉｌｅｎｔＨＰ３Ｄ毛细管电泳仪，Ａｇｉｌｅｎｔ１１００高效液
相色谱仪，石英毛细管柱（河北永年锐沣色谱器件
有限公司，内径７５μｍ，外径３６５μｍ）。
甲基丙烯酸丁酯（ｎｂｕｔｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ，Ａｖｏｃａｄｏ
公司，ＢＭＡ）；乙叉二甲基丙烯酸酯（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｍｅ
ｔｈａｃｒｙｌａｔｅ，Ａｃｒｏｓ公司，ＥＤＭＡ）；丙基三甲氧基硅烷
（甲基丙烯酰氧基，γｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙ
ｓｉｌｉａｎｅ，Ａｃｒｏｓ公司，γＭＡＰＳ）；２丙烯酰胺２甲基丙
磺酸（２ａｃｒｙｌａｍｉｄｏ２ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ，Ａｌｆａ
Ａｅｓａｒ公司，ＡＭＰＳ）；１，４丁二醇（１，４ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ，Ａｖ
ｏｃａｄｏ公司）；正丙醇（１ｐｒｏｐａｎｏｌ，天津市博迪化工有
限公司）；偶氮二异丁腈（ａｚｏｂｉｓｉｓｏｂｕｔｙｒｏｎｉｔｒｉｌｅ，武汉
盛世精细化学品有限公司，ＡＩＢＮ）。
乙腈（色谱纯）；硼砂（分析纯）；甲氧苄啶（药
用，ＴＭＰ）。
胞苷（瑞典Ｆｌｕｋａ产品，批号２６６００８）；腺苷（德
国Ｓｉｇｍａ产品，批号０２２Ｋ１２７０）；冬虫夏草样品（西
藏那曲）经沈阳药科大学孙启时教授鉴定。
２　方法与结果
２．１　电色谱条件
采用聚甲基丙烯酸丁酯（ＰＢＭＡ）毛细管电色谱
柱（总长为３４５ｃｍ，有效长度２６０ｃｍ）；流动相 ２０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１硼砂水溶液（醋酸调 ｐＨ３５）；运行电压
１５ｋＶ；压力进样（６×１０５）Ｐａ×０１ｍｉｎ；柱温３０℃，
检测波长２１４ｎｍ；内标溶液１００ｍｇ·Ｌ－１ＴＭＰ溶液
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（乙醇流动相１∶１为溶剂）。
２．２　ＰＢＭＡ毛细管电色谱柱的制备
２．２．１　毛细管预处理　取一定长度的毛细管，首先
用１ｍｏｌ·Ｌ－１ＨＣｌ溶液冲洗１ｈ，水冲洗至中性；再
用１ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＯＨ溶液冲洗２ｈ，水冲洗至中性；
２０倍丙酮冲洗，氮气吹干。３０％（ＭＡＰＳ丙酮溶液
充满毛细管，硅橡胶封端，放置过夜。２０倍柱体积
的丙酮冲洗毛细管，氮气吹干，备用。
２．２．２　整体固定相的制备　单体聚合液（ＥＤＭＡ
ＢＭＡＡＭＰＳ４０∶６０∶０３％）与致孔剂（正丙醇１，４丁
二醇水 ６０∶３０∶１０）的比例为４∶６［１］，聚合混合液中
含０２％ ＡＩＢＮ作为聚合反应的引发剂。聚合混合
液超声脱气１０ｍｉｎ后注入毛细管，硅橡胶封端口，
６０℃聚合４ｈ。取毛细管柱，切去两端并连接高效
液相色谱仪，在约１０７Ｐａ的压力下用乙腈冲洗２ｈ，
以除去未反应的残余单体、小分子量聚合物和致孔
剂。
２．２．３　检测窗口的制备　利用整体式柱床可以高
温分解的特性，截取合适长度的 ＰＢＭＡ柱，选取合
适的位置加温，使柱床分解为透明溶液，乙腈冲柱时
除去分解液，然后用刀片小心刮去相应处的聚酰亚
胺涂层即可。
２．３　对照品溶液的制备
取胞苷、腺苷对照品各约１０ｍｇ，精密称定，置
１０ｍＬ量瓶中，水溶解并定容，摇匀，即为对照品储
备液。精密量取上述对照品储备液适量至５ｍＬ量
瓶中，精密加入内标溶液２５ｍＬ，水定容，摇匀，制
备成０１２５，０１００，００７５，００５０，００２５，００１２５ｇ·
Ｌ－１的系列对照品溶液。
２．４　样品溶液的制备
样品洗净后，４０℃下干燥３ｈ，研磨粉碎后，置
广口瓶中，密塞，备用。取细粉约０５ｇ，精密称定，
置１０ｍＬ量瓶中，加水８ｍＬ，超声３０ｍｉｎ，放冷，水
稀释至刻度，摇匀，滤过。续滤液与内标溶液１∶１混
合即为供试品溶液。按２．１项下条件测定，通过组
分迁移时间及添加标准品确定峰位。对照品溶液和
样品溶液电色谱图见图１。
２．５　系统适用性试验
两核苷色谱峰间的分离度大于７０。取００５０
ｇ·Ｌ－１的标准溶液连续进样６次，计算相应核苷的
峰面积与内标峰面积的比值。胞苷平均为 １２１，
ＲＳＤ２３％，迁移时间 ＲＳＤ０３％，理论塔板数为
　　
Ａ．对照品；Ｂ．样品；１．甲氧苄啶；２．胞苷；３．腺苷。
图１　对照品及样品毛细管电色谱图谱
１６×１０５；腺苷平均为１６４，ＲＳＤ１５％，迁移时间
ＲＳＤ０３％，理论塔板数为１２×１０５。
２．６　线性关系考察
分别精密量取上述标准品系列溶液按上述条件
测定，读取峰面积。以相应核苷的峰面积与内标峰
面积的比值（Ｙ）对核苷溶液的浓度（Ｘ）作线性回
归，得回归曲线：胞苷 Ｙ＝２３２Ｘ＋００１１９，ｒ＝
０９９９８；腺苷Ｙ＝３３８Ｘ＋００３１２，ｒ＝０９９９３。
两核苷在１２５～１２５ｍｇ·Ｌ－１线性关系良好。
检测限（Ｓ／Ｎ＝３）及定量限（Ｓ／Ｎ＝１０）分别为胞苷
２１４，７１４ｍｇ·Ｌ－１；腺苷１８８，６２５ｍｇ·Ｌ－１。
２．７　稳定性试验
对照品溶液于４℃冰箱内放置，４８ｈ内按２１
项下色谱条件分时测定，各谱图显示无杂峰出现，两
对照品峰与内标峰面积的比值分别为胞苷 １３６
（ＲＳＤ３１％，ｎ＝８），腺苷２２６（ＲＳＤ６４％，ｎ＝８），
表明对照品溶液在４８ｈ内稳定。
２．８　重复性试验
取人工虫草样品６份依２．４项下操作，分别计
算两核苷与内标峰面积的比值，胞苷平均为０１５，
ＲＳＤ３０％；腺苷平均为１２８，ＲＳＤ２８％。方法的
重复性良好。
２．９　加样回收率试验
于一定量的人工虫草样品中分别加入适量的核
苷对照品溶液，按２．４项下方法制备样品溶液，使溶
液中添加的核苷质量浓度分别为 ２５，５０，７５ｍｇ·
Ｌ－１。依法分析，计算 ３水平回收率分别为胞苷：
１００１％，ＲＳＤ２０％；１０２３％，ＲＳＤ２５％；１０３５％，
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ＲＳＤ０９％。腺苷：１０１７％，ＲＳＤ２６％；９８２％，
ＲＳＤ１２％；９７２％，ＲＳＤ２２％。结果表明方法的
准确度良好。
２．１０　样品测定
取不同来源及种类的冬虫夏草，按上述方法提
取并测定，结果见表１。
表１　冬虫夏草样品测定结果（ｎ＝２） μｇ·ｇ－１
Ｎｏ． 样品来源及种类 胞苷 腺苷
１ 人工虫草 １０８６ ２２６９
２ 人工虫草 ２０４０ －
３ 人工虫草 ３４２３ ５１６
４ 人工蛹虫草 ４９４５ ５８９８
５ 人工蛹虫草 ２６６７ １６１６
６ 冬虫夏草 ５５４ ８３５
７ 冬虫夏草 １５８６ １２２２
３　讨论
３．１　有机改性剂对分离的影响
乙腈的加入可以改善峰形，抑制电流，减小焦耳
热效应，并缩短分析时间。但无论其加入比例如何，
都会恶化组分间的分离度。而异丙醇的加入还会使
峰展宽，且组分迁移时间大大延长。推测加入有机
溶剂后分离度的减小与组分保留因子的变化有关。
迁移时间的变化与流动相的黏度变化及电渗流抑制
的综合状况有关。
３．２　硼砂溶液浓度和ｐＨ对分离的影响
硼砂浓度的增加只有限提高了２个组分的分离
度，且抑制了电渗流，使迁移时间延长，电流明显增
大。而当流动相浓度较低时，系统稳定性差。综合
考虑，该研究选用硼砂２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１的流动相。降
低流动相的 ｐＨ，腺苷的迁移时间延长，增大了与胞
苷的分离度。当 ｐＨ大于５时，２组分不能有效分
离，且峰形变差。
当前整体毛细管电色谱柱的制备技术及类型多
样，但批间重现性较差，在电色谱领域的纯理论研究
较多，实际应用于定量分析的文章较少［２０２１］。该文
采用文献中相对成熟的技术制备了 ＰＢＭＡ柱，并改
进了窗口制作技术，用于中药的分析。通过对实际
样品的分析，发现ＰＢＭＡ柱具有一般液相色谱的疏
水分配机理，柱效高，重现性好，抗污染能力强，单根
柱子分析中药样品１００次以上，虽柱效有所下降，但
分离性能仍可基本满足分析要求。整体毛细管电色
谱柱柱床的理化性质、稳定性、色谱柱的保存与再生
等对实际应用的影响仍需研究和改进。毛细管电色
谱整体柱适合于中药等复杂样品的分析，从理论与
实际应用上的进一步研究必将给药物分析注入新的
活力。
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［２０］　郭怀忠，毕开顺，孙毓庆．毛细管电色谱及其在药物分析中的
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应用［Ｊ］．药物分析杂志，２００５，２５（６）：１４８．
［２１］　ＧｕｏＨｕａｉｚｈｏｎｇ，ＷａｎｇＬｉｎｌｉｎｇ，ＢｉＫａｉｓｈｕｎ，ｅｔａｌ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｏｆｔｒｏｘｅｒｕｔｉｎｉｎｔｒｏｘｅｒｕｔｉｎｔａｂｌｅｔｓｂｙｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃｃａｐｉｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ［Ｊ］．ＪＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｇｒａｐｈｙ＆ＲｅｌａｔｅｄＴｅｃｈｎｏ
ｉｌｏｇｉｅｓ，２００５，２８（５）：６４７．
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃｙｔｉｄｉｎｅａｎｄａｄｅｎｏｓｉｎｅｉｎｃｏｒｄｙｃｅｐｓｂｙｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃｃａｐｉｌａｒｙ
ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
ＧＵＯＨｕａｉｚｈｏｎｇ１，２，ＢＩＫａｉｓｈｕｎ３，ＳＵＮＹｕｑｉｎｇ３
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＨｅｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂａｏｄｉｎｇ０７１００２，Ｃｈｉｎａ；
２．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＤｒｕｇＱｕａｌｉｔｙＳｔｕｄｙｉｎＨｅｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｂａｏｄｉｎｇ０７１００２，Ｃｈｉｎａ；
３．ＣｏｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＳｈｅｎｇｙａｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１００１６，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｃａｐｉｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃｙｔｉｄｉｎｅａｎｄａｄｅｎｏｓｉｎｅｉｎ
ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｗｉｔｈｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃｃｏｌｕｍｎ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｈｅｔｏｔａｌｌｅｎｇｔｈｏｆｔｈｅｈｏｍｅｍａｄｅｐｌｏｙｂｕｔｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ（ＰＢＭＡ）ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃｃａｐｉｌａｒｙ
ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｌｕｍｎｗａｓ３４５ｃｍｗｉｔｈｔｈｅｅｆｅｃｔｉｖｅｌｅｎｇｔｈｏｆ２６０ｃｍ．Ｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｗａｓ２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ｂｏｒａｘｓｏｌｕｔｉｏｎ
（ａｄｊｕｓｔｅｄｐＨｔｏ３５ｕｓｉｎｇａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）；ｔｈｅｏｐｅｒａｔｉｏｎｖｏｌｔａｇｅｗａｓ１５ｋＶ；ｓａｍｐｌｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｐｒｅｓｓｕｒｅｗａｓ６ｂａｒ×０１ｍｉｎ；ｃｏｌｕｍｎｔｅｍ
ｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ３０℃ ａｎｄｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｗａｓｓｅｔａｔ２１４ｎｍ．Ｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｓｔａｎｄａｒｄｓｏｌｕｔｉｏｎｗａｓ１００ｍｇ·Ｌ－１ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍｓｏｌｕ
ｔｉｏｎ［ｅｔｈａｎｏｌｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅ（１∶１）ｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｓｏｌｖｅｎｔ］．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｃｙｔｉｄｉｎｅａｎｄ
ａｄｅｎｏｓｉｎｅｗｉｔｈｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ１２５１２５ｍｇ·Ｌ－１ｗｅｒｅｌｉｎｅａｒｌｙｃｏｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｐｅａｋａｒｅａｓ，ａｎｄｔｈｅｃｏｒｅｌａｔｉｖｅｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｓ
（ｒ）ｗｅｒｅ０９９９８ａｎｄ０９９９３，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅＬＯＤ（Ｓ／Ｎ＝３）ａｎｄＬＯＱ（Ｓ／Ｎ＝１０）ｏｆｃｙｔｉｄｉｎｅｗｅｒｅ２１４ａｎｄ７１４ｍｇ·Ｌ－１，
ａｎｄｔｈｏｓｅｏｆａｄｅｎｏｓｉｎｅｗｅｒｅ１８８ａｎｄ６２５ｍｇ·Ｌ－１．Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｏｆｔｈｅｔｗｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓｗｅｒｅｆｒｏｍ９７２％ ｔｏ１０３５％ ｗｉｔｈ
ｒｅｌａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎ（ＲＳＤ）ｗｉｔｈｉｎ０９％２６％ ｉｎｔｈｒｅｅｌｅｖｅｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｉｓｅｆｅｃｔｉｖｅａｎｄｃｒｅｄｉｂｌｅ．Ｉｔｃａｎｂｅ
ｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｃｙｔｉｄｉｎｅａｎｄａｄｅｎｏｓｉｎｅｉｎｃｏｒｄｙｃｅｐｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃｃａｐｉｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ；ｃｙｔｉｄｉｎｅ；ａｄｅｎｏｓｉｎｅ；ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
［责任编辑　王亚君］
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