全 文 :一测多评法测定吴茱萸中吴茱萸内酯、吴茱萸碱及
吴茱萸次碱的含量
宋亚芳1,2,王智民1,朱晶晶1,闫丽华1,张启伟1,龚慕辛1,高慧敏1,
冯伟红1,王维皓1
(1.中国中医科学院 中药研究所,北京 100700;
2.河南中医学院,河南 郑州 450008)
[摘要] 目的:建立吴茱萸一测多评的含量测定方法,考察不同类型化合物之间采用相对校正因子进行一测多评含量测
定的准确性和可行性。方法:以吴茱萸为研究对象,建立吴茱萸次碱与吴茱萸内酯、吴茱萸碱的相对校正因子,并用该校正因
子进行吴茱萸内酯、吴茱萸碱的含量计算,实现一测多评;同时采用外标法测定药材中吴茱萸内酯、吴茱萸碱及吴茱萸次碱的
含量,并比较计算值与实测值的差异。结果:11批吴茱萸药材中2种成分含量的计算值与实测值间无显著差异(RSD<5%)。
结论:以外标法测定吴茱萸次碱,利用相对校正因子实现对吴茱萸内酯和吴茱萸碱测定是准确的、可行的,一测多评法可以用
于特定的不同类型成分间的测定。
[关键词] “一测多评”法;吴茱萸;吴茱萸内酯;吴茱萸碱;吴茱萸次碱
[收稿日期] 20090306
[基金项目] 2007年中医药行业科技专项(200707007,200707009);国
家十一五支撑计划项目(2006BAI08B03);《中国药典》2010版一部标准研
究()
[通讯作者] 王智民,Tel/Fax:(010)84014128,Email:zhmw123@
263.net
吴茱萸为芸香科植物吴茱萸 Evodiarutaecarpa
(Juss.)Benth.、石虎 E.rutaecarpa(Juss.)Benth.
var.oficinalis(Dode)Huang或疏毛吴茱萸 E.ru
taecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang
的干燥近成熟果实,有温中散寒、疏肝止痛之功效,
常用于治疗脘腹冷痛、呕吐腹泻、头痛、胃痛、疝痛、
腹痛和痛经等。生物碱是吴茱萸药材中的有效成
分,现行版的《中国药典》也以吴茱萸碱和吴茱萸次
碱含量总和作为质量控制指标[1]。但是,上述2个
成分在吴茱萸药材中含量很低,并且研究发现这类成
分在临床用药的水煎过程中出率很低(约10%)。而
吴茱萸内酯等柠檬苦素类物质是吴茱萸中除生物碱
之外的另一大类有效成分,研究表明吴茱萸内酯有很
强的抗炎、镇痛、抗肿瘤等活性[2],并且在吴茱萸药材
中的含量明显高于吴茱萸碱和吴茱萸次碱,文献报
道,吴茱萸内酯、吴茱萸次碱和吴茱萸碱三者总含量
可达到1%以上,因此笔者认为增加吴茱萸内酯作为
吴茱萸质量控制指标更具合理性。
目前已有用多个成分同步测定来控制吴茱萸质
量的研究报道[34],但是对照品供应严重不足限制了
该方法在实际的科研、生产和市场监督中的应用。针
对这种现状,我们提出应用“一测多评”法(QAMS)开
展吴茱萸多指标质量控制的研究设想。即只测定其
中一个成分(吴茱萸次碱),通过建立该成分与其他有
效成分(吴茱萸碱、吴茱萸内酯)间的相对校正因子,
计算出其他成分的含量,实现多成分的同步测定。
关于“一测多评”的研究思路已在木通[5]、人
参[6]等药材得到验证,笔者分别建立了皂苷、生物
碱等同类成分间的相对校正因子。本文建立了不同
类成分之间的相对校正因子,重点探讨“一测多评”
法在不同类成分之间应用的可行性与适应性。
1 试药与仪器
Waters26952996高效液相色谱系统,Empow
er2工作站;HP1100高效液相色谱系统,HP化学工
作站)。AE240电子分析天平(METTLER)。KQ
100型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)。乙腈为
色谱纯(Fisher公司);水为娃哈哈纯净水;其他试剂
均为分析纯。吴茱萸药材购自湖南、贵州、广西等
省,经中国中医科学院中药研究所生药室何希荣主
管药师鉴定,均为药典收载的品种。
吴茱萸内酯(批号 110800200404),吴茱萸碱
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(批号110802200505),吴茱萸次碱(批号110802
200505)购于中国药品生物制品检定所。
2 方法与结果
2.1 原理
在一定的范围内成分的量(质量或浓度)与检
测器响应成正比,即:W=fA。在吴茱萸的多指标质
量评价时,以吴茱萸次碱为参照物,建立吴茱萸次碱
碱与其他成分(吴茱萸碱、吴茱萸内酯)之间的相对
校正因子;在实际测定时,用外标法测定吴茱萸次
碱,再通过校正因子计算吴茱萸和吴茱萸内酯含量。
同时用常规方法进行同步测定,以验证计算值的正
确性和可行性。
2.2 一测多评方法学考察
2.2.1 色谱条件 EclipseXDBC18色谱柱(46mm×
250mm,5μm);流动相乙腈水四氢呋喃冰醋酸
(41∶59∶1∶02);柱温30℃;流速10mL·min-1。
检测波长225nm;理论塔板数以吴茱萸碱计不低于
3000,上述色谱条件下,各组分分离度良好。对照
品与样品色谱图见图1。
2.2.2 对照品溶液制备 精密称取吴茱萸内酯
48mg,吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品各070mg,
置2mL量瓶中,用甲醇溶解稀释至刻度,并保存于
4℃冰箱中,备用。
2.2.3 供试品溶液的制备 取吴茱萸粉末(过40
A.吴茱萸混合对照品;B.样品(产地贵州);
1.吴茱萸内酯;2.吴茱萸碱;3.吴茱萸次碱。
图1 吴茱萸对照品和样品的HPLC图
目筛)约05g,精密称定,置50mL三角瓶中,精密
加入80%乙醇溶液25mL,称重,冷浸1h,超声40
min,称重补失,摇匀,过022μm微孔滤膜,弃去初
滤液,取续滤液备用。
2.2.4 检测波长的选择 吴茱萸碱最大吸收波长
在225nm,且230nm后吸收曲线陡降;吴茱萸次碱
最大吸收波长在343nm,在220~240nm为强吸收
肩峰;吴茱萸内酯的最大吸收波长为192nm,在225
nm有较强的吸收。因此,要同时测定三者,以选择
225nm为佳。吴茱萸内酯、吴茱萸碱,吴茱萸次碱
在190~400nm进行全波长扫描。见图2。
A.吴茱萸内酯;B.吴茱萸碱;C.吴茱萸次碱。
图2 3种对照品紫外吸收图谱
2.2.5 线性范围 精密吸取吴茱萸内酯、吴茱萸碱
和吴茱萸次碱系列混合标准溶液,分别进样10μL,测
定峰面积积分值。以峰面积积分值对进样量进行回
归处理,结果表明吴茱萸内酯在0375~240μg呈良
好的线性关系,回归方程为Y=148×105X+122×104
(r=09999);吴茱萸碱在00547~350μg呈良好的
线性关系,回归方程为Y=108×107X-447×105(r=
09999);吴茱萸次碱在00547~350μg呈良好的线
性关系,回归方程为Y=583×106X-507×103(r=
09999)。
2.2.6 精密度试验 取贵州1#供试品溶液,连续
进样6次,每次进样10μL,结果吴茱萸内酯、吴茱
萸碱和吴茱萸次碱峰面积 RSD分别为 050%,
057%和038%。仪器及进样精密度良好。
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2.2.7 重复性试验 取河南3#样品约 05g,共
6份,精密称定,按223项下制备供试品溶液并
测定,6份样品中吴茱萸内酯的平均含量为
106%,RSD13%,吴茱萸碱的平均含量为
0180%,RSD14%,吴茱萸次碱平均质量分数
为0133%,RSD078%(n=6),表明方法重复
性良好。
2.2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液,分别在
0,2,4,8,24h进样分析,每次进样10μL,记录峰面
积,吴茱萸内酯、吴茱萸碱和吴茱萸次碱峰面积的
RSD分别为23%,11%和23%。表明供试品溶
液在24h内稳定。
2.2.9 回收率试验 精密称取河南3#样品共18
份,每份约025g,随机选取其中6份样品精密加入
含0106g·L-1吴茱萸内酯的 80%乙醇溶液 25
mL,随机选取另6份样品精密加入含00180g·
L-1吴茱萸碱的80%乙醇溶液25mL,剩余6份样品
中精密加入含00133g·L-1吴茱萸次碱的80%乙
醇溶液25mL,按供试品溶液制备方法操作,计算各
成分的加样回收率,结果见表1。
表1 3种对照品加样回收率试验
化学成分 称样量/g 样品中量/mg 加入量/mg 实测量/mg 回收率/% 平均值/% RSD/%
吴茱萸内酯 25000 2650 2650 5215 968 985 13
25010 2651 2650 5309 1003
25020 2652 2650 5280 992
25030 2653 2650 5281 992
24970 2647 2650 5237 977
25010 2651 2650 5249 980
吴茱萸碱 02501 0450 0450 0893 983 996 27
02503 0451 0450 0918 1038
02498 0450 0450 0904 1010
02500 0450 0450 0902 1004
02500 0450 0450 0902 1004
02495 0449 0450 0882 962
吴茱萸次碱 02503 0333 0333 0668 1006 1004 10
02501 0333 0333 0666 1002
02497 0332 0333 0661 988
02500 0333 0333 0665 997
02504 0333 0333 0671 1016
02504 0333 0333 0670 1013
2.2.10 相对校正因子的计算 在一定的范围内成
分的量(质量或浓度)与检测器响应成正比,即 W=
fA。在吴茱萸的多指标质量评价时,以药材中的吴茱
萸次碱为内参物,建立吴茱萸次碱(rutacarpine,RU)与
吴茱萸内酯(evodin,ED)、吴茱萸碱(evodiamine,EV)之
间的相对校正因子。相对校正因子的定义如下:
fsm=
fs
fm
=
Ws×Am
Wm×As
公式(1)
As,Am分别为内参物s和其他成分m的峰面积,
Ws,Wm分别为内参物s和其他成分m的量。根据公
式(1)求出吴茱萸内酯、吴茱萸碱相对于吴茱萸次
碱的相对校正因子如下:
fRU/ED=002534,fRU/EV=1849
2.3 一测多评法与外标法测定结果的比较
按供试品溶液处理方法制备了11批吴茱萸样
品,分别精密吸取供试品溶液各10μL注入高效液相
色谱仪,测定。采用外标法和“一测多评”法分别计算
吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸内酯含量,结果见表2。
表2吴茱萸药材中吴茱萸内酯、吴茱萸碱和
吴茱萸次碱的质量分数 mg·g-1
产地
吴茱萸内酯
外标法 QAMSRSD/%
吴茱萸碱
外标法 QAMSRSD/%
吴茱萸次
碱外标法
湖南 160 171 333 105 101 182 0890
江西 127 136 324 284 272 213 253
浙江 104 111 326 054 0519 194 0666
北京 940 100 318 130 124 238 201
泸州 154 165 343 122 117 216 105
贵州 145 154 305 276 265 210 237
陕西 476 507 314 984 941 223 672
广西 332 353 307 148 141 227 101
磐安 230 246 341 160 154 194 093
湖北 223 238 328 485 465 213 277
浙江 190 202 307 197 189 220 112
03
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从其含量间的相对标准偏差来看,在4%以内;
表明两种含量测定方法得到的含量值之间差异不
大,说明在吴茱萸的生物碱和内酯间应用“一测多
评”法进行质量评价是可行的。
2.4 校正因子的重复性考察
2.4.1 不同色谱柱及高效液相色谱仪考察 取
222项下系列混合对照品溶液,进样10μL测定,
按2210项下计算吴茱萸内酯、吴茱萸碱相对于吴
茱萸次碱的相对校正因子。考察了 Waters2695
2996、HP11002种高效液相色谱系统和 Eclipse
XDBC18(46mm×250mm,5μm)、KromasilC18
(46mm×250mm,5μm)2种色谱柱,结果见表3。
表3 不同仪器和色谱柱测得相对校正因子
不同仪器 不同柱子
ValuesofRCF
RCFED/RU RCFEV/RU
Waters Eelipse 002534 1849
Kromasil 002448 1774
HP Eelipse 002601 1798
Kromasil 002503 1783
Mean 002522 1801
RSD(%) 25 18
2.4.2 待测组分色谱峰的定位 利用待测组分与内
参物保留时间的比值(相对保留值)定位,已知内参物
的保留时间,根据相对保留值(RT),结合紫外吸收特
征,即能够判断出目标峰的位置。结果见表4。
表4 不同仪器和色谱柱测得的相对保留值
不同仪器 不同色谱柱
相对保留值
tRED/RU tREV/RTRU
Waters Eelipse 04678 08203
Kromasil 04858 08417
HP Eelipse 04685 08142
Kromasil 04842 08326
Mean 04766 08272
RSD(%) 205 149
3 讨论
3.1 内参物的选择
本实验研究建立了吴茱萸药材中不同类成分的
“一测多评”测定法并证明其可行性。实验发现,以
吴茱萸次碱为内参物,采用相对校正因子计算样品
中其他两种成分的含量与实测结果误差最小,而以
吴茱萸内酯或吴茱萸碱为内参物计算其他两种成分
含量与实测结果误差大于5%。
3.2 耐用性考察
采用相同溶剂系统,考察比例的微小变化(乙
腈水四氢呋喃冰醋酸405∶585∶1∶02),检测波
长的微小变化(224nm),柱温设定与否(30℃与室
温),对 QAMS法测定结果准确性的影响,结果计算
值与实测值相比,RSD>5%。推测原因是上述微小
变化可导致保留时间不一致,并引起峰面积显著变
化,导致原相对校正因子变化大,影响准确性。
3.3 供试品溶液制备方法的选择
考察了 50%,70%,100%甲醇和 50%,80%,
95%乙醇6种溶液对吴茱萸中吴茱萸内酯、吴茱萸
碱、吴茱萸次碱提取效率的影响,结果表明以80%
乙醇提取,3种成分提取效率均为最高。以80%乙
醇做溶剂,比较超声和回流提取方法对提取结果的
影响,结果差异不明显。以80% 乙醇做溶剂,分别
超声30,40,50min,结果40,50min均较30min提
取完全,但40,50min差异较小。故确定以80%乙
醇超声提取40min,考察了加25,50,100mL80%乙
醇的提取效率,结果三者没有明显差别,故确定以
25mL80%乙醇超声40min;浸泡30min和1h后
超声提取40min,结果浸泡1h的峰面积明显高于
浸泡30min,故确定以25mL80%乙醇,浸泡1h后
超声40min。
3.4 流动相的选择
实验比较了甲醇水、乙腈水、乙腈水冰醋酸、
乙腈水四氢呋喃冰醋酸[7]及其不同比例洗脱系
统,结果发现乙腈水四氢呋喃冰醋酸(41∶59∶1∶
02)的分离效果最好且达到基线分离。流动相中
加入冰醋酸,可以改善分离效果,防止拖尾,使峰形
尖锐、对称,加入四氢呋喃增加了流动相对样品的溶
解性。
3.5 质量评价
含量测定结果发现,同一批样品中吴茱萸内酯、
吴茱萸碱和吴茱萸次碱3种成分的含量差异很大,
吴茱萸内酯的含量范围在10% ~47%,吴茱萸碱
的含量范围在005% ~14%,吴茱萸次碱的含量
范围在006% ~10%。吴茱萸内酯、吴茱萸碱和
吴茱萸次碱3种成分的含量差异很大,吴茱萸内酯
的含量分别为吴茱萸碱的3至24倍;为吴茱萸次碱
的4至29倍。而吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量差
异较小,通常前者含量是后者的1至25倍。吴茱
萸中吴茱萸内酯、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量之
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和仅为1%,吴茱萸碱和吴茱萸次碱的的含量只占
01%左右,并且吴茱萸内酯在临床用药的水煎过程
中煎出率达50%,而生物碱类成分煎出率很低,因
此,用吴茱萸内酯、吴茱萸碱和吴茱萸次碱三者的含
量评价吴茱萸质量更具合理性的。测定结果中,总
量较高的样品(贵州、湖南,广西)多来源于道地产
地,与传统对吴茱萸药材质量的认识相符。
通过此试验验证“一测多评”法用于吴茱萸不
同类成分间测定的可行性;但“一测多评”法还需进
一步完善和验证,确定方法的适用范围和局限,使其
能应用于中药质量控制。
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[7] 中国药典.一部[S].2000:136.
Assayofevodin,evodiamineandrutaecarpineinFructusEvodiaebyQAMS
SONGYafang1,2,WANGZhimin1,ZHUJingjing1,YANLihua1,ZHANGQiwei1,GONGMuxin1,GAOHuimin1,
FENGWeihong1,WANGWeihao1
(1.InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China;
2.He'nanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450008,China)
[Abstract] Objective:TodevelopaQuantitativeAssayofMulticomponentsbySingle-marker(QAMS)forsimultaneousde
terminationofthreecomponentsinFructusEvodiae,andexaminethefeasibilityofusingtherelativecorectionfactorsbetweenthedif
ferenttypesofcompounds.Method:Rutaecarpinewasselectedastheinternalreferencesubstance;therelativecorectionfactorsof
evodinandevodiaminewerecalculated.Thecontentsofthreecomponentsin11batchesofsamplesweredeterminedbybothexternal
standardmethodandQAMS.ThevalidityoftheQAMSmethodwasevaluatedbycomparisonoftheirquantitativeresults.Results:No
obviousdiferences(RSD<5%)werefoundinthequantitativeresultsofevodinandevodiaminein11batchesofFructusEvodiaede
terminedbythetwomethods.Conclusion:ItisfeasibleandsuitabletodetermineevodinandevodiamineinFructusEvodiaeby
QAMS,andthismethodcanbeusedforacertaindiferenttypesofcompounds.
[Keywords] QuantitativeAssayofMulticomponentsbySinglemarker;FructusEvodiae;evodin;evodiamine;rutaecarpine
[责任编辑 王亚君]
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