全 文 ：小檗碱对肝细胞核因子４α表达及
葡萄糖激酶活性的影响
闫忠卿１，冷三华１，陆付耳１，陆小红２，董 慧１，高志强１
（１华中科技大学 同济医学院 附属同济医院 中西医结合研究所，湖北 武汉 ４３００３０；
２湖北天茂集团制剂厂，湖北 荆门 ４４８０００）
［摘要］ 目的：观察小檗碱对小鼠原代肝细胞核因子４α（ＨＮＦ４α）表达及葡萄糖代谢关键酶葡萄糖激酶（ＧＫ）
活性的影响，探讨小檗碱治疗２型糖尿病的分子机制。方法：采用改良两步灌流法培养小鼠原代肝细胞，用不同浓
度的小檗碱（０，１，３，１０，３０，１００μｍｏｌ·Ｌ－１）和１ｍｍｏｌ·Ｌ－１二甲双胍干预２４ｈ后，采用ＲＴＰＣＲ方法检测 ＨＮＦ４α
ｍＲＮＡ表达；采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法检测ＨＮＦ４α蛋白的表达，同时检测ＧＫ的活性。结果：与阴性对照组相比，小檗
碱在１０，３０，１００μｍｏｌ·Ｌ－１时能够明显促进ＨＮＦ４αｍＲＮＡ及蛋白的表达，二者同时在３０μｍｏｌ·Ｌ－１时达到最大值
（ＨＮＦ４αｍＲＮＡ相对吸光度为０４８±０２０，蛋白相对吸光度为３４７±０８６，Ｐ＜００１）；在１０，３０μｍｏｌ·Ｌ－１时明显
上调ＧＫ活性，同时在３０μｍｏｌ·Ｌ－１时达到最大值（００８０±００７３，Ｐ＜００５）；而二甲双胍对ＨＮＦ４αｍＲＮＡ、蛋白的
表达及对ＧＫ活性的影响则与阴性对照组无明显差异。结论：小檗碱改善糖代谢的作用可能与其调节肝细胞核因
子４α的表达进而调节ＧＫ活性有关。
［关键词］ 小檗碱；肝细胞核因子；葡萄糖激酶；原代肝细胞
［中图分类号］Ｒ２８５５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）１８２１０５０５
［收稿日期］ ２００７１０１８
［基金项目］ 国家自然科学基金项目（３０５００６８５）
［通讯作者］ 陆付耳，Ｔｅｌ／Ｆａｘ：（８６２７）８３６６３２３７，Ｅｍａｉｌ：ｆｅｌｕ
＠ｔｊｈｔｊｍｕｅｄｕｃｎ
人们在研究鉴定调节肝脏基因表达的时候发现
了肝细胞核因子家族成员（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｎｕｃｌｅａｒｆａｃ
ｔｏｒｓ，ＨＮＦｓ），进而发现 ＨＮＦｓ变异可引起３种年轻
的 成 人 发 病 型 糖 尿 病 （ＭＯＤＹ１，ＭＯＤＹ３，
ＭＯＤＹ５）［１］，因而 ＨＮＦｓ在糖代谢中的重要调节作
用及其变异参与糖尿病发病过程的重要性引起了高
度关注。最近的研究显示，肝细胞核因子（主要为
ＨＮＦ４α，ＨＮＦ６，ＨＮＦ１α）相互合作、相互调节，构成肝
细胞、胰岛细胞转录因子调控网络中心，调节肝、胰
岛细胞多个代谢基因的表达。ＨＮＦｓ作为调控糖和
脂肪多层代谢过程的上游信号分子族，特别是
ＨＮＦ４α表达异常，可引起机体糖和脂质代谢紊乱，
导致２型糖尿病［２４］。小檗碱是中药黄连的主要成
分，具有广泛的生物化学和药理作用。近年来有多
项研究表明，小檗碱能够促进肝细胞摄取葡萄糖和
调节脂质代谢［５６］。本实验通过研究小檗碱对小鼠
原代肝细胞ＨＮＦ４α基因表达、蛋白表达以及 ＧＫ活
性的影响，探讨小檗碱改善糖代谢的分子机制。
１ 材料
１１ 药物和试剂 Ⅳ型胶原酶、胰岛素、６磷酸葡
萄糖脱氢酶（Ｇ６ＰＤＨ）、小檗碱（纯度 ＞９８％）均购
自Ｓｉｇｍａ公司；二甲双胍（纯度９９％）由武汉合中化
工制造厂馈赠；地塞米松购自武汉滨湖双鹤药业；促
肝细胞生长因子购自吉林省辉南辉发制药公司；
ＲＰＭＩ１６４０培养基、胎牛血清购自 Ｇｉｂｃｏｌ公司、二甲
基亚砜（ＤＭＳＯ）、四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ），５′三磷
酸腺苷二钠（ＡＴＰＮａ２）均购自 Ａｍｒｅｓｃｏ公司；ＲＴ
ＰＣＲ试剂均为 ＴＯＹＯＢＯ公司产品；抗 ＨＮＦ４α抗体
购自ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司；ＧＡＰＤＨ一抗购自北京博奥森
生物技术有限公司。
１２ 仪器 ＥＬＸ８００全自动酶标测试仪，ＯＬＹＭＰＵＳ
倒置显微镜，高精密度电子分析天平，低温高速离心
机（Ｓｉｇｍａ公司），进口水套式 ＣＯ２培养箱（美国），
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ梯度ＰＣＲ仪（山东高密彩虹分析仪器有
限公司），半自动生化分析仪电泳仪（北京市六一仪
器厂）。
１３ 动物 ６～８周ＳＰＦ级雄性昆明种小鼠体重２０
ｇ左右，购自华中科技大学同济医学院实验动物学
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部，许可证号ＳＣＸＫ（鄂）２００４０００７。
２ 方法
２１ 原代肝细胞分离和培养 按照 Ｓｅｇｌｅｎ法［７］并
略加调整。小鼠腹腔麻醉，乙醇消毒体表，断头放血
后打开腹腔，使其充分暴露肝脏，剥离下腔静脉、门
静脉，从下腔静脉匀速灌流预温至３７℃的无钙灌流
液（ＮａＣｌ８３ｇ·Ｌ－１，ＫＣｌ０５ｇ·Ｌ－１，Ｎａ２ＨＰＯ４·
１２Ｈ２Ｏ０２５１３ｇ·Ｌ
－１，ＥＤＴＡ０１８６ｇ·Ｌ－１，ＨＥＰＥＳ
２４ｇ·Ｌ－１，ｐＨ７４）３０ｍＬ；待其流出液体澄清后，
用止血钳结扎门静脉改作灌流预温至 ３７℃的
００５％ Ⅳ型胶原酶灌流液（Ⅳ型胶原酶 ０５ｇ·
Ｌ－１，ＮａＣｌ３９ｇ·Ｌ－１，ＫＣｌ０５ｇ·Ｌ－１，ＣａＣｌ２０７ｇ
·Ｌ－１，Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ０２５１３ｇ·Ｌ
－１，ＨＥＰＥＳ
２４ｇ·Ｌ－１，ｐＨ７５）２０ｍＬ，待肝脏表面出现龟背
裂纹后停止灌流；取下肝脏用 ＲＰＭＩ１６４０（不含血
清）培养基终止消化，用镊子钝性分离肝细胞，得到
的肝细胞混悬液用２００目尼龙网滤去不能消化的肝
包膜和纤维组织，５００ｒ·ｍｉｎ－１离心３次，得到纯度
大于９０％、活力大于９０％的肝细胞。肝细胞培养液
（ＲＰＭＩ１６４０培养基，胎牛血清１０％，促肝细胞生长
因子００２ｇ·Ｌ－１，地塞米松０００５ｇ·Ｌ－１，胰岛素
０００５ｇ·Ｌ－１，ｐＨ７４）培养３ｄ后用于实验。
２２ ＭＴＴ实验 将原代肝细胞接种在９６孔板中，
加入不同浓度的小檗碱（０，１，３，１０，３０，１００μｍｏｌ·
Ｌ－１），１ｍｍｏｌ·Ｌ－１二甲双胍干预，各组 ＤＭＳＯ含量
均为０２％，且均是无血清培养，每组各５个复孔。
培养２４ｈ后，加入０５％的 ＭＴＴ溶液１０μＬ。继续
培养４ｈ，弃去培养液，加入１００μＬ的 ＤＭＳＯ，充分
振荡混匀后，置于酶标仪上检测 ４９０ｎｍ吸光度
（Ａ）。
２３ ＲＴＰＣＲ检测原代肝细胞 ＨＮＦ４αｍＲＮＡ表达
药物干预细胞２４ｈ后提取ＲＮＡ，提取按照说明书
操作。用核酸分析仪检测 ＲＮＡ的浓度和纯度，取
Ａ２６０／Ａ２８０在１８～２０的 ＲＮＡ进行实验。引物自行
设计由上海生工生物工程公司合成，ＨＮＦ４α上游
５′ＧＧＴＧＣＣＡＡＣＣＴＣＡＡＣＴＣＡ３′，下 游 ５′ＡＧＧＣＴ
ＧＣＴＧＴＣＣＴＣＧＴＡＧ３′，βａｃｔｉｎ上游 ５′ＴＧＣＣＣＡＴＣ
ＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＡＣ３′，下游 ５′ＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＴ
ＧＡＧＧＣ３′。取２μｇ的ＲＮＡ逆转录合成ｃＤＮＡ单链
进行 ＰＣＲ扩增，扩增条件：９４℃预变性 ５ｍｉｎ；
ＨＮＦ４α：９４℃ 变性５０ｓ，退火５８８℃ ５０ｓ，７２℃
延伸５０ｓ；βａｃｔｉｎ：９４℃ 变性５０ｓ，退火５４℃５０ｓ，
７２℃ 延伸５０ｓ；扩增的循环数分别为３２，３４个循
环；最后７２℃ １０ｍｉｎ。扩增产物经１６％琼脂糖凝
胶电泳，于凝胶成像分析仪上进行吸光度扫描。进
行电泳条带分析，以目的条带比 βａｃｔｉｎ的相对 Ａ表
示结果。
２４ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法检测 ＨＮＦ４α蛋白表达 每
组肝细胞２×１０６个加入３００μＬ的三去污裂解液，充
分裂解３０ｍｉｎ，１２０００×ｇ离心５ｍｉｎ后取上清，考
马斯亮蓝测其蛋白浓度。取各组样本总蛋白 ５０
μｇ，变性 ５ｍｉｎ，以 １２％分离胶，５％积层胶，ＳＤＳ
ＰＡＧＥ胶分离蛋白，湿电转移法将蛋白转移到 ＰＶＤＦ
膜上。ＰＶＤＦ膜用含５％脱脂牛奶的ＴＢＳＴ封闭２ｈ。
抗ＨＮＦ４α一抗以１∶５００稀释，４℃孵育过夜，然后
ＴＢＳＴ洗膜 ４次，每次 １５ｍｉｎ，再用抗山羊二抗
１∶３３００稀释，放室温在摇床上孵育２ｈ，再用 ＴＢＳＴ
洗膜４次，每次１５ｍｉｎ。在暗室中用ＥＣＬ化学发光
试剂盒进行曝光，洗片后用激光扫描仪测各条带Ａ，
以目的条带比ＧＡＰＤＨ的相对Ａ表示结果。
２５ 酶活性测定 ＧＫ活性用酶法分析的方法检
测［８］。原代肝细胞接种在６孔板中，待加入不同浓
度的药物培养２４ｈ后，弃去培养液，ＤＨａｎｋｓ漂洗３
遍后，用 ＰＢＳ清洗细胞单层３次，用含 Ｋ２ＨＰＯ４（２０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１），ＥＤＴＡ（１ｍｍｏｌ·Ｌ－１）、ＭｇＣｌ２（１１０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１）以及ＤＴＴ（５ｍｍｏｌ·Ｌ－１）的预冷缓冲液
收集细胞并超声破碎处理，将处理后液体在４℃以
１２０００×ｇ离心１５ｍｉｎ，收集上清。酶活性检测反应
液包括高糖（１００ｍｍｏｌ·Ｌ－１）和低糖（０５ｍｍｏｌ·
Ｌ－１）２组，其组成为：ＨＥＰＥＳ（５０ｍｍｏｌ· Ｌ－１，ｐＨ
７４），ＫＣｌ（１００ｍｍｏｌ·Ｌ－１），ＭｇＣｌ２（７４ｍｍｏｌ·
Ｌ－１），ＮＡＤ（０５ｍｍｏｌ·Ｌ－１），００５％ ＢＳＡ，Ｇ６ＰＤＨ
（３ｍｇ·Ｌ－１），ＡＴＰ（５ｍｍｏｌ·Ｌ－１），βｍｅｒｃａｔｏｅｔｈａｎｏｌ
（１５ｍｍｏｌ·Ｌ－１）及上述不同浓度葡萄糖。将含 ＧＫ
的上清１０μＬ加到２００μＬ反应液中，并于３０℃温
育１ｈ，加入２ｍＬＮａＨＣＯ３（５００ｍｍｏｌ·Ｌ
－１，ｐＨ９４）
来终止反应。在３４７ｎｍ发射光、４４８ｎｍ激发光下
测定Ａ。每个测量中，以无 ＡＴＰ的０５，１００ｍｍｏｌ·
Ｌ－１葡萄糖时的值作为空白管。ＧＫ活性用 １００
ｍｍｏｌ·Ｌ－１葡萄糖浓度时的活性减去 ０５ｍｍｏｌ·
Ｌ－１葡萄糖浓度时的活性。蛋白浓度用考马斯亮蓝
试剂盒测定。用以下公式计算ＧＫ活性。
ＧＫ活性＝（高糖Ａ－低糖Ａ）／（蛋白质量×时间）
２６ 统计方法 所有试验数据均以 珋ｘ±ｓ表示，采
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用ＳＰＳＳ１３０软件，用单因素方差分析进行统计。
３ 结果
３１ 分离得到的肝细胞 小鼠肝细胞大多为圆形
或类圆形，少数为不规则形状，胞浆丰富，其中可见
大量颗粒状内容物，ＨＥ染色可见较多单核、双核细
胞及少数三核细胞（图１，２）。
图１ 分离纯化的原代肝细胞（×１００）
图２ 原代肝细胞（ＨＥ，×１００）
３２ 对原代肝细胞活力的影响 ＭＴＴ结果显示，
随着小檗碱浓度的增加，存活率逐渐有所下降，表明
其对原代肝细胞的抑制作用增强。见表１。
表１ 不同浓度小檗碱干预原代肝细胞２４ｈ后
存活率比较（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
小檗碱／μｍｏｌ·Ｌ－１ Ａ４９０ 存活率／％
０ １９８４±０１１４ １００００
１ ２０２３±０１５０ １０２０２
３ １６７１±０３３４１） ８４３９
１０ １６２８±０２７０１） ８２２４
３０ １５３０±０２４８２） ７７３７
１００ １５０５±０１１５２） ７６０１
注：与阴性组比较１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１（表２，３同）
３３ 对原代肝细胞ＨＮＦ４αｍＲＮＡ及蛋白表达的影
响 与阴性组（０μｍｏｌ·Ｌ－１）相比ＢＦＱ，当小檗碱浓
度为１，３μｍｏｌ·Ｌ－１时ＨＮＦ４αｍＲＮＡ及蛋白表达无
明显差异；当小檗碱浓度为１０，３０，１００μｍｏｌ·Ｌ－１时，
各组ＨＮＦ４αｍＲＮＡ及蛋白表达明显增加，两者都是
在３０μｍｏｌ·Ｌ－１时表达最多（Ｐ＜００１）。见表２。
表２ 不同浓度小檗碱对原代肝细胞ＨＮＦ４αｍＲＮＡ
及蛋白表达水平的影响（Ａ，珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
干预组
浓度
／μｍｏｌ·Ｌ－１
ＨＮＦ４αｍＲＮＡ ＨＮＦ４α蛋白
小檗碱 ０ ０２１±００４ １５１±０３４
１ ０２２±００８ １５３±０２１
３ ０３１±００９ ２０５±０３９
１０ ０３３±０１２１） ２５５±４６７２）
３０ ０４８±０２０２） ３４７±０８６２）
１００ ０３３±０１１１） ２３８±０５１２）
二甲双胍 １０００ ０２４±００６ １６０±０５０
３４ 小檗碱对ＧＫ活性的影响 与０μｍｏｌ·Ｌ－１组
相比，小檗碱能够在一定程度上上调 ＧＫ活性的表
达，但只有当其达到１０，３０μｍｏｌ·Ｌ－１时其活性才
明显增强（Ｐ＜００５）。见表３。
表３ 不同浓度小檗碱和二甲双胍对ＧＫ活性的影响
组别 浓度／μｍｏｌ·Ｌ－１ ＧＫ活性／Ｕ·ｍｉｎ－１·ｍｇ－１
小檗碱 ０ ０００９±０００７
１ ００２８±００１７
３ ００４８±００５１
１０ ００６９±００８２１）
３０ ００８０±００７３１）
１００ ００１３±０００６
二甲双胍 １０００ ０００９±０００５
４ 讨论
肝细胞核因子家族（ＨＮＦｓ）主要在肝脏中表达，
在胰岛、肾脏和生殖器中也有表达，ＨＮＦｓ构成转录
因子网络控制胚胎发育过程中和成人组织中的基因
表达，而ＨＮＦ４α是家族中与糖脂代谢密切相关的重
要成员，可以调节多个葡萄糖及脂类代谢基因的表
达。ＧＫ是一种已糖激酶，是葡萄糖代谢的关键酶
之一，其特异性存在于成熟肝细胞和胰岛细胞中。
ＧＫ活性增强，促进肝脏葡萄糖磷酸化，使肝糖原合
成能力增加，抑制肝糖原异生，从而维持血糖稳定。
小檗碱是黄连的有效成分，中医用黄连治疗消
渴病近２０００年，用小檗碱治疗糖尿病２０多年，已
经证实小檗碱可以促进肝细胞摄取葡萄糖调节脂质
代谢［５６］。那么小檗碱是通过什么环节起到治疗糖
尿病的作用目前尚不清楚。本研究从小檗碱与肝细
胞核因子的关系方面进一步探讨小檗碱治疗糖尿病
的机制，以揭示小檗碱抗糖尿病的重要作用环节。
本实验观察到，不同浓度的小檗碱作用于原代
肝细胞，引起 ＨＮＦ４αｍＲＮＡ及 ＨＮＦ４α蛋白表达发
生变化，其总体趋势一致，即在一定浓度范围内随着
小檗碱浓度的增大ＨＮＦ４αｍＲＮＡ及蛋白表达增加，
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在３０μｍｏｌ·Ｌ－１时达到最大（Ｐ＜００１），当小檗碱
浓度较高时本实验中达到１００μｍｏｌ·Ｌ－１，ＨＮＦ４α
ｍＲＮＡ及蛋白的表达反而下降，可能与其抑制原代
肝细胞的生长有关，这可以提示ＨＮＦ４α的表达与小
檗碱呈一定的剂量依赖关系。而 ＨＮＦ４α是肝细胞
内转录因子网络调控中心的关键因子，它通过直接
或间接作用于下游的葡萄糖代谢酶，从而调节肝脏
葡萄糖的代谢，还有人认为ＨＮＦ４α可控制 ＧＫ基因
的表达［９］。本实验中，ＧＫ的活性与 ＨＮＦ４α的表达
趋势一致，并同时在３０μｍｏｌ·Ｌ－１时达到最高。即
ＨＮＦ４α表达最多时 ＧＫ的活性最高。两者合二为
一小檗碱可能先作用于 ＨＮＦ４α，通过 ＨＮＦ４α的变
化来调节其下游的肝细胞代谢关键酶 ＧＫ的活性，
从而达到调节糖代谢的作用。但是由于 ＨＮＦｓ之间
调控网络相互作用机制十分复杂，现在还不能确定
ＨＮＦ４α表达与ＧＫ之间是否存在直接因果关系，这
些机制有待进一步研究。另外本实验可以证实二甲
双胍治疗糖尿病的机制与 ＨＮＦ４α表达及 ＧＫ活性
无明显关系。本实验的不足之处在于尚未检测小檗
碱对下游效应基因ＬＤＨ活性的影响。
综上所述，小檗碱能够调节 ＨＮＦ４αｍＲＮＡ及
蛋白表达，进而调节肝脏葡萄糖激酶的活性，从而
发挥其治疗糖尿病的作用，因此 ＨＮＦ４α可能为小
檗碱治疗糖尿病的作用环节之一。但是小檗碱如何
调控ＨＮＦ４α的表达、ＨＮＦ４α如何调控糖脂代谢相
关激酶的表达以及它们之间的相互作用关系有待进
一步探讨。
［参考文献］
［１］ ＦａｊａｎｓＳＳ，ＢｅｌＧＩ，ＰｏｌｏｎｓｋｙＳＫＭｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｓｈａｎｉｓｍｓａｎｄ
ｃｌｉｎｉｃａｌｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙｏｆｍａｔｕｒｉｔｙｏｎｓｅｔｄｉａｂｅｔｅｓｏｆｔｈｅｙｏｕｎｇ［Ｊ］
ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ，２００１，３４５（１３）：９７１
［２］ ＫｕｌｋａｒｎｉＲＮ，ＫａｈｎＣＲＨＮＦｓｌｉｎｋｉｎｇｔｈｅｌｉｖｅｒａｎｄｐａｎｃｒｅａｔｉｃ
ｉｓｌｅｔｓｉｎｄｉａｂｅｔｅｓ［Ｊ］Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０３（５６６２）：１３１１
［３］ ＯｄｏｍＤＴ，ＺｉｚｌｓｐｅｒｇｅｒＮ，ＧｏｒｄｏｎＤＢ，ｅｔａｌＣｏｎｔｒｏｌｏｆｐａｎｃｒｅ
ａｔｉｃａｎｄｌｉｖｅｒｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙＨＮＦｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０３（５６６２）：１３７８
［４］ ＤｕｎｃａｎＳＡ，ＮａｖａｓＭＡ，ＤｕｆｏｒｔＤ，ｅｔａｌＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｔｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｎｅｔｗｏｒｋｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ
［Ｊ］Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８１（５３７７）：６９２
［５］ ＹｉｎＪｕｎ，ＨｕＲｅｎｍｉｎｇ，ＣｈｅｎＭｉｎｇｄａｏ，ｅｔａｌＥｆｅｃｔｓｏｆｂｅｒｂｅｒｉｎｅ
ｏｎｇｌｕｃｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｖｉｔｒｏ［Ｊ］Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２００２，５１（１１）：
１４３９
［６］ ＫｏｎｇＷ，ＷｅｉＪ，ＡｂｉｄｉＰ，ｅｔａｌＢｅｒｂｅｒｉｎｅｉｓａｎｏｖｅｌｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ
ｌｏｗｅｒｉｎｇｄｒｕｇｗｏｒｋｉｎｇｔｈｒｏｕｇｈａｕｎｉｑｕｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｄｉｓｔｉｎｃｔｆｒｏｍ
ｓｔａｔｉｎｓ［Ｊ］ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，２００４，１０（１２）：１３４４
［７］ ＳｅｇｌｅｎＰＯＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｉｓｏｌａｔｅｄｒａｔｌｉｖｅｒｃｅｌｓ［Ｊ］Ｍｅｔｈｏｄｓ
ＣｅｌＢｉｏ，１９７６，１３：２９
［８］ ＡａｌｉｎｋｅｅｌＲ，ＳｒｉｎｉｖａｓａｎＭ，ＫａｌｈａｎＳＣＡｄｉｅｔａｒｙｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ
（ｈｉｇｈｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）ｄｕｒｉｎｇｔｈｅｎｅｏｎａｔａｌｐｅｒｉｏｄｃａｕｓｅｓｉｓｌｅｔｄｙｓ
ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｒａｔｓ［Ｊ］ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ，１９９９，２７７
（６）：１０６１
［９］ ＨａｔｚｉｓＰ，ＫｙｒｍｉｚｉＩ，ＴａｌｉａｎｉｄｉｓＩ，ｅｔａｌＭｉｔｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ
ｋｉｎａｓｅｍｅｄｉａｔｅｄｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｏｆｅｎｈａｎｃｅｒｐｒｏｍｏｔｅｒｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ
ｉｎｈｉｂｉｔｓｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ４αｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］ＭｏｌＣｅｌＢｉ
ｏｌ，２００６，２６（１９）：７０１７
Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｂｅｒｂｅｒｉｎｅｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ４αａｎｄ
ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｍｏｕｓｅｐｒｉｍａｒｙｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ
ＹＡＮＺｈｏｎｇｑｉｎｇ１，ＬＥＮＧＳａｎｈｕａ１，ＬＵＦｕｅｒ１，ＬＵＸｉａｏｈｏｎｇ２，ＤＯＮＧＨｕｉ１，ＧＡＯＺｈｉｑｉａｎｇ１
（１ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌ＆ＷｅｓｔｅｒｎＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＴｏｎｇｊｉＨｏｓｐｉｔａｌ，ＴｏｎｇｊｉＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｅｇｅ，
ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００３０，Ｃｈｉｎａ；
２ＨｕｂｅｉＢｉｏｃａｕｓｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ，Ｌｔｄ，Ｊｉｎｇｍｅｎ４４８０００，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ４α（ＨＮＦ４α）ａｎｄｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｋｅｙｅｎｚｙｍｅｇｌｕ
ｃｏｋｉｎａｓｅ（ＧＫ）ｉｎｇｌｕｃｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ａｎｄｆｕｒｔｈｅｒｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｂｅｒｂｅｒｉｎｅｉｎｔｒｅａｔｉｎｇｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓ
Ｍｅｔｈｏｄ：ＭｏｕｓｅｐｒｉｍａｒｙｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｂｙａｎｉｍｐｒｏｖｅｄｓｉｎｇｌｅｔｗｏｓｔｅｐｐｅｒｆｕｓｉｏｎｍｅｔｈｏｄＴｈｅｍｕｒｉｎｅｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｃｕｌ
ｔｕｒｅｄａｎｄｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈｂｅｒｂｅｒｉｎｅ（０，１，３，１０，３０，１００μｍｏｌ·Ｌ－１）ａｎｄ１ｍｍｏｌ·Ｌ－１ｍｅｔｆｏｒｍｉｎｆｏｒ２４ｈｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＴｈｅｍＲ
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第３３卷第１８期
２００８年９月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ １８
Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２００８
ｔｈｅｔｏｐａｔｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ３０μｍｏｌ·Ｌ－１（Ｐ＜００１）Ｂｕｔｔｈｅｍｅｔｆｏｒｍｉｎｍａｄｅｎｏｄｉｆｅｒｅｎｃｅｗｉｔｈｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｏｎｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＮＦ４αａｎｄｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＧＫＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｉｔｉｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｂｅｒｂｅｒｉｎｅｏｎｉｍｐｒｏｖｉｎｇｇｌｕｃｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ
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［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ；ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ；ｐｒｉｍａｒｙｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ；ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ
［责任编辑 古云侠］
［收稿日期］ ２００７１１２０
［基金项目］ 国家自然科学基金（３０７４００５３）；北京市自然科
学基金 （７０６２０３１，７０５０００１，７０３２０１３）；北京 市科技计划项目
（Ｄ０２０６００１０４３１９１）；国家“９７３”计划项目（２００３ＣＢ５１７１０４）；首都医
科大学基础临床课题（２００４ＪＬ０２，２００６ＪＬ０９）；神经病性疾病学教育部
重点实验室２００７年课题（２００７０４）
［通讯作者］ 王文，Ｔｅｌ：（０１０）８３１９８８８１，Ｅｍａｉｌ：ｌｚｗｗａｎｇ＠ｙａ
ｈｏｏｃｏｍｃｎ
莫诺苷抑制 Ｈ２Ｏ２诱导的神经细胞凋亡
艾厚喜１，王 文１，孙芳玲２，黄文婷２，安 宜２，李 林１
（１首都医科大学 宣武医院 药物研究室 神经变性病学教育部重点实验室，北京 １０００５３；
２北京理工大学 生命科学与技术学院 生物技术系，北京 １０００８１）
［摘要］ 目的：研究莫诺苷对氧化应急诱导的神经细胞凋亡的影响。方法：培养的人神经母细胞瘤（ＳＨ
ＳＹ５Ｙ）神经细胞加入莫诺苷（１，１０，１００μｍｏｌ·Ｌ－１）预孵育２４ｈ，加入Ｈ２Ｏ２（５００μｍｏｌ·Ｌ
－１）作用１８ｈ诱导产生氧
化损伤，测定对细胞内超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性的影响；用 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法检测 ｃａｓｐａｓｅ３，ｃａｓｐａｓｅ９，Ｂｃｌ２和
Ｂａｘ的表达。结果：莫诺苷（１０，１００μｍｏｌ·Ｌ－１）抑制氧化损伤，与模型组相比，ＳＯＤ活性分别增加了１４％（Ｐ＜
００１）和１１％（Ｐ＜００５）；莫诺苷（１，１０，１００μｍｏｌ·Ｌ－１）与模型组相比，ｃａｓｐａｓｅ３的含量分别减少了３１％（Ｐ＜
００１），１０３％（Ｐ＜０００１）和９５％（Ｐ＜０００１），ｃａｓｐａｓｅ９的含量分别减少了７１％（Ｐ＜０００１），１３２％（Ｐ＜０００１）和
３７％（Ｐ＜００５），Ｂｃｌ２分别增加了８８％（Ｐ＜００１），１２１％（Ｐ＜０００１）和６０％（Ｐ＜００１），对Ｂａｘ没有影响。结论：
莫诺苷可通过抗氧化作用抑制Ｈ２Ｏ２诱导的神经细胞凋亡，具有神经保护作用。
［关键词］ 莫诺苷；ＳＨＳＹ５Ｙ细胞系；氧化应激；细胞凋亡
［中图分类号］Ｒ２８５５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）１８２１０９０４
脑血管疾病是当前威胁人类健康的三大主要疾
病之一，缺血性脑血管病占脑血管病的８０％以上。
在脑缺血早期，自由基损伤、兴奋性神经毒性和反复
细胞膜去极化导致能量衰竭引起级联式瀑布反应，
破坏了“神经血管单元”（ｎｅｕｒｏｖａｓｃｕｌａｒｕｎｉｔ）稳态，
导致神经元细胞凋亡以及微血管、血脑屏障破
坏［１］。脑保护药具有抑制自由基损伤，降低兴奋性
神经毒性，减小脑缺血／再灌注损伤，保护或者修复
神经功能的作用，目前临床应用的脑保护药有动物
实验有效而临床应用无效的问题，从中药、天然药物
中筛选先导化合物，发现具有脑保护作用的新药就
显得非常重要［２］。笔者对３３味中药进行了神经保
护作用筛选，发现山茱萸环烯醚萜苷对 Ｄ半乳糖致
脑老化痴呆小鼠模型及光化学诱导的脑梗死大鼠模
型均具有改善作用，并能提高隔海马穹隆伞切断拟
Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病（ＡＤ）模型大鼠的学习记忆功能，明显
减少模型鼠内侧隔核区和海马齿状回多形层神经元
的丧失［３４］。对山茱萸环烯醚萜苷进一步分离，得
到莫诺苷，已经研究了莫诺苷对正常神经细胞以及
氧化损伤诱导的神经细胞凋亡的影响［５６］，通过本实
验观察中药有效成分莫诺苷对 Ｈ２Ｏ２诱导的 ＳＨ
ＳＹ５Ｙ细胞超氧化物歧化酶（ＳＯＤ），ｃａｓｐａｓｅ３，
ｃａｓｐａｓｅ９，Ｂｃｌ２，Ｂａｘ的影响，确定它抑制神经细胞
凋亡的作用及机制，为进一步研究莫诺苷脑保护作
用提供依据。
１ 材料
１１ 药物与试剂 莫诺苷由本室从山茱萸中提取
制备，用 ＨＰＬＣ分析，纯度９８５％；分别用００１ｍｏｌ
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第３３卷第１８期
２００８年９月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ １８
Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２００８