全 文 ：ｔｈｏｒａｃｉｃｃａｖｉｔｙｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓｉｎａｄｏｓｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒｉｎｖｉｔｒｏＩｔｉｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｃｔｉｏｎｏｆＳＴＯｉｓ
ｒｅｌａｔｅｄｔｏｉｔｓｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ５ＬＯａｎｄｄｅｃｒｅａｓｉｎｇｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｍａｊｏｒｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｍｅｄｉａｔｏｒｓＬＴＢ４
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｈｅｒｂａｓｃｈｉｚｏｎｅｐｅｔａｅｖｏｌａｔｉｌｅｏｉｌ；５ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ；ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅＢ４；５ｈｙｄｒｏｘｙ６，８，１１，１４ｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃａｃｉｄ；
ＲＰＨＰＬＣ
［责任编辑 古云侠］
［收稿日期］ ２００８０２１５
［基金项目］ 北京市自然科学基金项目（７０５３０７５）
［通讯作者］ 梁日欣，Ｔｅｌ：（０１０）６４０１４４１１２９４８，Ｅｍａｉｌ：ＲＸ
Ｌｉａｎｇ＠ｙａｈｏｏｃｏｍ
升麻苷和５Ｏ甲基维斯阿米醇苷对 ＴＮＦα所致
大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖的影响
王 岚，梁日欣，曹 莹，叶锦霞
（中国中医科学院 中药研究所，北京 １００７００）
［摘要］ 目的：观察升麻苷和５Ｏ甲基维斯阿米醇苷对血管平滑肌细胞增殖及细胞周期的影响。方法：建立
大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代培养方法，将细胞分为空白组、模型组、升麻苷组、５Ｏ甲基维斯阿米醇苷组，并采用
细胞计数法和免疫化学方法分别对平滑肌细胞的生长特性和纯度进行测定。用ＭＴＴ法观察升麻苷与５Ｏ甲基维
斯阿米醇苷各剂量组拮抗肿瘤坏死因子（ＴＮＦα）诱导平滑肌细胞增殖的作用，用流式细胞技术测定升麻苷与５Ｏ
甲基维斯阿米醇苷对平滑肌细胞周期的影响。结果：升麻苷（５０，１００，２００ｍｇ·Ｌ－１）和５Ｏ甲基维斯阿米醇苷（５０，
１００，２００ｍｇ·Ｌ－１）均能明显抑制ＴＮＦα引起的平滑肌细胞增殖，与ＴＮＦα组相比有极显著差异（Ｐ＜００１）。升麻
苷（５０，１００，２００ｍｇ·Ｌ－１）和５Ｏ甲基维斯阿米醇苷（５０，１００，２００ｍｇ·Ｌ－１）均使Ｇ１／Ｇ０期细胞比例增加，Ｓ期、Ｇ２／
Ｍ期细胞比例减少，与ＴＮＦα组相比差异极显著（Ｐ＜００１）。结论：升麻苷与５Ｏ甲基维斯阿米醇苷对 ＴＮＦα引
起的平滑肌细胞增殖有明显的抑制作用。
［关键词］ 升麻苷；５Ｏ甲基维斯阿米醇苷；动脉硬化；平滑肌细胞；炎性因子
［中图分类号］Ｒ２８５５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）１７２１５７０４
在动脉粥样硬化（ＡＳ）发生、发展过程中，血管
平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）的移行和过度增殖起着极其重
要的作用［１２］。血管内皮细胞受损时，释放大量的炎
性因子如肿瘤坏死因子（ＴＮＦα），白介素６（ＩＬ６）
等［３］，在这些炎性因子的刺激下，内皮细胞、巨噬细
胞及血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）可合成并分泌大量的
生长因子，如血小板源性生长因子（ＰＤＧＦ）、纤维母
细胞生长因子（ＦＧＦ）等，使内膜 ＳＭＣ增生，中膜
ＳＭＣ迁移至内皮下间隙，并通过其膜表面表达的脂
蛋白受体摄取脂质，形成肌源性泡沫细胞，产生胶
原、弹性纤维及蛋白多糖，致细胞外基质成分增多，
最终形成动脉粥样硬化［４］。
现代药理研究［５］表明，防风具有显著的抗炎活
性，进一步研究发现，升麻苷和 ５Ｏ甲基维斯阿米
醇苷是防风主要的抗炎成分。本项实验在以往工作
的基础上，观察升麻苷与５Ｏ甲基维斯阿米醇苷对
炎性因子刺激血管平滑肌细胞增殖及细胞周期的影
响，并探讨其对ＡＳ炎性反应的影响。
１ 材料
１１ 药物 升麻苷和５Ｏ甲基维斯阿米醇苷为防
风药材中提取分离得到，纯度＞９８％，由中国中医科
学院中药研究所化学室肖永庆研究员提供。
１２ 动物 健康Ｗｉｓｔａｒ大鼠，雌雄不拘，体重１５０～
１８０ｇ。由维通利华实验动物技术有限公司提供，合
格证号ＳＣＸＫ（京）２００２０００３。
１３ 试剂 ＤＭＥＭ培养基干粉（Ｈｙｃｌｏｎｅ，批号
ＡＰＨ２１７２４ＦＣ），优级新生牛血清（中美合资兰州民
海生物工程有限公司，批号 ２００６０５１６），青链霉素
（Ｈｙｃｌｏｎｅ，批号ＪＲＨ２７１７２），谷氨酰胺（Ｓｉｇｍａ公司，
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Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ １７
Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２００８
北京鼎国生物技术发展中心分装），０２５％胰蛋白
酶（Ｈｙｃｌｏｎｅ，批号 ＪＲＧ２６９６５），小鼠抗大鼠 αＳＭＡ
（α平滑肌肌动蛋白，武汉博士德生物工程有限公
司，批号２００６１２）抗体，小鼠 ＩｇＧＳＡＢＣ免疫组化试
剂盒 （武汉博士德生物工程有限公司，批号
２００６１２），肿瘤坏死因子（ＴＮＦα，北京天来生物医学
科技有限公司，批号 ＰＸ２０３９３，用含２０％新生牛血
清的 ＤＭＥＭ培养基配制），噻唑蓝（ＭＴＴ，Ｓｉｇｍａ，
ＳＰ１０８０），二甲基亚砜（ＤＭＳＯ，北京化学试剂公司，
批号３００７２４９２）。
１４ 仪器 超净工作台（北京半导体设备一厂），
ＭＣＯ－１５ＡＣ型 ＣＯ２培养箱（日本 ＳＡＮＹＯ公司），
ＭＫ型倒置显微镜（ＯＬＹＭＰＵＳ公司），５５０型酶联免
疫检测仪（日本 ＢＩＯ－ＲＡＤ产品），ＥＰＩＣＳＸＬ型流
式细胞仪（美国 Ｃｏｕｌｔｅｒ公司），微孔滤器（日本 Ｓａｒ
ｔｏｒｉｏｕｓ，批号１６５３４０３０３３５）。
２ 方法
２１ 大鼠胸主动脉平滑肌细胞培养方法的建立［６９］
大鼠乙醚麻醉后全身浸入７５％乙醇中消毒，置于
超净台内。Ｔ型剪开胸腹部皮肤及胸骨，暴露胸腹
腔。将大鼠左肺向右侧翻转，可见贴于脊柱右侧有
胸主动脉走行。上端沿主动脉弓，下端至膈的主动
脉裂孔处完整剪取胸主动脉，立即置于预冷的 ＰＢＳ
溶液中。
清除结缔组织，剥除动脉外膜。纵向剖开血管，
用眼科弯镊钝性刮除内膜面以去除内皮细胞。剩余
血管中膜组织较薄、透明、韧性好。用 ＰＢＳ溶液反
复冲洗，去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮
细胞和外膜成纤维细胞。然后将一次取材的２～３
条血管的中膜置于无菌培养皿中，滴加少许培养液
使组织保持湿润，用利刀切割动脉成１ｍｍ×１ｍｍ
大小的组织块。将切好的组织小块均匀摆置于无菌
一次性塑料培养皿中，内膜面向上，组织块间距０５
ｃｍ，使贴块有少许培养液。盖好皿盖，于３７℃培养
箱内放置２ｈ，使组织块干涸并与瓶壁贴附后，缓慢
加入含２０％新生牛血清的ＤＭＥＭ培养液，使组织块
完全浸入培养液中，置 ＣＯ２培养箱中，３７℃继续静
置培养７ｄ，避免振动和移动，待有细胞从组织块周
围游出后换液。
２２ 大鼠胸主动脉平滑肌细胞 α平滑肌肌动蛋白
（αＳＭＡ）免疫组化鉴定 用００１％多聚赖氨酸包
被载玻片１２ｈ，晾干，制作细胞爬片；用４％多聚甲
醛固定载玻片２０ｍｉｎ；加入１００μＬ０５％ＴｒｉｔｏｎＸ
１００孵育２０ｍｉｎ；加入１００μＬ０３％甲醇Ｈ２Ｏ２液孵
育１５ｍｉｎ；加入１００μＬ５％ＢＳＡ封闭液孵育２０ｍｉｎ；
加入１００μＬ一抗，阴性对照加 ＰＢＳ，湿盒内孵育４
℃过夜；加入１００μＬ生物素标记的抗小鼠 ＩｇＧ，孵
育２０ｍｉｎ；加入１００μＬ试剂 ＳＡＢＣ孵育２０ｍｉｎ，清
洗；ＤＡＢ显色，梯度乙醇脱水，二甲苯固定，封片，显
微镜下观察，照相。
２３ 大鼠胸主动脉平滑肌细胞生长曲线的绘制
将对数期生长细胞消化成单细胞悬液，调节细胞密
度为１×１０５个／ｍＬ，接种于２４孔板中，每孔加入０５
ｍＬ细胞悬液。１～７ｄ内每日对３孔细胞进行计数，
每孔细胞计数３次，计算其均值，培养第４天给未计
数细胞换液。以培养时间为横轴，细胞数的对数为
纵轴，在半对数坐标纸上绘图。
２４ 升麻苷与５Ｏ甲基维斯阿米醇苷拮抗 ＴＮＦα
诱导平滑肌细胞增殖的作用 平滑肌细胞以 ５×
１０４个／ｍＬ的密度接种于９６孔板，每孔０１ｍＬ，２４ｈ
细胞贴壁后，换为无血清培养基，孵育２４ｈ，使细胞
同步化于Ｇ０／Ｇ１期，然后将细胞分为以下几组：空白
组加入含２０％新生牛血清的 ＤＭＥＭ培养基；模型
组、升麻苷组、５Ｏ甲基维斯阿米醇苷组先分别加入
ＴＮＦα（终浓度为５μｇ·Ｌ－１），升麻苷组再加入不同
浓度的升麻苷（终浓度分别为 ５０，１００，２００ｍｇ·
Ｌ－１）；５Ｏ甲基维斯阿米醇苷组再加入不同浓度的
５Ｏ甲基维斯阿米醇苷（终浓度分别为５０，１００，２００
ｍｇ·Ｌ－１），共同孵育４８ｈ。将细胞上清液弃去，每
孔加入ＭＴＴ溶液（０５ｇ·Ｌ－１，无血清 ＤＭＥＭ培养
基配制，过滤）１００μＬ，３７℃，孵育４ｈ，终止培养，小
心吸弃孔内培养上清液。每孔加入１００μＬＤＭＳＯ，
振荡１０ｍｉｎ，使结晶物充分溶解，在５７０ｎｍ波长的
酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度（Ａ）。
２５ 升麻苷与５Ｏ甲基维斯阿米醇苷对平滑肌细
胞周期的影响 平滑肌细胞以细胞密度为５×１０４
个／ｍＬ接种于６孔板，每孔３ｍＬ，２４ｈ细胞贴壁后，
换为无血清培养基，孵育２４ｈ，使细胞同步化于Ｇ０／
Ｇ１期，然后将细胞分为以下几组：空白组加入含
２０％新生牛血清的ＤＭＥＭ培养基；模型组加入ＴＮＦ
α（终浓度为５μｇ·Ｌ－１）；升麻苷组加入 ＴＮＦα（终
浓度５μｇ·Ｌ－１）及不同浓度的升麻苷（５０，１００，２００
ｍｇ·Ｌ－１）；５Ｏ甲基维斯阿米醇苷组加入 ＴＮＦα
（终浓度５μｇ·Ｌ－１）及不同浓度的５Ｏ甲基维斯阿
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米醇苷（５０，１００，２００ｍｇ·Ｌ－１），共同孵育４８ｈ。将
细胞用０２５％的胰蛋白酶溶液消化成单细胞悬液，
离心（１０００ｒ·ｍｉｎ－１，５ｍｉｎ），弃上清液，加入 ＰＢＳ
溶液，重悬细胞，再次离心（１０００ｒ·ｍｉｎ－１，５ｍｉｎ），
将细胞重悬于７０％的冰乙醇溶液中，过夜。将各组
细胞用生理盐水轻洗一遍，分别加入５０μＬ的 ＲＮＡ
酶与ＰＩ（碘化丙啶）染液，３７℃孵育３０ｍｉｎ，３００目
尼龙筛网过滤后，上流式细胞仪检测。
２６ 数据分析 实验结果以 珋ｘ±ｓ表示；组间比较
采用方差分析（ＡＮＯＶＡ）；统计学显著性设定 Ｐ＜
００５。
３ 结果
３１ 形态鉴定 原代培养时，单个细胞呈梭形。当
细胞生长成片时，呈典型的“峰谷”状排列。
３２ 大鼠胸主动脉平滑肌细胞 α平滑肌肌动蛋白
（αＳＭＡ）免疫组化鉴定结果 采用ＳＡＢＣ法对平滑
肌细胞进行肌动蛋白免疫组化染色，９９％的细胞染色
阳性。倒置显微镜下观察到，第３代大鼠胸主动脉平
滑肌细胞胞浆呈棕黄色，苏木素复染后，细胞核呈淡
蓝色。高倍镜下观察，可见胞浆内的细丝与细胞长轴
相平行，符合肌动蛋白构成的肌丝特征。见图１。
图１ 大鼠胸主动脉平滑肌细胞α平滑肌
肌动蛋白（αＳＭＡ）免疫组化鉴定
３３ 大鼠胸主动脉平滑肌细胞生长曲线的绘制
大鼠胸主动脉平滑肌细胞生长曲线呈典型的倒“Ｓ”
形。平滑肌细胞经过２４ｈ的潜伏期后，进入指数增
长期，持续９６ｈ后进入平台期，因此选择细胞铺板
后９６ｈ之内进行实验。见图２。
３４ 升麻苷与５Ｏ甲基维斯阿米醇苷拮抗 ＴＮＦα
诱导平滑肌细胞增殖的作用 ５μｇ·Ｌ－１ＴＮＦα能
明显刺激平滑肌细胞增殖，与空白组相比差异极显
著（Ｐ＜００１）。升麻苷和５Ｏ甲基维斯阿米醇苷３
个剂量组均能明显抑制ＴＮＦα引起的平滑肌细胞增
殖，与ＴＮＦα组相比差异极显著（Ｐ＜００１）。见表１。
图２ 大鼠胸主动脉平滑肌细胞生长曲线
表１ 升麻苷、５Ｏ甲基维斯阿米醇苷对于ＴＮＦα
所致大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝５）
组别 剂量／ｍｇ·Ｌ－１ Ａ
空白 － ０８７０±００２０２）
模型 － ０９４９±００２７
升麻苷 ５０ ０９３０±００３０
１００ ０８７８±００２３２）
２００ ０８６６±００３１２）
５Ｏ甲基维斯阿米醇苷 ５０ ０９０４±００２０２）
１００ ０９００±００２７２）
２００ ０８８６±００２１２）
注：与模型组相比１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１（表２同）
３５ 升麻苷与５Ｏ甲基维斯阿米醇苷对平滑肌细
胞周期的影响 ５μｇ·Ｌ－１ＴＮＦα能明显增加平滑
肌细胞Ｇ２期与Ｓ期比例，与空白组相比差异极显著
（Ｐ＜００１）。升麻苷和５Ｏ甲基维斯阿米醇苷３个
剂量组均使 Ｇ１／Ｇ０期细胞比例增加，Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期
细胞比例减少，与 ＴＮＦα组相比差异极显著（Ｐ＜
００１）。见表２。
４ 讨论
动脉粥样硬化是一种炎症性疾病而不是单纯的
由于脂质沉积所致。随着对动脉粥样硬化发生机制
的深入研究，炎症在 ＡＳ形成中的作用已被越来越
多的资料所证实，可以认为 ＡＳ是以慢性炎症过程
为基础，炎性细胞因子、血管内皮细胞、血管平滑肌
细胞及免疫因素等环节共同参与的综合发生发展过
程，而 ＴＮＦα是一种重要的前炎性细胞因子，出现
在炎症早期，具有多种生物学活性，如趋化、活化中
性粒细胞和单核细胞；促进血管内皮细胞表达黏附
分子和其他炎症介质，并通过与 ＶＳＭＣ上 ＰＤＧＦ受
体结合，促进 ＶＳＭＣ的分裂、增殖，并趋化中膜
ＶＳＭＣ，使之向内膜迁移，还可使平滑肌细胞表达 Ｅ
ｓｅｌｅｃｔｉｎ增加，增强活化 Ｔ淋巴细胞的反应性，从而
促进ＡＳ斑块形成。
本项研究采用５μｇ·Ｌ－１的 ＴＮＦα诱导血管平
滑肌细胞增殖，同时用不同浓度的升麻苷与５Ｏ甲
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表２ 升麻苷、５Ｏ甲基维斯阿米醇苷对大鼠胸主动脉平滑肌细胞周期的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝５） ％
组别 剂量／ｍｇ·Ｌ－１ Ｇ１／Ｇ０ Ｓ Ｇ２／Ｍ
空白 － ８９２０±０６２４２） ８８０±０８００２） ２０７±０２３１２）
模型 － ６７９０±７２７９ ２１２３±４４１１ １０８７±２９７７
升麻苷 ５０ ８８６７±０７２３２） ８２７±０４０４２） ３０３±０６１１２）
１００ ９０１３±１５９５２） ７１７±０４５１２） ２７３±１９６３２）
２００ ８８９７±０８０２２） ８９７±０４９３２） ２１０±０３４６２）
５Ｏ甲基维斯阿米醇苷 ５０ ８８９７±０３０６２） ８４３±０３０６２） ２５７±００５８２）
１００ ８８９３±０２０８２） ８６７±０１５３２） ２３７±０１５３２）
２００ ８９８３±０６０３２） ７８３±０６８１２） ２３３±０１５３２）
基维斯阿米醇苷进行预处理，观察这两种药物对平
滑肌细胞增殖及细胞周期的影响。结果表明：ＴＮＦ
α能够明显诱导平滑肌细胞进入 Ｓ期与 Ｇ２／Ｍ期，
即促进平滑肌细胞增殖，升麻苷与５Ｏ甲基维斯阿
米醇苷干预后，能够明显增加Ｇ０／Ｇ１期细胞比例，减
少Ｓ期与Ｇ２／Ｍ期细胞，使平滑肌细胞增殖周期停
滞于 Ｇ０／Ｇ１期，从而抑制平滑肌细胞增殖。结果提
示升麻苷与５Ｏ甲基维斯阿米醇苷对 ＡＳ炎性反应
的影响可能与抑制血管平滑肌细胞有关，为升麻苷
与５Ｏ甲基维斯阿米醇苷发展成为抗 ＡＳ的药物，
提供了实验依据。
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ＥｆｅｃｔｏｆｐｒｉｍＯｇｌｕｃｏｓｙｌｃｉｍｉｆｕｇｉｎａｎｄ４′ＯβＤｇｌｕｃｏｓｙｌ５Ｏｍｅｔｈｙｌｖｉｓａ
ｍｍｉｎｏｌｃｏｎｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｂｙＴＮＦα
ＷＡＮＧＬａｎ，ＬＩＡＮＧＲｉｘｉｎ，ＣＡＯＹｉｎｇ，ＹＥＪｉｎｘｉａ
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Ｒｅｓｕｌｔ：ＴＮＦαｏｆ５μｇ·Ｌ－１ｃａｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＳＭＣａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＧ２ｐｈａｓｅａｎｄＳｐｈａｓｅｉｎｃｅｌｃｙｃｌｅ
ｗｈｉｃｈｈａｓｇｒｅａｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜００１）ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌＴｈｅｔｈｒｅｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐｓｏｆｐｒｉｍＯｇｌｕｃｏｓｙｌｃｉｍｉｆｕｇｉｎａｎｄ４′Ｏ
βＤｇｌｕｃｏｓｙｌ５ＯｍｅｔｈｙｌｖｉｓａｍｍｉｎｏｌｃｏｎｃａｎｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＳＭＣａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＧ０／Ｇ１ｐｈａｓｅ，ｗｈｉｃｈｈａｓ
ｇｒｅａｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜００１）ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＰｒｉｍＯｇｌｕｃｏｓｙｌｃｉｍｉｆｕｇｉｎａｎｄ４′ＯβＤｇｌｕｃｏｓｙｌ５
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ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒ ［责任编辑 古云侠］
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第３３卷第１７期
２００８年９月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ １７
Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２００８