全 文 ：ｔｏｏｌ．ＥＲαａｎｄＥＲβｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴ４７Ｄｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＴｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓｏｆＴ４７Ｄｃｅｌｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ
１×１０－５ｍｏｌ·Ｌ－１ｔｏ１×１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１ｐｓｏｒａｌｅｎａｎｄｉｓｈｉｋａｗａｃｅｌｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ１×１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１ｔｏ１×１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１ｐｓｏｒａｌｅｎ
ｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．ＴｈｅＲＴＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ１×１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１ａｎｄ１×１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１ｐｓｏｒａｌｅｎｃｏｕｌｄｉｎｃｒｅａｓｅＰＲｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＴ４７Ｄｃｅｌｓ．ＴｈｅａｂｏｖｅｅｆｅｃｔｓｃｏｕｌｄｂｅｂｌｏｃｋｅｄｂｙＩＣＩ１８２，７８０．ＰｓｏｒａｌｅｎｃｏｕｌｄａｌｓｏｉｎｄｕｃｅｔｈｅａｕｇｍｅｎｔｏｆＥＲαａｎｄＥＲ
βｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＴ４７Ｄｃｅｌｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｐｓｏｒａｌｅｎｈａｓｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃｅｆｅｃｔｓ．ＴｈｅｅｆｅｃｔｓａｒｅａｔａｉｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈＥＲｐａｔｈ
ｗａｙ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｐｓｏｒａｌｅｎ；ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ；Ｔ４７Ｄ；ｉｓｈｉｋａｗａｃｅｌ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ；ｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ
［责任编辑 古云侠］
［收稿日期］ ２００６１０２０
［基金项目］ 浙江省中医药重点项目研究计划（２００７ＺＡ０１５）
［通讯作者］ 陈君柱，Ｔｅｌ：（０５７１）８７２３６５００，Ｆａｘ：（０５７１）
８７２３６８８９，Ｅｍａｉｌ：ｃｈｅｎｊｚ０１＠１６３．ｃｏｍ
大黄素对血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌
细胞增殖的影响
杨雨民１，王世君１，金丹丹２，刘云英２，王兴祥１，陈君柱１
（１．浙江大学 医学院 附属第一医院 心内科，浙江 杭州 ３１０００３；
２．浙江大学 病原微生物实验室，浙江 杭州 ３１００３１）
［摘要］ 目的：观察大黄素对血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）诱导血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖的影响及机制。方法：
斑贴法培养大鼠主动脉ＶＳＭＣ，ＡｎｇⅡ刺激ＶＳＭＣ建立细胞增殖模型。采用ＭＴＴ法检测细胞增殖，观察大黄素（１０，
２０，４０，８０μｍｏｌ·Ｌ－１）、亚硝基精氨酸甲酯（ＬＮＡＭＥ，１００μｍｏｌ·Ｌ－１）对ＡｎｇⅡ诱导ＶＳＭＣ增殖的影响。免疫组化
法检测增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）表达；硝酸还原酶及化学比色法测细胞上清液中一氧化氮（ＮＯ）、一氧化氮合酶
（ＮＯＳ）、诱导型一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）水平。半定量逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）检测 ＶＳＭＣｉＮＯＳｍＲＮＡ的表
达。结果：大黄素在１０～８０μｍｏｌ·Ｌ－１呈剂量及时间依赖性抑制ＶＳＭＣ增殖，但可被１００μｍｏｌ·Ｌ－１的ＬＮＡＭＥ部
分抵消；大黄素能减少ＰＣＮＡ阳性细胞表达，升高 ＮＯ，ＮＯＳ，ｉＮＯＳ水平，增加 ｉＮＯＳｍＲＮＡ的表达。结论：大黄素对
ＡｎｇⅡ诱导的ＶＳＭＣ增殖有抑制作用，抑制ＶＳＭＣＰＣＮＡ的表达，上调 ｉＮＯＳ基因表达，升高 ＮＯ水平可能是其发挥
作用的机制。
［关键词］ 大黄素；血管紧张素Ⅱ；血管平滑肌细胞；一氧化氮；一氧化氮合酶
［中图分类号］Ｒ２８５．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）０１００６３０５
血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）异常增殖是许多心血
管疾病的共同病理过程，是高血压血管重构、动脉硬
化、血管成形术后再狭窄主要病因之一。血管紧张
素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）是一种重要的血管活性物质，可以自
分泌和旁分泌的方式作用于ＶＳＭＣ，促进其增殖［１］，
因此抑制ＡｎｇⅡ诱导ＶＳＭＣ增殖可预防许多心血管
疾病的发生及发展。大黄是我国常用的传统中药，
具有“活血化瘀，泻下攻积”的功效，在心血管疾病
中应用很广。大黄素（ｅｍｏｄｉｎ）是从大黄中提取的
有效成分，属蒽醌类衍生物。研究表明，大黄素对
ＶＳＭＣ等多种细胞增殖有抑制作用［２４］，但其作用机
制尚不明确。研究结果显示：激活 ｐ５３途径［５］；下
调细胞周期蛋白 Ｄ１表达，阻滞细胞周期的进程
［６］；
增加过氧化物歧化酶，降低自由基水平［４］等可能是
其发挥作用的机制。为进一步研究大黄素抑制
ＶＳＭＣ增殖的机制，作者通过体外培养大鼠 ＶＳＭＣ，
观察大黄素对 ＡｎｇⅡ诱导 ＶＳＭＣ增殖的影响，并探
讨与一氧化氮（ＮＯ）信号通路的关系。
１ 材料
１．１ 动物 ４只６周雄性ＳＤ大鼠，体重（１２０±１０）
ｇ，浙江省医学科学院提供，动物合格证号医动字第
０２２３８。
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Ｊａｎｕａｒｙ，２００８
１．２ 药物 大黄素，中国药品生物制品检定所，批
号１１０７５６～２００１１０，纯度＞９９％。
１．３ 试剂 超级小牛血清（杭州四季青生物技术
研究所）；总 ＲＮＡ提取试剂盒（北京博大泰克生物
公司）；１００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ（杭州吉诺生物公司）；
ＲＴＰＣＲ试剂盒（杭州博日生物公司）；一氧化氮
（ＮＯ）、一氧化氮合酶（ＮＯＳ）、诱导型一氧化氮合酶
（ｉＮＯＳ）测试盒（南京建成生物研究所）；ＤＭＥＭ高糖
培养基（Ｇｉｂｃｏ，１２６７６１０）；四甲基氮唑蓝（ＭＴＴ，
１０４Ｋ５３３０），硝 基 Ｌ精 氨 酸 甲 酯 （ＬＮＡＭＥ，
１２４Ｋ１２１２），ＡｎｇⅡ（Ａ９５２５），胰蛋白酶（０３５Ｋ７６７６）
购自美国Ｓｉｇｍａ公司；小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原
（ＰＣＮＡ）单克隆抗体和小鼠抗大鼠αａｃｔｉｎ单克隆抗
体购自北京中山生物公司。
１．４ 仪器 倒置显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ）；ＴＵ－１８１０紫外
可见分光光度计（北京普析通用仪器公司）；酶联免
疫仪（Ｍｏｄｅｌ６８０型，ＢＩＯ－ＲＡＤ）；ＰＣＲ扩增仪（Ｇｅｎｅ
ＡｍｐＰＣＲ－２４００，美国）。
２ 方法
２．１ ＶＳＭＣ培养及鉴定 采用“贴块法”培养
ＶＳＭＣ。无菌条件取出大鼠胸主动脉，刮去内皮细
胞，将中膜浅层和中层的组织撕成小块，将含纤维细
胞多的近外膜 １／３的中膜剪弃，切成碎块（１～２
ｍｍ３）；ＰＢＳ洗３次后，将组织块接种于培养瓶壁，置
于３７℃ ＣＯ２孵箱内。待组织块黏牢于瓶壁时，加
１０％小牛血清的ＤＭＥＭ培养液，使组织块完全浸泡
于培养基中，３ｄ换液１次，生长近融合时按１∶２传
代。经倒置显微镜观察及αａｃｔｉｎ单克隆抗体，通过
免疫组化法鉴定ＶＳＭＣ的特异性肌动蛋白。
２．２ 分组及处理 ①空白组：未加入药物；②Ａｎｇ
Ⅱ组：加入ＡｎｇⅡ（１００ｎｍｏｌ·Ｌ－１）；③大黄素＋Ａｎｇ
Ⅱ组：加入ＡｎｇⅡ（１００ｎｍｏｌ·Ｌ－１）和不同浓度（１，
２０，４０，８０μｍｏｌ·Ｌ－１）的大黄素；④ＬＮＡＭＥ组（１００
μｍｏｌ·Ｌ－１）；⑤ＬＮＡＭＥ组（１００μｍｏｌ·Ｌ－１）＋Ａｎｇ
Ⅱ组（１００ｎｍｏｌ·Ｌ－１）；⑥大黄素 ＋ＡｎｇⅡ ＋Ｌ
ＮＡＭＥ组：加入 ＡｎｇⅡ（１００ｎｍｏｌ·Ｌ－１）及 ＬＮＡＭＥ
组（１００μｍｏｌ·Ｌ－１）和不同浓度大黄素。以上① ～
③干预时间分别为２４，４８，７２ｈ。④～⑥干预时间分
别为７２ｈ。
２．３ ＭＴＴ法检测大黄素对 ＡｎｇⅡ诱导 ＶＳＭＣ增殖
的影响 选择３～５代ＶＳＭＣ，胰蛋白酶消化制备细
胞悬液，调细胞密度２５×１０４个／ｍＬ，每孔２００μＬ，
接种在９６孔板中，３７℃ ５％ ＣＯ２条件下培养，２４ｈ
后换无血清ＤＭＥＭ培养液，继续孵育２４ｈ，使细胞
生长同步化。吸弃上清，分别加各种处理因素，继续
培养２４，４８，７２ｈ。每组设４个复孔，分别于药物作
用结束前４ｈ，每孔加５ｍｇ·ｍＬ－１ＭＴＴ２０μＬ，４ｈ
后终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加１５０μＬ
二甲基亚砜（ＤＭＳＯ），振荡１０ｍｉｎ使结晶充分溶解，
在酶标仪上４９０ｎｍ波长处测定吸光度（Ａ），用只加
培养液不加细胞的空白孔调零。
２．４ ＭＴＴ法检测 ＬＮＡＭＥ、大黄素对 ＡｎｇⅡ诱导
ＶＳＭＣ增殖的影响 选择第３～５代 ＶＳＭＣ进行实
验，制备细胞悬液，调细胞密度２５×１０４个／ｍＬ，每孔
２００μＬ，接种在９６孔板中，３７℃ ５％ ＣＯ２条件下培
养，２４ｈ后换无血清ＤＭＥＭ，继续孵育２４ｈ，使细胞生
长同步化。加入各种处理因素继续培养４８ｈ，每组设
４个复孔。分别于药物作用结束前４ｈ，每孔加５ｍｇ
·ｍＬ－１ＭＴＴ２０μＬ，培养４ｈ后终止培养，每孔加１５０
μＬＤＭＳＯ，振荡１０ｍｉｎ，在酶标仪上４９０ｎｍ波长处测
定Ａ，用只加培养液不加细胞的空白孔调零。
２．５ 大黄素对ＡｎｇⅡ诱导ＶＳＭＣＰＣＮＡ表达的影响
选生长良好的３～５代ＶＳＭＣ，调细胞密度２５×１０４
个／ｍＬ，每孔１ｍＬ接种在有盖玻片６孔板上，待细胞
生长成片时，吸出培养液，给予不同浓度大黄素及
ＡｎｇⅡ，４８ｈ后取出玻片，ＰＢＳ洗去培养液，冷丙酮：甲
醇（１∶１）固定２０ｍｉｎ。将玻片固定在载玻片上，按免
疫组化ｓｐ法检测（抗体稀释１∶２００）。普通光镜下将
免疫组化切片图像输入ＨＰＩＡＳ１０００医学图像分析系
统，每张细胞片随机计算２个视野（２００倍）中ＰＣＮＡ
阳性细胞Ａ值，求ＰＣＮＡ阳性细胞平均Ａ值。
２．６ 大黄素对 ＡｎｇⅡ诱导 ＶＳＭＣ培养液 ＮＯ的影
响 收集药物干预７２ｈ后培养液，采用硝酸还原酶
将ＮＯ３还原为ＮＯ２，通过显色测定ＮＯ
２－浓度间接反
映ＮＯ水平。操作按试剂盒说明进行，ＮＯ２－含量按
以下公式计算。
（测定管Ａ－空白管 Ａ）／（标准管 Ａ－空白管 Ａ）×１００
μｍｏｌ·Ｌ－１
２．７ 大黄素对ＡｎｇⅡ诱导ＶＳＭＣ培养液ｉＮＯＳ，ＮＯＳ
的影响 收集药物干预７２ｈ后的培养液，通过ＮＯＳ
催化产生的ＮＯ量推算 ＮＯＳ活力。ＮＯ与亲核物质
生成有色化合物，测定其吸光度可计算出 ＮＯＳ活
力。ＮＯＳ活性以每分钟生成的 ＮＯ２－量表示，根据
试剂盒说明书，用公式［（测定管 Ａ－空白管 Ａ）×
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９０８６Ｕ·Ｌ－１］计算。
２．８ 大黄素对ＡｎｇⅡ诱导 ＶＳＭＣｉＮＯＳｍＲＮＡ的表
达的影响 药物作用细胞７２ｈ后，采用 Ｔｒｉｚｏｌ试剂
一步法提取总 ＲＮＡ，用紫外可见分光光度计测定
Ａ２６０∶Ａ２８０，比值在１７～１９。根据各自的基因序列
设计并合成ｉＮＯＳ及甘油醛３磷酸脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）
引物如下：ｉＮＯＳ［７］上 游 ５′ＣＣＴＣＡＣＴＣＡＡＣＣＣＴ
ＴＣＡＣＣＣ３′，下游 ５′ＴＣＣＧＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣＴＧＡＣＣ３′
（３８０ｂｐ）；ＧＡＰＤＨ作为内参引物［８］上游５′ＴＣＣＣＴ
ＣＡＡＧＡＴＴＧＴＣＡＧＣＡＡ３′， 下 游 ５′ＡＧＡＴＣＣＡ
ＣＡＡＣＧＧＡＴＡＣＡＴＴ３′（３０８ｂｐ），上述引物由上海赛
百胜生物公司合成。ＲＴＰＣＲ扩增步骤如下：待测
ＲＮＡ３μＬ，上、下游引物各为１μＬ，ＡＭＶ反转录酶
０５μＬ，Ｔａｑ混合物０５μＬ，ｄＮＴＰ４０μＬ，ＲＮＡ酶
抑制剂１０μＬ，加超纯水至 ２５μＬ。反应参数：４５
℃ ３０ｍｉｎ，９５℃５ｍｉｎ。９４℃变性４５ｓ，５５℃退火
（ＧＡＰＤＨ５６℃）４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，２８个循环，
７２℃延伸８ｍｉｎ。取ＰＣＲ产物１０μＬ于１８％琼脂
糖凝胶（含溴化乙锭０５μｇ·ｍＬ－１）电泳，电泳完成
后取出凝胶，采用ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ凝胶成像系统（ＢＩＯ
ＲＡＤ）对扩增产物扫描进行半定量分析，用 ｉＮＯＳ／
ＧＡＰＤＨ比值表示基因表达的相对水平。
２．９ 统计方法 所有实验数据用 珋ｘ±ｓ表示，用
ＳＰＳＳ１００软件做统计学处理，组间比较采用单因
素方差分析Ｂｏｎｆｅｒｏｎｉ法统计，Ｐ＜００５为有显著性
差异。
３ 结果
３．１ ＶＳＭＣ培养及鉴定 倒置相差显微镜下观察，
细胞为梭形、长梭形，排列成放射状，呈典型“谷”与
“峰”生长现象。αａｃｔｉｎ单克隆抗体免疫组化染色
可见胞浆肌丝呈典型棕黄色细颗粒状沉淀。
３．２ 大黄素对ＡｎｇⅡ诱导ＶＳＭＣ增殖的影响 Ａｎｇ
Ⅱ作用细胞后Ａ明显升高，与空白组比较有显著性
差异（Ｐ＜００１）；大黄素作用ＶＳＭＣ后Ａ明显降低，
与 ＡｎｇⅡ组比较有显著性差异（Ｐ＜００５或 Ｐ＜
００１），说明大黄素对ＡｎｇⅡ诱导的ＶＳＭＣ增殖有抑
制作用。随大黄素浓度增加及时间延长，抑制
ＶＳＭＣ增殖程度也逐渐增强，有明显的剂量及时间
依赖性。见表１。
３．３ 大黄素、ＬＮＡＭＥ对ＡｎｇⅡ诱导ＶＳＭＣ增殖的
表１ 大黄素对ＡｎｇⅡ诱导ＶＳＭＣ增殖（Ａ）的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝４）
组别 剂量／μｍｏｌ·Ｌ－１ ２４ｈ ４８ｈ ７２ｈ
空白 － ０１７８±００１７ ０２５０±００１４ ０３０４±００１２
ＡｎｇⅡ － ０３３０±００１１ ０３８９±００１２ ０４６９±００１３
ＡｎｇⅡ＋大黄素 １０ ０２７７±００１０１） ０３２８±００１５２） ０３８７±００１１２）
２０ ０２４０±００１３２） ０２９３±００１２２） ０３３８±００１４２）
４０ ０２１１±００１４２） ０２６０±００１４２） ０２９０±００１１２）
８０ ０１８０±００１２２） ０２２７±００１５２） ０２４３±００１６２）
注：与ＡｎｇⅡ组比较１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１
影响 以上试验表明大黄素在７２ｈ抑制增殖作用
最强，同时加入 ＬＮＡＭＥ７２ｈ后，ＡｎｇⅡ ＋ＬＮＡＭＥ
组Ａ明显高于 ＡｎｇⅡ及空白组，与 ＡｎｇⅡ及空白组
比较有显著性差异（Ｐ＜００１），且 ＬＮＡＭＥ组 Ａ也
高于空白组，说明 ＬＮＡＭＥ可促进 ＶＳＭＣ增殖。大
黄素（１０～４０μｍｏｌ·Ｌ－１）组 Ａ略降低，但与
ＡｎｇⅡ＋ＬＮＡＭＥ组比较无显著性差异，说明大黄素
（１０～４０μｍｏｌ·Ｌ－１）抑制 ＶＳＭＣ增殖作用被 Ｌ
ＮＡＭＥ部分抵消。大黄素８０μｍｏｌ·Ｌ－１与ＡｎｇⅡ＋
ＬＮＡＭＥ组比较有显著性差异（Ｐ＜００５），说明大
黄素在８０μｍｏｌ·Ｌ－１抑制 ＶＳＭＣ增殖作用没有被
ＬＮＡＭＥ完全抵消。见表２。
３．４ 大黄素对ＡｎｇⅡ诱导ＶＳＭＣＰＣＮＡ表达的影响
ＰＣＮＡ阳性表现为胞浆内见许多棕黄色颗粒，Ａｎｇ
表２ 大黄素、ＬＮＡＭＥ对ＡｎｇⅡ诱导ＶＳＭＣ增殖
（Ａ）的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝４）
组别
剂量
／μｍｏｌ·Ｌ－１
７２ｈ
空白 － ０３１１±００１２２）
ＬＮＡＭＥ － ０３９９±００１５２）
ＡｎｇⅡ － ０４６７±００１４２）
ＡｎｇⅡ＋ＬＮＡＭＥ － ０５１３±００１４
ＡｎｇⅡ＋ＬＮＡＭＥ＋大黄素 １０ ０５００±００２１
２０ ０４８９±００１７
４０ ０４７５±００１６
８０ ０４４６±００１９１）
注：与ＡｎｇⅡ＋ＬＮＡＭＥ组比较１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１
Ⅱ作用 ＶＳＭＣ７２ｈ后 ＰＣＮＡ阳性细胞吸光度明显
增加。大黄素（１０～８０μｍｏｌ·Ｌ－１）作用后ＰＣＮＡ阳
性细胞吸光度有不同程度降低，与 ＡｎｇⅡ组比较有
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显著性差异（Ｐ＜００１），ＰＣＮＡ阳性细胞吸光度随着
大黄素浓度的增加而降低，说明大黄素能明显抑制
ＡｎｇⅡ诱导ＶＳＭＣＰＣＮＡ表达。见表３。
表３ 大黄素对ＶＳＭＣＰＣＮＡ阳性细胞的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝８）
组别 剂量／μｍｏｌ·Ｌ－１ Ａ
空白 － ００４２±０００５２）
ＡｎｇⅡ － ００５６±０００４
ＡｎｇⅡ＋大黄素 １０ ００３５±０００３１）
２０ ００２９±０００２２）
４０ ００２２±０００２２）
８０ ００１４±０００２２）
注：与ＡｎｇⅡ组比较１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１
３．５ 大黄素对ＶＳＭＣ分泌ＮＯ，ｉＮＯＳ，ＮＯＳ的影响
ＡｎｇⅡ作用ＶＳＭＣ７２ｈ后，培养液中ＮＯ水平明
显降低，与空白组比较有显著性差异（Ｐ＜００１）；大
黄素作用细胞后ＮＯ水平升高，与ＡｎｇⅡ组比较有显
著性差异（Ｐ＜００５或Ｐ＜００１）。ＡｎｇⅡ作用ＶＳＭＣ
７２ｈ后培养液中ＮＯＳ及ｉＮＯＳ水平降低，与空白组比
较有显著性差异（Ｐ＜００１）；大黄素作用细胞后ＮＯＳ
及ｉＮＯＳ水平升高，与 ＡｎｇⅡ组比较有显著性差异（Ｐ
＜００５，Ｐ＜００１），说明大黄素可增加ＮＯ分泌，升高
培养液中ＮＯＳ及ｉＮＯＳ水平。见表４。
表４ 大黄素对ＶＳＭＣ分泌ＮＯ，ｉＮＯＳ，ＮＯＳ水平的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
组别 剂量／μｍｏｌ·Ｌ－１ ＮＯ／μｍｏｌ·Ｌ－１ ＮＯＳ／Ｕ·Ｌ－１ ｉＮＯＳ／Ｕ·Ｌ－１
空白 － ２５３７±０５５２） ２１２１±０７５２） １２４８±０８９２）
ＡｎｇⅡ － １９２５±０７２ １６５３±０６１ ８４７±０９２
ＡｎｇⅡ＋大黄素 １０ ２０６４±０７４１） １７８０±０６５１） ９９８±０５５１）
２０ ２１８７±０６６２） １８７５±０７０２） １０７２±０８６２）
４０ ２３９８±０６５２） １９８３±０８１２） １１８８±０９６２）
８０ ２５０１±０４２２） ２１０９±０７２２） １２５２±０８８２）
注：与ＡｎｇⅡ组比较１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１
３．６ 大黄素对ＡｎｇⅡ诱导 ＶＳＭＣｉＮＯＳｍＲＮＡ表达
的影响 ＲＴＰＣＲ结果表明：ＡｎｇⅡ作用细胞后ｉＮＯＳ
ｍＲＮＡ表达水平明显降低，与空白组比较有显著性
差异（Ｐ＜００１）。大黄素作用细胞 ７２ｈ后，ｉＮＯＳ
ｍＲＮＡ表达有不同程度增加，与 ＡｎｇⅡ组比较有显
著性差异（Ｐ＜００１），说明大黄素可增加 ｉＮＯＳｍＲ
ＮＡ表达。见图１。
图１ 大黄素对ＡｎｇⅡ诱导ＶＳＭＣｉＮＯＳｍＲＮＡ表达的影响
１．ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；２．大黄素８０μｍｏｌ·Ｌ－１＋ＡｎｇⅡ；
３．大黄素４０μｍｏｌ·Ｌ－１＋ＡｎｇⅡ；４．大黄素２０μｍｏｌ·Ｌ－１＋ＡｎｇⅡ；
５．大黄素１０μｍｏｌ·Ｌ－１＋ＡｎｇⅡ；６．ＡｎｇⅡ；７．空白组
４ 讨论
ＶＳＭＣ异常增殖是许多心血管疾病的共同病理
过程，ＡｎｇⅡ在ＶＳＭＣ增殖中起重要作用。ＡｎｇⅡ和
ＮＯ相互作用，影响ＶＳＭＣ增殖，两者之间失去平衡
可能是某些心血管疾病发生发展的原因［９］。ＮＯ是
抑制ＶＳＭＣ增殖的一种重要调节因子［１０］，主要由
ＮＯＳ催化 Ｌ精氨酸生成。ＮＯＳ是 ＮＯ合成的限速
酶，对 ＮＯ的生成具有重要的影响［１１］，主要有神经
型（ｎＮＯＳ）、内皮型（ｅＮＯＳ）和诱生型（ｉＮＯＳ）３种。
ｉＮＯＳ在基础状态表达很低，但在各种刺激因素作用
下表达及激活，增加 ＮＯ的产生，ＮＯ通过抑制
ＶＳＭＣ增殖及迁移［１２，１３］等影响心血管疾病的发生和
发展。
本研究以体外培养的大鼠主动脉 ＶＳＭＣ为模
型，采用 ＡｎｇⅡ诱导 ＶＳＭＣ增殖，建立细胞增殖模
型。作者实验中发现：大黄素在１０～８０μｍｏｌ·Ｌ－１
能抑制ＡｎｇⅡ诱导的 ＶＳＭＣ增殖，在此剂量范围内
对细胞贴壁无影响，台盼蓝染色仅见少量死亡细胞，
所以抑制细胞增殖作用可排除是由于药物细胞毒产
生的。但该作用被ＮＯＳ抑制剂ＬＮＡＭＥ部分阻断，
提示通过ＮＯ信号通路可能是大黄素发挥作用的途
径之一。
ＰＣＮＡ是一种核蛋白，它的表达与细胞增殖有
关，静止期细胞 ＰＣＮＡ表达很低，增殖活跃的细胞
ＰＣＮＡ表达明显增强，大黄素能抑制ＶＳＭＣＰＣＮＡ的
表达，说明大黄素可抑制细胞增殖。此外大黄素能
升高培养液中ＮＯ，ＮＯＳ水平，伴随 ＮＯ，ＮＯＳ水平增
高，抑制ＶＳＭＣ增殖的程度增强，支持大黄素是通过
ＮＯ信号通路发挥作用的。大黄素可升高培养液中
ｉＮＯＳ水平，并上调培养细胞中ｉＮＯＳｍＲＮＡ的表达，
进一步说明大黄素通过增加细胞ｉＮＯＳｍＲＮＡ表达，
从而升高ｉＮＯＳ水平，进一步升高ＮＯＳ水平，并相应
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增加ＮＯ水平来发挥抗增殖作用的。大黄素除通过
ＮＯ信号途径发挥抗增殖作用外，还可能有其他信
号途径，有待进一步深入研究。
［参考文献］
［１］ ＭｉｌｅｒＤＮ，ＢｏｎｌｅｎｄｅｒＪ，ＨｉｌｇｅｓＫＦ，ｅｔａｌ．Ｖａｓｃｕｌａｒａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ
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Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｍｏｄｉｎｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｒａｔｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈ
ｍｕｓｃｌｅｃｅｌｉｎｄｕｃｅｄｂｙａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎⅡ
ＹＡＮＧＹｕｍｉｎ１，ＷＡＮＧＳｈｉｊｕｎ１，ＪＩＮＤａｎｄａｎ２，ＬＩＵＹｕｎｙｉｎｇ２，ＷＡＮＧＸｉｎｇｘｉａｎｇ１，ＣＨＥＮＪｕｎｚｈｕ１
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒＤｉｓｅａｓｅ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＡｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＺｈｅＪｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１０００３，Ｃｈｉｎａ；
２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｇｅｎｉｃＢｉｏｌｏｇｙ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００３１，Ｃｈｉａｎ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｅｍｏｄｉｎｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｒａｔｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌ
（ＶＳＭＣ）ｉｎｄｕｃｅｄｂｙａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＶＳＭＣｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙｅｘｐｌａｎｔｍｅｔｈｏｄ．Ｃｅｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｍｏｄｅｌｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙ
ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｗｉｔｈＡｎｇⅡ．ＣｅｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＭＴＴａｓｓａｙｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｅｍｏｄｉｎ（１０，２０，４０ａｎｄ８０μｍｏｌ·
Ｌ－１）ａｎｄＮＧｎｉｔｒｏＬａｒｇｉｎｉｎｅｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ（ＬＮＡＭＥ，１００μｍｏｌ·Ｌ－１）ｏｎＶＳＭＣｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙＡｎｇⅡ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
ＰＣＮＡｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ（ＮＯ）ｌｅｖｅｌｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＧｒｉｅｓｓｒｅａｇｅｎｔ．Ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ
（ＮＯＳ）ａｎｄｉｎｄｕｃｉｂｌｅｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ（ｉＮＯＳ）ｌｅｖｅｌｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄ．ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉＮＯＳ
ｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴＰＣＲ）．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｅｍｏｄｉｎａｔｔｈｅｄｏｓｅｓｒａｎｇｅｆｒｏｍ１０ｔｏ８０ｍｏｌ·
Ｌ－１ｉｎｈｉｂｉｔｅｄｃｅｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎａｄｏｓｅａｎｄｔｉｍｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ．Ｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｅｃｔｓｗｅｒｅｐａｒｔｌｙｂｌｏｃｋｅｄｂｙ１００ｍｏｌ·Ｌ－１ｏｆＬ
ＮＡＭＥ．ＥｍｏｄｉｎｍａｒｋｅｄｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＣＮＡｉｎＶＳＭＣ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄＮＯ，ＮＯＳａｎｄｉＮＯＳｌｅｖｅｌｓ，ａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｉＮＯＳｍＲ
ＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＶＳＭＣ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＥｍｏｄｉｎｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｅＶＳＭＣｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙＡｎｇⅡ．ＩｎｈｉｂｉｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＣ
ＮＡ，ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｔｈｅＮＯｓｅｃｒｅｔｉｏｎａｎｄｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｉＮＯＳｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｉｇｈｔｂｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｅｃｔｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｅｍｏｄｉｎ；ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩ；ＶＳＭＣ；ＮＯ；ＮＯＳ
［责任编辑 古云侠］
·７６·
第３３卷第１期
２００８年１月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ １
Ｊａｎｕａｒｙ，２００８