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Assay of evodin, evodiamine and rutaecarpine in Fructus Evodiae by QAMS

一测多评法测定吴茱萸中吴茱萸内酯、吴茱萸碱及吴茱萸次碱的含量



全 文 :一测多评法测定吴茱萸中吴茱萸内酯、吴茱萸碱及
吴茱萸次碱的含量
宋亚芳1,2,王智民1,朱晶晶1,闫丽华1,张启伟1,龚慕辛1,高慧敏1,
冯伟红1,王维皓1
(1.中国中医科学院 中药研究所,北京 100700;
2.河南中医学院,河南 郑州 450008)
[摘要] 目的:建立吴茱萸一测多评的含量测定方法,考察不同类型化合物之间采用相对校正因子进行一测多评含量测
定的准确性和可行性。方法:以吴茱萸为研究对象,建立吴茱萸次碱与吴茱萸内酯、吴茱萸碱的相对校正因子,并用该校正因
子进行吴茱萸内酯、吴茱萸碱的含量计算,实现一测多评;同时采用外标法测定药材中吴茱萸内酯、吴茱萸碱及吴茱萸次碱的
含量,并比较计算值与实测值的差异。结果:11批吴茱萸药材中2种成分含量的计算值与实测值间无显著差异(RSD<5%)。
结论:以外标法测定吴茱萸次碱,利用相对校正因子实现对吴茱萸内酯和吴茱萸碱测定是准确的、可行的,一测多评法可以用
于特定的不同类型成分间的测定。
[关键词] “一测多评”法;吴茱萸;吴茱萸内酯;吴茱萸碱;吴茱萸次碱
[收稿日期] 20090306
[基金项目] 2007年中医药行业科技专项(200707007,200707009);国
家十一五支撑计划项目(2006BAI08B03);《中国药典》2010版一部标准研
究()
[通讯作者] 王智民,Tel/Fax:(010)84014128,Email:zhmw123@
263.net
  吴茱萸为芸香科植物吴茱萸 Evodiarutaecarpa
(Juss.)Benth.、石虎 E.rutaecarpa(Juss.)Benth.
var.oficinalis(Dode)Huang或疏毛吴茱萸 E.ru
taecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang
的干燥近成熟果实,有温中散寒、疏肝止痛之功效,
常用于治疗脘腹冷痛、呕吐腹泻、头痛、胃痛、疝痛、
腹痛和痛经等。生物碱是吴茱萸药材中的有效成
分,现行版的《中国药典》也以吴茱萸碱和吴茱萸次
碱含量总和作为质量控制指标[1]。但是,上述2个
成分在吴茱萸药材中含量很低,并且研究发现这类成
分在临床用药的水煎过程中出率很低(约10%)。而
吴茱萸内酯等柠檬苦素类物质是吴茱萸中除生物碱
之外的另一大类有效成分,研究表明吴茱萸内酯有很
强的抗炎、镇痛、抗肿瘤等活性[2],并且在吴茱萸药材
中的含量明显高于吴茱萸碱和吴茱萸次碱,文献报
道,吴茱萸内酯、吴茱萸次碱和吴茱萸碱三者总含量
可达到1%以上,因此笔者认为增加吴茱萸内酯作为
吴茱萸质量控制指标更具合理性。
目前已有用多个成分同步测定来控制吴茱萸质
量的研究报道[34],但是对照品供应严重不足限制了
该方法在实际的科研、生产和市场监督中的应用。针
对这种现状,我们提出应用“一测多评”法(QAMS)开
展吴茱萸多指标质量控制的研究设想。即只测定其
中一个成分(吴茱萸次碱),通过建立该成分与其他有
效成分(吴茱萸碱、吴茱萸内酯)间的相对校正因子,
计算出其他成分的含量,实现多成分的同步测定。
关于“一测多评”的研究思路已在木通[5]、人
参[6]等药材得到验证,笔者分别建立了皂苷、生物
碱等同类成分间的相对校正因子。本文建立了不同
类成分之间的相对校正因子,重点探讨“一测多评”
法在不同类成分之间应用的可行性与适应性。
1 试药与仪器
Waters26952996高效液相色谱系统,Empow
er2工作站;HP1100高效液相色谱系统,HP化学工
作站)。AE240电子分析天平(METTLER)。KQ
100型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)。乙腈为
色谱纯(Fisher公司);水为娃哈哈纯净水;其他试剂
均为分析纯。吴茱萸药材购自湖南、贵州、广西等
省,经中国中医科学院中药研究所生药室何希荣主
管药师鉴定,均为药典收载的品种。
吴茱萸内酯(批号 110800200404),吴茱萸碱
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(批号110802200505),吴茱萸次碱(批号110802
200505)购于中国药品生物制品检定所。
2 方法与结果
2.1 原理
在一定的范围内成分的量(质量或浓度)与检
测器响应成正比,即:W=fA。在吴茱萸的多指标质
量评价时,以吴茱萸次碱为参照物,建立吴茱萸次碱
碱与其他成分(吴茱萸碱、吴茱萸内酯)之间的相对
校正因子;在实际测定时,用外标法测定吴茱萸次
碱,再通过校正因子计算吴茱萸和吴茱萸内酯含量。
同时用常规方法进行同步测定,以验证计算值的正
确性和可行性。
2.2 一测多评方法学考察
2.2.1 色谱条件 EclipseXDBC18色谱柱(46mm×
250mm,5μm);流动相乙腈水四氢呋喃冰醋酸
(41∶59∶1∶02);柱温30℃;流速10mL·min-1。
检测波长225nm;理论塔板数以吴茱萸碱计不低于
3000,上述色谱条件下,各组分分离度良好。对照
品与样品色谱图见图1。
2.2.2 对照品溶液制备 精密称取吴茱萸内酯
48mg,吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品各070mg,
置2mL量瓶中,用甲醇溶解稀释至刻度,并保存于
4℃冰箱中,备用。
2.2.3 供试品溶液的制备 取吴茱萸粉末(过40
A.吴茱萸混合对照品;B.样品(产地贵州);
1.吴茱萸内酯;2.吴茱萸碱;3.吴茱萸次碱。
图1 吴茱萸对照品和样品的HPLC图
目筛)约05g,精密称定,置50mL三角瓶中,精密
加入80%乙醇溶液25mL,称重,冷浸1h,超声40
min,称重补失,摇匀,过022μm微孔滤膜,弃去初
滤液,取续滤液备用。
2.2.4 检测波长的选择 吴茱萸碱最大吸收波长
在225nm,且230nm后吸收曲线陡降;吴茱萸次碱
最大吸收波长在343nm,在220~240nm为强吸收
肩峰;吴茱萸内酯的最大吸收波长为192nm,在225
nm有较强的吸收。因此,要同时测定三者,以选择
225nm为佳。吴茱萸内酯、吴茱萸碱,吴茱萸次碱
在190~400nm进行全波长扫描。见图2。
A.吴茱萸内酯;B.吴茱萸碱;C.吴茱萸次碱。
图2 3种对照品紫外吸收图谱
2.2.5 线性范围 精密吸取吴茱萸内酯、吴茱萸碱
和吴茱萸次碱系列混合标准溶液,分别进样10μL,测
定峰面积积分值。以峰面积积分值对进样量进行回
归处理,结果表明吴茱萸内酯在0375~240μg呈良
好的线性关系,回归方程为Y=148×105X+122×104
(r=09999);吴茱萸碱在00547~350μg呈良好的
线性关系,回归方程为Y=108×107X-447×105(r=
09999);吴茱萸次碱在00547~350μg呈良好的线
性关系,回归方程为Y=583×106X-507×103(r=
09999)。
2.2.6 精密度试验 取贵州1#供试品溶液,连续
进样6次,每次进样10μL,结果吴茱萸内酯、吴茱
萸碱和吴茱萸次碱峰面积 RSD分别为 050%,
057%和038%。仪器及进样精密度良好。
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2.2.7 重复性试验 取河南3#样品约 05g,共
6份,精密称定,按223项下制备供试品溶液并
测定,6份样品中吴茱萸内酯的平均含量为
106%,RSD13%,吴茱萸碱的平均含量为
0180%,RSD14%,吴茱萸次碱平均质量分数
为0133%,RSD078%(n=6),表明方法重复
性良好。
2.2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液,分别在
0,2,4,8,24h进样分析,每次进样10μL,记录峰面
积,吴茱萸内酯、吴茱萸碱和吴茱萸次碱峰面积的
RSD分别为23%,11%和23%。表明供试品溶
液在24h内稳定。
2.2.9 回收率试验 精密称取河南3#样品共18
份,每份约025g,随机选取其中6份样品精密加入
含0106g·L-1吴茱萸内酯的 80%乙醇溶液 25
mL,随机选取另6份样品精密加入含00180g·
L-1吴茱萸碱的80%乙醇溶液25mL,剩余6份样品
中精密加入含00133g·L-1吴茱萸次碱的80%乙
醇溶液25mL,按供试品溶液制备方法操作,计算各
成分的加样回收率,结果见表1。
表1 3种对照品加样回收率试验
化学成分 称样量/g 样品中量/mg 加入量/mg 实测量/mg 回收率/% 平均值/% RSD/%
吴茱萸内酯 25000 2650 2650 5215 968 985 13
  25010 2651 2650 5309 1003    
  25020 2652 2650 5280 992    
  25030 2653 2650 5281 992    
  24970 2647 2650 5237 977    
  25010 2651 2650 5249 980    
吴茱萸碱  02501 0450 0450 0893 983 996 27
  02503 0451 0450 0918 1038    
  02498 0450 0450 0904 1010    
  02500 0450 0450 0902 1004    
  02500 0450 0450 0902 1004    
  02495 0449 0450 0882 962    
吴茱萸次碱 02503 0333 0333 0668 1006 1004 10
  02501 0333 0333 0666 1002    
  02497 0332 0333 0661 988    
  02500 0333 0333 0665 997    
  02504 0333 0333 0671 1016    
  02504 0333 0333 0670 1013    
2.2.10 相对校正因子的计算 在一定的范围内成
分的量(质量或浓度)与检测器响应成正比,即 W=
fA。在吴茱萸的多指标质量评价时,以药材中的吴茱
萸次碱为内参物,建立吴茱萸次碱(rutacarpine,RU)与
吴茱萸内酯(evodin,ED)、吴茱萸碱(evodiamine,EV)之
间的相对校正因子。相对校正因子的定义如下:
fsm=
fs
fm

Ws×Am
Wm×As
公式(1)
As,Am分别为内参物s和其他成分m的峰面积,
Ws,Wm分别为内参物s和其他成分m的量。根据公
式(1)求出吴茱萸内酯、吴茱萸碱相对于吴茱萸次
碱的相对校正因子如下:
fRU/ED=002534,fRU/EV=1849
2.3 一测多评法与外标法测定结果的比较
按供试品溶液处理方法制备了11批吴茱萸样
品,分别精密吸取供试品溶液各10μL注入高效液相
色谱仪,测定。采用外标法和“一测多评”法分别计算
吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸内酯含量,结果见表2。
表2吴茱萸药材中吴茱萸内酯、吴茱萸碱和
吴茱萸次碱的质量分数 mg·g-1 
产地
吴茱萸内酯
外标法 QAMSRSD/%
吴茱萸碱
外标法 QAMSRSD/%
吴茱萸次
碱外标法
湖南 160 171 333 105 101 182 0890
江西 127 136 324 284 272 213 253
浙江 104 111 326 054 0519 194 0666
北京 940 100 318 130 124 238 201
泸州 154 165 343 122 117 216 105
贵州 145 154 305 276 265 210 237
陕西 476 507 314 984 941 223 672
广西 332 353 307 148 141 227 101
磐安 230 246 341 160 154 194 093
湖北 223 238 328 485 465 213 277
浙江 190 202 307 197 189 220 112
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  从其含量间的相对标准偏差来看,在4%以内;
表明两种含量测定方法得到的含量值之间差异不
大,说明在吴茱萸的生物碱和内酯间应用“一测多
评”法进行质量评价是可行的。
2.4 校正因子的重复性考察
2.4.1 不同色谱柱及高效液相色谱仪考察 取
222项下系列混合对照品溶液,进样10μL测定,
按2210项下计算吴茱萸内酯、吴茱萸碱相对于吴
茱萸次碱的相对校正因子。考察了 Waters2695
2996、HP11002种高效液相色谱系统和 Eclipse
XDBC18(46mm×250mm,5μm)、KromasilC18
(46mm×250mm,5μm)2种色谱柱,结果见表3。
表3 不同仪器和色谱柱测得相对校正因子
不同仪器 不同柱子
ValuesofRCF
RCFED/RU RCFEV/RU
Waters Eelipse 002534 1849
  Kromasil 002448 1774
HP Eelipse 002601 1798
  Kromasil 002503 1783
Mean   002522 1801
RSD(%)   25 18
2.4.2 待测组分色谱峰的定位 利用待测组分与内
参物保留时间的比值(相对保留值)定位,已知内参物
的保留时间,根据相对保留值(RT),结合紫外吸收特
征,即能够判断出目标峰的位置。结果见表4。
表4 不同仪器和色谱柱测得的相对保留值
不同仪器 不同色谱柱
相对保留值
tRED/RU tREV/RTRU
Waters Eelipse 04678 08203
  Kromasil 04858 08417
HP Eelipse 04685 08142
  Kromasil 04842 08326
Mean   04766 08272
RSD(%)   205 149
3 讨论
3.1 内参物的选择
本实验研究建立了吴茱萸药材中不同类成分的
“一测多评”测定法并证明其可行性。实验发现,以
吴茱萸次碱为内参物,采用相对校正因子计算样品
中其他两种成分的含量与实测结果误差最小,而以
吴茱萸内酯或吴茱萸碱为内参物计算其他两种成分
含量与实测结果误差大于5%。
3.2 耐用性考察
采用相同溶剂系统,考察比例的微小变化(乙
腈水四氢呋喃冰醋酸405∶585∶1∶02),检测波
长的微小变化(224nm),柱温设定与否(30℃与室
温),对 QAMS法测定结果准确性的影响,结果计算
值与实测值相比,RSD>5%。推测原因是上述微小
变化可导致保留时间不一致,并引起峰面积显著变
化,导致原相对校正因子变化大,影响准确性。
3.3 供试品溶液制备方法的选择
考察了 50%,70%,100%甲醇和 50%,80%,
95%乙醇6种溶液对吴茱萸中吴茱萸内酯、吴茱萸
碱、吴茱萸次碱提取效率的影响,结果表明以80%
乙醇提取,3种成分提取效率均为最高。以80%乙
醇做溶剂,比较超声和回流提取方法对提取结果的
影响,结果差异不明显。以80% 乙醇做溶剂,分别
超声30,40,50min,结果40,50min均较30min提
取完全,但40,50min差异较小。故确定以80%乙
醇超声提取40min,考察了加25,50,100mL80%乙
醇的提取效率,结果三者没有明显差别,故确定以
25mL80%乙醇超声40min;浸泡30min和1h后
超声提取40min,结果浸泡1h的峰面积明显高于
浸泡30min,故确定以25mL80%乙醇,浸泡1h后
超声40min。
3.4 流动相的选择
实验比较了甲醇水、乙腈水、乙腈水冰醋酸、
乙腈水四氢呋喃冰醋酸[7]及其不同比例洗脱系
统,结果发现乙腈水四氢呋喃冰醋酸(41∶59∶1∶
02)的分离效果最好且达到基线分离。流动相中
加入冰醋酸,可以改善分离效果,防止拖尾,使峰形
尖锐、对称,加入四氢呋喃增加了流动相对样品的溶
解性。
3.5 质量评价
含量测定结果发现,同一批样品中吴茱萸内酯、
吴茱萸碱和吴茱萸次碱3种成分的含量差异很大,
吴茱萸内酯的含量范围在10% ~47%,吴茱萸碱
的含量范围在005% ~14%,吴茱萸次碱的含量
范围在006% ~10%。吴茱萸内酯、吴茱萸碱和
吴茱萸次碱3种成分的含量差异很大,吴茱萸内酯
的含量分别为吴茱萸碱的3至24倍;为吴茱萸次碱
的4至29倍。而吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量差
异较小,通常前者含量是后者的1至25倍。吴茱
萸中吴茱萸内酯、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量之
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和仅为1%,吴茱萸碱和吴茱萸次碱的的含量只占
01%左右,并且吴茱萸内酯在临床用药的水煎过程
中煎出率达50%,而生物碱类成分煎出率很低,因
此,用吴茱萸内酯、吴茱萸碱和吴茱萸次碱三者的含
量评价吴茱萸质量更具合理性的。测定结果中,总
量较高的样品(贵州、湖南,广西)多来源于道地产
地,与传统对吴茱萸药材质量的认识相符。
通过此试验验证“一测多评”法用于吴茱萸不
同类成分间测定的可行性;但“一测多评”法还需进
一步完善和验证,确定方法的适用范围和局限,使其
能应用于中药质量控制。
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Assayofevodin,evodiamineandrutaecarpineinFructusEvodiaebyQAMS
SONGYafang1,2,WANGZhimin1,ZHUJingjing1,YANLihua1,ZHANGQiwei1,GONGMuxin1,GAOHuimin1,
FENGWeihong1,WANGWeihao1
(1.InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China;
2.He'nanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450008,China)
[Abstract] Objective:TodevelopaQuantitativeAssayofMulticomponentsbySingle-marker(QAMS)forsimultaneousde
terminationofthreecomponentsinFructusEvodiae,andexaminethefeasibilityofusingtherelativecorectionfactorsbetweenthedif
ferenttypesofcompounds.Method:Rutaecarpinewasselectedastheinternalreferencesubstance;therelativecorectionfactorsof
evodinandevodiaminewerecalculated.Thecontentsofthreecomponentsin11batchesofsamplesweredeterminedbybothexternal
standardmethodandQAMS.ThevalidityoftheQAMSmethodwasevaluatedbycomparisonoftheirquantitativeresults.Results:No
obviousdiferences(RSD<5%)werefoundinthequantitativeresultsofevodinandevodiaminein11batchesofFructusEvodiaede
terminedbythetwomethods.Conclusion:ItisfeasibleandsuitabletodetermineevodinandevodiamineinFructusEvodiaeby
QAMS,andthismethodcanbeusedforacertaindiferenttypesofcompounds.
[Keywords] QuantitativeAssayofMulticomponentsbySinglemarker;FructusEvodiae;evodin;evodiamine;rutaecarpine
[责任编辑 王亚君]
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