全 文 ：水蛭中水蛭素含量测定的改进
范尚坦，李金兰，张 勇，赖丽萍
（南京军区 福州总医院，福建 福州 ３５００２５）
［收稿日期］ ２００８０２２６
［通讯作者］ 范尚坦，Ｔｅｌ：（０５９１）２２８５９４６６，１３８６０６１９５３７，Ｅ
ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｙｏｎｇｌｉｘｉａｎｇｌ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
水蛭素活性测定方法目前主要有以 ｃｈｒｏｍｏｎｙｍ
ＴＨ为生色底物的比色法、光散射法和凝血酶滴定
法。２００５年版《中国药典》收载了用凝血酶滴定法
测定水蛭药材中的水蛭素［１］，其原理是水蛭素可与
凝血酶以１∶１比例结合，而凝血酶已有标准的国际
单位ＮＩＨ，因此可以用抗凝血酶活力单位ＡＴＵ来表
示水蛭素的活性，即１个ＡＴＵ等于中和１个ＮＩＨ凝
血酶的水蛭素量。在对宽体金线蛭和柳叶蚂蟥中水
蛭素含量进行测定时发现药典方法存在一定缺陷。
现将用药典法测定水蛭素时碰到的问题及对药典法
进行改进的结果报道如下。
１ 仪器与试药
（人）纤维蛋白原（上海莱氏 ０６０１０５）；三羟甲
基甲烷（中国医药上海化学试剂公司 ０５０９１４）；凝血
酶（黑龙江迪龙０６０１１３）；水蛭（宽体金线蛭）（产地
湖北）、柳叶蚂蟥均购于省药材公司（产地河南），南
京军区福州总医院主任药师范尚坦鉴定。
ＴＧＨ－１６Ｃ离心机（上海安亭科学仪器厂）；电
热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）；ＤＦＹ－５００型
５０克摇摆式高速中药粉碎机（浙江温岭市大海药材
器械厂）；ＰＨＳ－３Ｃ型精密ｐＨ计 （上海精密科学仪
器有限公司）；超声波清洗仪（上海跃进医用光学器
械厂）。
２ 方法与结果
２．１ 药典法测定含量
２．１．１ 提取液的制备 精密称取宽体金线蛭和柳
叶蚂蟥粉末各约１ｇ，精密加入０．９％氯化钠溶液５
ｍＬ，充分搅拌，浸提３０ｍｉｎ，并时时振摇，５０００ｒ·
ｍｉｎ－１离心１５ｍｉｎ，分离上清液备用。
２．１．２ 缓冲液的配制 取０２ｍｏｌ·Ｌ－１三羟甲基
氨基甲烷溶液２５ｍＬ与０１ｍｏｌ·Ｌ－１盐酸溶液４０
ｍＬ，加水至１００ｍＬ，用ｐＨ计调节其ｐＨ至７４，加入
０５ｇ（人）纤维蛋白原溶解，即得含０５％（人）纤维
蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液。
２．１．３ 凝血酶滴定液的配制 将１００ＮＩＨ·ｍＬ－１
的凝血酶加入２５ｍＬ的０９％氯化钠溶液，配成浓
度为４０ＮＩＨ·ｍＬ－１的凝血酶滴定液。
２．１．４ 水蛭素的含量测定 精密量取提取液各
１００μＬ，置试管（１０ｍｍ×１００ｍｍ）中，加入含０．５％
（人）纤维蛋白原２００μＬ，摇匀，置水浴（３７±０５）
℃中缓缓滴加凝血酶溶液（每 ５μＬ·ｍｉｎ－１，边滴加
边轻轻摇匀）至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积。
按下式计算含量。
Ｕ＝Ｃ１Ｖ１／（Ｃ２Ｖ２Ｗ）
Ｕ为每１ｇ含凝血酶活性单位（Ｕ·ｇ－１）；Ｃ１为凝
血酶溶液的浓度（Ｕ·ｍＬ－１）；Ｃ２为供试品溶液的质量
浓度（ｇ·ｍＬ－１）；Ｖ１为消耗凝血酶溶液的体积（μＬ）；
Ｖ２为供试品溶液的加入量（μＬ）；Ｗ为取样量。
结果表明按照药典方法测定，水蛭提取液滴加
纤维蛋白原溶液后，即出现纤维蛋白原絮状沉淀，以
致滴加凝血酶后，本应出现溶液凝固的现象不再出
现。显然，水蛭提取液中一定有某些物质或某种因
素促使纤维蛋白原变性析出。经过反复探索，发现
导致纤维蛋白原变性析出的原因是水蛭提取液的酸
性太强（宽体金线蛭和柳叶蚂蟥的提取液ｐＨ均在３
左右）。为此，作者对药典法测定水蛭素的方法做
了一些改进。
２．２ 含量测定方法改进
２．２．１ 提取液 ｐＨ对含量测定结果的影响 取宽
体金线水蛭和柳叶蚂蟥（０７０１０８）提取液各１１份，
每份１ｍＬ，用 １０ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＯＨ分别调节其 ｐＨ
至１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，
１１０，按药典方法进行测定（表１）。
结果表明宽体金线蛭和柳叶蚂蟥的提取液在
ｐＨ至４～７时凝血酶滴定法测定为阳性结果。在
ｐＨ５０时，抗凝活性均较高。当ｐＨ３０以下，由于
酸性太强，纤维蛋白原均析出沉淀，再滴加凝血酶，
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第３３卷第１９期
２００８年１０月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ １９
Ｏｃｔｏｂｅｒ，２００８
表１ 药典方法（不同ｐＨ）测定２种水蛭含量
品种 ｐＨ
提取液＋纤维
蛋白原现象
凝血酶用量
／μＬ
抗凝活性
／Ｕ
宽体金线蛭 １０ 浑浊，絮状物 － －
２０ 浑浊，絮状物 － －
３０ 浑浊，絮状物 － －
４０ 澄清 ５ １０
５０ 澄清 ２５ ５０
６０ 澄清 １０ ２０
７０ 澄清 ８ １６
８０ 微浑 １ ０
９０ 成乳状 ０ ０
１００ 成乳状 ０ ０
１１０ 成乳状 ０ ０
柳叶蚂蟥 １０ 浑浊，絮状物 － －
２０ 浑浊，絮状物 － －
３０ 浑浊，絮状物 － －
４０ 澄清 ８ １６
５０ 澄清 ２０ ４０
６０ 澄清 １２ ２４
７０ 澄清 ５ １０
８０ 微浑 １ ０
９０ 成乳状 ０ ０
１００ 成乳状 ０ ０
１１０ 成乳状 ０ ０
注：表中“－”表示无限量
始终无法凝固。ｐＨ８０以上时，水蛭素活性消失，一
加凝血酶，提取液立即凝固成胶冻状，不显抗凝活
性。
２．２．２ 提取液最佳ｐＨ确定 调节提取液ｐＨ４０，
４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，按药
典方法测定水蛭素含量（表２）。
结果表明宽体金线蛭和柳叶蚂蟥的抗凝活性，
在ｐＨ５０时均达最高值；ｐＨ高于或低于５０均呈
逐渐下降趋势。故ｐＨ５０为二者的最佳ｐＨ。
２．２．３ 含量测定改进方法的验证 将二者提取液
ｐＨ均调到 ５０，按药典方法测定水蛭素含量（表
３）。
结果表明通过 ｐＨ调节后，可准确测定出宽体
金线蛭和柳叶蚂蟥中水蛭素的含量。改进方法有效
可行。
３ 讨论
凝血酶滴定法测定水蛭中的水蛭素首次以药典
方式收载于２００５年版药典。结果表明：用凝血酶滴
定法测定水蛭中的水蛭素，提取液的 ｐＨ对测定结
果产生非常大的影响，当 ｐＨ３０以下，由于酸性太
强，纤维蛋白原析出沉淀，再滴加凝血酶始终无法凝
表２ 提取液最佳ｐＨ考察
品种 ｐＨ 凝血酶用量／μＬ 抗凝活性／Ｕ
宽体金线蛭 ４０ ８ １６
４２ １０ ２０
４４ １２ ２０
４６ １５ ３０
４８ １８ ３６
５０ ２０ ４０
５２ １７ ３４
５４ １２ ２４
５６ １０ ５０
５８ ８ １６
６０ ５ １０
柳叶蚂蟥 ４０ ５ １０
４２ ６ １２
４４ ８ １６
４６ １０ ２０
４８ ２０ ４０
５０ ２５ ５０
５２ ２４ ４８
５４ １８ ３６
５６ １５ ３０
５８ １２ ２４
６０ １０ ２０
注：表中“－”表示无限量；提取液＋纤维蛋白原现象均为澄清
表３ 改进方法验证结果
品种 Ｎｏ 编号 凝血酶用量／μＬ 水蛭素／Ｕ
１ ２５ ５０
０７０１０８ ２ ２６ ５２
３ ２５ ５０
１ ２６ ５２
宽体金线蛭 ０７０１２５ ２ ２６ ５２
３ ２５ ５０
１ ２５ ５０
０７０２１０ ２ ２４ ４８
３ ２５ ５０
１ ２０ ４０
０７０１０８ ２ ２１ ４２
３ ２０ ４０
１ ２０ ４０
柳叶蚂蟥 ０７０１２５ ２ ２０ ４０
３ １９ ３８
１ ２０ ４０
０７０２１０ ２ ２０ ４０
３ ２１ ４２
注：提取液＋纤维蛋白原现象均为澄清
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第３３卷第１９期
２００８年１０月
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Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ １９
Ｏｃｔｏｂｅｒ，２００８
固；ｐＨ８０以上时，水蛭素活性消失，加凝血酶，提
取液立即凝固成胶冻状，不显抗凝活性；当 ｐＨ５０
时，抗凝活性最高测定结果最为准确。ｐＨ高于或低
于５０时，其抗凝活性均呈逐渐下降趋势。而药典
法水蛭的提取液ｐＨ在３左右，由于酸性太强，导致
纤维蛋白原析出，测定无法进行。
有文献报道，在０１ｍｏｌ·Ｌ－１ＨＣｌ或０１ｍｏｌ·
Ｌ－１ＮａＯＨ中水蛭素可稳定１５ｍｉｎ［２］。实验结果证
明，当溶液的ｐＨ８０以上时，水蛭即失去抗凝活性；
当ｐＨ低于４０时，可导致纤维蛋白原变性，用凝血
酶滴定法无法证明其有抗凝活性，也无法进行水蛭
素含量测定。
实验过程中采用凝血酶滴定法测定水蛭素含量
时，有三点需特别注意：①其测定结果易受到环境温
度和凝血酶活力的影响。在操作过程中，温度应控
制在２５～３７℃，因为２０℃以下测定结果会偏高，而
在３７℃以上，凝血酶会变性或部分丧失活力，从而
得不到结果。所以必须在恒温水浴锅中反应。②纤
维蛋白溶液的浓度对含量测定有影响，本实验含量
测定所用纤维蛋白原浓度为０５％，当浓度偏高时，
则测定结果含量偏低，当浓度偏低时，则可能导致含
量过高或者始终无法凝固。③测定时用的纤维蛋白
原缓冲溶液及凝血酶均应现配现用，因为纤维蛋白
原及凝血酶配成溶液后，容易变性从而影响药效。
在配制纤维蛋白原时应先使温度升高到３０～３７℃，
然后进行溶解。温度过低往往会造成溶解困难并导
致蛋白变性。
［参考文献］
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［２］ ＨｏｆｍａｎＡ，ＨｏｆｍａｎｎＡ，ＭａｒｋｎａｒｄｔＦＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｈｒｏｍｂｉｎ
ｐｌａｔｅｌｅｔｒｅａｃｔｉｏｎｂｙｈｉｒｕｄｉｎ［Ｊ］Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，１９８４，１４（２）：１６４．
［责任编辑 鲍 雷］
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［１８］ 洪 遵．洪氏集验方［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社，
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ＳｔｕｄｙｏｎｍｅａｓｕｒｉｎｇｕｎｉｔｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎＳｏｎｇｄｙｎａｓｔｉｅｓ
ＺＨＡＮＧＲｕｉｘｉａｎ１，ＬＵＱｉｎ２，ＺＨＡＮＧＷｅｉ１，ＺＨＡＮＧＭｕｑｕｎ１
（１．ＣｈｉｎａＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａｌＭｅｄｉｃａ，ＣｈｉｎａＡｃａｄｅｍｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００７００，Ｃｈｉｎａ；
２．ＪｉａｎｇｘｉｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｃｈａｎｇ３３０００６，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＴｈｅｏｒｉｇｉｎａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｔｈｅｗｅｉｇｈｔｍｅａｓｕｒｉｎｇｕｎｉｔｏｆｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎｔｈｅＳｏｎｇｄｙｎａｓｔｉｅｓｗａｓｔｈｅａｐｐｅａｒａｎｃｅｏｆＤｅｎｇｚｉ
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［责任编辑 吕冬梅］
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