全 文 ：黄连解毒汤有效成分对缺氧复氧时脑微
血管内皮细胞 ＶＣＡＭ１表达的影响
袁拯忠１，朱陵群２，庞 鹤２，单泽松１，王硕仁２，高永红２，牛福玲２
（１．温州医学院 附属第一医院，浙江 温州 ３２５０００；
２．北京中医药大学 东直门医院 中医内科学教育部重点实验室，北京 １００７００）
［摘要］ 目的：研究栀子苷、黄芩苷和小檗碱对缺氧复氧损伤时大鼠脑微血管内皮细胞的保护机制。方法：
建立离体大鼠脑微血管内皮细胞缺氧４ｈ复氧１２ｈ损伤模型。用０１２８，００６４，００３２μｍｏｌ·ｍＬ－１栀子苷，００２８，
００１４，０００７μｍｏｌ·ｍＬ－１黄芩苷和００２４，００１２，０００６μｍｏｌ·ｍＬ－１小檗碱分别作用于损伤的细胞，采用免疫细胞
化学方法和图象定量分析技术，检测平均吸光度和平均面积，比较各组血管细胞间黏附分子１（ＶＣＡＭ１）蛋白表达
的变化；采用ＲＴＰＣＲ方法检测并比较各组ＶＣＡＭ１ｍＲＮＡ表达的变化。结果：模型组ＶＣＡＭ１蛋白表达的平均吸
光度值和平均面积以及ＶＣＡＭ１ｍＲＮＡ表达显著高于正常组（均Ｐ＜００１）。所有给药组的平均吸光度值和平均面
积均低于模型组，差异有统计学意义（均 Ｐ＜００１）。０００７μｍｏｌ·ｍＬ－１黄芩苷组、００１２，０００６μｍｏｌ·ｍＬ－１小檗
碱组的平均吸光度值较正常组高，差异有统计学意义（Ｐ＜００５，Ｐ＜００１，Ｐ＜００１），其余各给药组与正常组的差异
无统计学意义。００１４μｍｏｌ·ｍＬ－１黄芩苷组平均面积高于正常组，差异有统计学意义（Ｐ＜００５），其余各给药组与
正常组的差异无统计学意义。各给药组ｍＲＮＡ表达高于正常组且低于模型组，差异均有统计学意义（Ｐ＜００５）。
结论：栀子苷、黄芩苷和小檗碱等黄连解毒汤有效成分能够保护缺氧复氧损伤的大鼠脑微血管内皮细胞，其保护
机制之一是抑制ＶＣＡＭ１的表达。
［关键词］ 脑微血管内皮细胞；缺氧复氧；血管细胞间黏附分子１；栀子苷；黄芩苷；小檗碱
［中图分类号］Ｒ２８５．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）２３２８１３０５
［收稿日期］ ２００８０３０６
［基金项目］ 国家人事部留学回国人员科技活动基金（２００２
年）和教育部科学技术研究重点项目（０３０３０）
［通讯作者］ 袁拯忠，Ｔｅｌ：（０５７７）８８６２６７９１，Ｅｍａｉｌ：ｗｚｙｚｚ２００８
＠１２６．ｃｏｍ
中风病错综复杂的临床表现与脑缺血再灌注
损伤后的炎症反应密切相关。脑血管内皮细胞表面
可以表达多种黏附分子。在缺血再灌注脑损伤级
联反应中，多种黏附分子的高表达在整个损伤过程
中有重要作用。血管细胞间黏附分子１（ｖａｓｃｕｌａｒ
ｃｅｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ１，ＶＣＡＭ１）属于黏附分子免
疫球蛋白基因超家族，在炎症反应中起重要作用。
本实验探讨黄连解毒汤有效成分栀子苷、黄芩苷和
小檗碱对 ＶＣＡＭ１的基因和蛋白表达的影响，研究
其作用机制。
１ 材料
１．１ 动物 ＳＤ大鼠，雄性，体重６０～７０ｇ，北京维
通利华公司提供，许可证号 ＳＣＸＫ（京）２００２０００３。
１．２ 试剂 ＤＭＥＭ培养基（美国Ｇｉｂｃｏ公司）。胎牛
血清（北京元亨圣马生物技术研究所，批号０４０３１６）。
明胶、胶原酶Ⅰ、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸 （Ｓｉｇｍａ
公司）。ＰＢＳ，Ⅷ因子相关抗原抗体、过氧化物酶标记
的链霉卵白素抗羊染色试剂盒（北京中杉金桥有限公
司）。ＶＣＡＭ１羊多克隆抗体（美国 Ｓａｎｔａｃｒｕｚ公司，
北京中杉金桥有限公司代理，ＳＣ１５０４）。琼脂糖粉、
ＡｃｃｅｓｓＰＴＰＣＲｓｙｓｔｅｍ（美国 Ｐｒｏｍｅｇａ公司）。Ｔｒｉｚｏｌ
（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）。１００ｂＰＤＮＡＬａｄｄｅｒ，６ｘｌｏａｄ
ｉｎｇｄｙｅ，ＶＣＡＭ１和 ＧＡＰＤＨ的引物（北京赛百胜公
司）。乙醇、氯仿、异丙醇ＤＥＰＣ（国产分析醇）。
１．３ 仪器 ＭＴ－２型 ＯＬＹＭＰＵＳ倒置显微镜（日
本）。ＢＸ６０型 ＯＬＹＭＰＵＳ荧光显微镜（日本）。日
本电子公司 ＳＥＭ－６０００Ｆ型电镜（日本）。ＮＡＰ
ＣＯ５４１０型二氧化碳培养箱（美国）。ＪＪＴ－１３００型
超净工作台（北京）。ＬＤ４－２型落地式电子离心机
（北京）。ＨＲ－８８０Ｍ型微波炉（山东）。ＰＥ２４００型
ＰＣＲ仪（美国）。ＧＥＮＥＱＵＡＮＴ（美国）。图像分析
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系统（ＳＰＯＴ－Ⅱ，美国）。ＤＹＹ－８Ａ稳压稳流定时
电泳仪、电泳槽（北京）。Ｕｖｉｔｅｃ凝胶电泳成像分析
系统（英国）。超低温冰箱（美国）。
１．４ 药物 栀子苷（批号 １１０７４９２００３０９，纯度
９９％）、黄芩苷（批号１１０７１５２００２１２，纯度９９％）、小
檗碱（批号１１０７１３２００２０８，纯度９９％）均由中国药
品生物制品检定所提供。小檗碱溶解于无水乙醇，
黄芩苷、栀子苷溶解于 ＤＭＥＭ培养基，然后３种单
体在缺氧给药时用Ｋｒｅｂｓ溶液稀释到实验需要的浓
度，而在复氧给药时用ＤＭＥＭ培养基稀释到实验需
要的浓度。乙醇浓度控制在１％以内［１］。
２ 方法
２．１ 大鼠脑微血管内皮细胞的培养和鉴定［１］ ４
只６０～７０ｇ大鼠，乙醚麻醉后消毒断头取脑。置于
含ＤＨａｎｋ＇ｓ的培养皿中，去除软脑膜和血管。取大
脑皮质用剪刀剪碎后，以玻璃匀浆器进行匀浆。将
匀浆液过１００目筛网，收集滤液。过２００目筛网，收
集筛网上的微血管组织。将上述含有微血管组织的
培养液吸入离心管中，１５００ｒ·ｍｉｎ－１室温离心，１５
ｍｉｎ。弃上清，向沉淀中加入 ０２％胶原酶Ⅰ ＋
０１％牛血清白蛋白（ＢＳＡ）５ｍＬ消化２０ｍｉｎ，其间
观察微血管段的消化情况。再用上述条件离心，弃
上清，细胞沉淀用培养基洗２次，加入含内皮细胞生
长因子（ＥＣＧｓ）和３０％胎牛血清的完全培养液６ｍＬ
重悬，接种在预先以２％明胶包被的培养瓶中进行
原代培养，４８ｈ后第１次换液。在原代培养过程中，
将微血管内皮细胞团以外的细胞用机械划除法去除
而纯化细胞。待细胞基本汇合后，以０１％胰酶 ＋
０１％乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）消化２０ｍｉｎ，传代培养
２周，以 ４～５代细胞用于实验。倒置显微镜下观
察：传代培养后观察细胞呈长梭形，汇合状态呈单层
“铺路石”状。Ⅷ因子抗体间接免疫荧光鉴定阳性。
扫描电镜观察到细胞表面有短粗而丰富的微绒毛，
证明是脑微血管内皮细胞。
２．２ 建立缺氧复氧损伤模型［１］ 大鼠脑微血管内
皮细胞按１×１０５个／ｍＬ种植于９６孔板中，每孔１００
μＬ，第２天进行造模。以 ＷａｎｄｏｎｇＺｈａｎｇ［２］方法稍
加改进。造模以 ＰＢＳ洗细胞２遍，换无糖的 Ｋｒｅｂｓ
溶液（ｍｍｏｌ·Ｌ－１，ＮａＣｌ１１９，ＫＣｌ４７，ＫＨ２ＰＯ４１２，
ＮａＨＣＯ３２５，ＣａＣｌ２２５，ＭｇＣｌ２１），置于自制的３７℃
密闭缺氧罐中，持续通入９５％Ｎ２＋５％ＣＯ２，流量保
持在０５Ｌ·ｍｉｎ－１。再复氧时将细胞换无血清的
ＤＭＥＭ培养液置正常培养箱中（空气 ＋５％ＣＯ２）。
缺氧时间为４ｈ，再复氧时间为１２ｈ。缺氧复氧损
伤后，倒置显微镜下可见大量微血管内皮细胞变圆
脱落，漂浮在培养基中，贴壁细胞变形、皱缩呈团簇
状，界限不清，细胞间隙增宽，某些融合部分断裂，较
正常细胞有明显的改变。给药组在缺氧和复氧前加
入不同剂量的栀子苷、黄芩苷和小檗碱。对照组换
用无血清ＤＭＥＭ培养基在正常培养箱中培养１６ｈ。
２．３ 分组与给药剂量［１］ 正常组，模型组，０１２８，
００６４，００３２ｍｍｏｌ·Ｌ－１栀子苷组，００２８，００１４，
０００７ｍｍｏｌ·Ｌ－１黄芩苷组和 ００２４，００１２，０００６
ｍｍｏｌ·Ｌ－１小檗碱组。
２．４ 免疫细胞化学染色 参照 ＳＰ法试剂盒说明
书：固定好细胞玻片，室温放置３０ｍｉｎ，加入 ＰＢＳ洗
涤３ｍｉｎ×３次，３％Ｈ２Ｏ２去离子水室温避光孵育１５
ｍｉｎ，蒸馏水冲洗，ＰＢＳ浸泡５ｍｉｎ，微波修复３０ｍｉｎ，
ＰＢＳ洗涤３ｍｉｎ×３次，滴加封闭血清室温孵育 １５
ｍｉｎ，倾去，滴加１∶１００稀释的 ＶＣＡＭ１羊多克隆抗
体，４℃过夜，ＰＢＳ洗涤３ｍｉｎ×３次，滴加生物素标
记的的兔抗羊 ＩｇＧ，３７℃孵育 １５ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤 ３
ｍｉｎ×３次，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，３７
℃孵育１５ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤３ｍｉｎ×３次，ＤＡＢ显色工
作液在光镜下显色５ｍｉｎ，自来水充分冲洗，梯度乙
醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。
２．５ 图象分析 在ＢＸ６０型ＯＬＹＭＰＵＳ显微镜下，选
择２０×物镜，利用ＳＰＯＴⅡｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ．Ｉｎｃ
软件成相，用ＭｅｔａＭｏｒｐｈＵｎｉｖｅｒｓａｌｉｍａｇｉｎｇｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
软件分析阳性细胞的平均吸光度（Ａ）和平均面积。
２．６ 提取ＲＮＡ 参照Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒说明书：超净台
中每瓶细胞用ＰＢＳ洗２次。每个孔内加入适量 Ｔｒ
ｉｚｏｌ，反复吹打，直到镜下观察细胞全部裂解为止。
将细胞破裂后的裂解液（约１ｍＬ）装入已经标记的
ＥＰ管中，再加入０２ｍＬ的氯仿，强烈混匀器混匀成
牛奶样。室温静置３～５ｍｉｎ，１２０００×ｇ，４℃，离心
５ｍｉｎ。取上清转移到装有异丙醇的 ＥＰ管中，强力
混匀。碎冰中静置 １０ｍｉｎ，１万 ×ｇ，４℃，离心 １０
ｍｉｎ。取无水乙醇和 ＤＥＰＣ水配制成 ７５％乙醇备
用。取离心后的样品，弃上清，观察管底的总 ＲＮＡ
白色透明沉淀。每管加入１００μＬ的７５％乙醇，然
后迅速点甩。弃上清，在碎冰中自然干燥 ５～１０
ｍｉｎ。每管加入适量的 ＤＥＰＣ水，强力混匀，使 ＲＮＡ
完全均匀溶解到水中。另取 ＥＰ管标记后，取少量
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ＲＮＡ溶液分装，核酸计量器检测提取的ＲＮＡ在２６０
ｎｍ和２８０ｎｍ波长下的Ａ值，计算总ＲＮＡ的浓度及
纯度。所有样本管于超低温冰箱保存。
２．７ 设计引物 从 ＧＥＮＥＢＡＮＫ上查 ＳＤ大鼠
ＶＣＡＭ１的 ｃＤＮＡ序列，以引物设计软件 Ｐｒｅｍｉｅｒ
５０自动设计。引物交由北京赛百盛生物有限公司
合成。选用看家基因甘油醛３磷酸脱氢酶（ＧＡＰ
ＤＨ）作内参照，以校正计算ＶＣＡＭ１ｍＲＮＡ含量。
ＶＣＡＭ１（３０９ｂＰ）：Ｓｅｎｓｅ，５′ＧＧＧＧＡＴＴＣＣＧＴＴ
ＧＴＴＣＴＧ３′；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ，５′ＣＡＣＡＴＴＡＧＧＧＡＣＣＧＴＧ
ＣＡ３′；ＧＡＰＤＨ（５３０ｂＰ），Ｓｅｎｓｅ，５′ＡＴＧＡＴＴＣＴＡＣ
ＣＣＡＣＧＧＣＡＡＧ３′；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ，５′ＴＴＣＡＧＣＴＣＧＧＧ
ＧＡＴＧＡＣＣＴＴ３′。
２．８ 用ＲＴＰＣＲ试剂盒扩增 ＶＣＡＭ１和 ＧＡＰＤＨ
参照 ＡｃｃｅｓｓＰＴＰＣＲｓｙｓｔｅｍ试剂盒说明书，每个
ＰＣＲ管反应体系如下：５×缓冲液 １０μＬ；ｄＮＴＰ１
μＬ；２５ｎｍｏｌ·Ｌ－１ＭｇＳＯ４３μＬ；ＡＭＶ反转录酶 １
μＬ；ＴｆｉＤＮＡ聚合酶１μＬ；ＲＮＡ模板１ｎｇ；５０ｎｍｏｌ·
Ｌ－１ＶＣＡＭ１上、下游引物各 １μＬ；１０ｎｍｏｌ·Ｌ－１
ＧＡＰＨ上、下游引物各 １μＬ；补水到 ５０μＬ。混匀
后，放入ＰＣＲ仪。
ＶＣＡＭ１扩增条件如下：反转录反应 ４５℃ ４５
ｍｉｎ；ＡＭＶ反转录酶灭活９４℃ ５ｍｉｎ；变性９４℃ １
ｍｉｎ；退火５８℃１ｍｉｎ；延伸７２℃１ｍｉｎ；３５ｃｙｃｌｅ；最
终延伸７２℃ ５ｍｉｎ；４℃保存。
２．９ 琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物 扩增产物在
２％的琼脂糖凝胶上进行电泳，８０Ｖ电压，６０ｍｉｎ
后，在凝胶成像系统上观察、拍照，并判断ＤＮＡ分子
量的大小。采用 Ｐｈｏｒｅｔｉｘ１Ｄ对电泳结果进行定量
分析，后用凝胶自动成像仪扫描成像，用 ＶＣＡＭ１／
ＧＡＰＤＨ比值表示待测基因的相对水平。
２．１０ 统计学处理 实验数据以 珋ｘ±ｓ表示，ＳＰＳＳ
１００进行数据统计和方差分析检验。
３ 结果
３．１ 对脑微血管内皮细胞ＶＣＡＭ１蛋白表达的影响
各组细胞胞浆呈现浅黄色颗粒，胞核不着色或者浅
染。模型组颜色最深。正常组着色最浅。各给药组
细胞胞浆颜色明显比模型组浅，接近正常组的颜色。
模型组的Ａ值显著高于正常组，差异有统计学意义
（Ｐ＜００１）；各给药组的Ａ值与模型组相比均有明显
的降低，差异有统计学意义（Ｐ＜００１），０００７ｍｍｏｌ·
Ｌ－１黄芩苷组、００１２，０００６ｍｍｏｌ·Ｌ－１小檗碱组的Ａ
值较正常组高，差异有统计学意义（Ｐ＜００５，Ｐ＜
００１），其余各给药组与正常组的差异无统计学意义。
模型组的平均面积显著高于正常组，差异有统计学意
义（Ｐ＜００１）；各给药组的平均面积均显著少于模型
组，差异有统计学意义（Ｐ＜００１）。与正常组比较，
００１４ｍｍｏｌ·Ｌ－１黄芩苷组平均面积高于正常组，差
异有统计学意义（Ｐ＜００５），其余各给药组与正常组
的差异无统计学意义。见表１。
表１ 栀子苷、黄芩苷和小檗碱对脑微血管内皮细胞
ＶＣＡＭ１蛋白表达的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝１２）
分组
浓度
／ｍｍｏｌ·Ｌ－１
Ａ
平均面积
／μｍ２
模型 － ００７８±０００１ ０６５９±０１７１
正常 － ００７０±０００１１） ０２７８±００９４１）
栀子苷 ０１２８ ００７０±０００１１） ０１５５±００６２１）
００６４ ００７０±０００２１） ０２１０±００５８１）
００３２ ００７０±０００１１） ０２３５±００９０１）
黄芩苷 ００２８ ００７３±０００３１） ０２０３±００６１１）
００１４ ００７１±０００１１） ０１４９±００３６１，２）
０００７ ００７２±０００１１，２） ０１８４±００４０１）
小檗碱 ００２４ ００７１±０００２１） ０２３７±００６５１）
００１２ ００７３±０００２１，３） ０３２７±００８７１）
０００６ ００７３±０００２１，３） ０３３６±００８０１）
注：与模型组比１）Ｐ＜００１；与正常组比２）Ｐ＜００５，３）Ｐ＜００１
３．２ 对脑微血管内皮细胞 ＶＣＡＭ１ｍＲＮＡ表达的
影响 各组 ＲＮＡ提取的量在 ０７～１３ｇ·Ｌ－１。
Ａ２６０／Ａ２８０在１８～２０。模型组ｍＲＮＡ表达显著高于
正常组，差异有统计学意义（Ｐ＜００１）。各给药组
ｍＲＮＡ表达高于正常组而低于模型组，差异均有统
计学意义（Ｐ＜００５，Ｐ＜００５）。各给药组存在着药
物浓度越高抑制作用越强的趋势。见表２。
表２ 栀子苷、黄芩苷和小檗碱对脑微血管内皮细胞
ＶＣＡＭ１ｍＲＮＡ表达的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
分组 浓度／ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ＶＣＡＭ１／ＧＡＰＤＨ
模型 － １２５５±００５４
正常 － ０８８０±００４１２）
栀子苷 ０１２８ １０００±００６８２，３）
００６４ １０５１±００６６２，４）
００３２ １１０７±００３３２，４）
黄芩苷 ００２８ １０９７±００３６２，４）
００１４ １１５１±００５５１，４）
０００７ １１５４±００５６１，４）
小檗碱 ００２４ １０９２±００５８２，４）
００１２ １１２２±００５７２，４）
０００６ １１５０±００５８１，４）
注：与模型组比１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１；与正常组比３）Ｐ＜
００５，４）Ｐ＜００１
４ 讨论
ＶＣＡＭ１是影响白细胞穿过血脑屏障、参与脑
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缺血再灌注损伤后炎症反应的一种重要的黏附分
子［３］。Ｗｉｌａｍ等对体外培养的人脑血管内皮细胞
在缺氧及复氧两个阶段，用 ＥＬＩＳＡ和 ＲＴＰＣＲ分别
对ＶＣＡＭ１蛋白和ｍＲＮＡ进行测定，发现两者在缺
氧时表达均下调，而在复氧后表达均升高，他认为缺
氧后复氧脑血管内皮细胞表达ＶＣＡＭ１上调加重缺
血再灌注损伤［４］。临床通过对脑梗死死亡者脑组
织研究，发现缺血区脑血管内皮细胞 ＶＣＡＭ１表达
明显升高，而非缺血区脑组织却少有 ＶＣＡＭ１的表
达［５］。因此，抑制缺血再灌注损伤后脑血管 ＶＣＡＭ
１的表达，可以减轻炎症反应，从而改善临床症状，
加速功能恢复。笔者通过免疫细胞化学和 ＲＴＰＣＲ
的方法分别对 ＶＣＡＭ１蛋白和 ｍＲＮＡ进行测定，结
果表明缺氧／复氧损伤可以诱导大鼠脑血管内皮细
胞ＶＣＡＭ１蛋白和ｍＲＮＡ高表达，而分别给与不同
剂量的栀子苷、黄芩苷和小檗碱等黄连解毒汤有效
成分可以有效抑制 ＶＣＡＭ１蛋白和 ｍＲＮＡ的表达，
并且在基因水平存在着药物浓度越高抑制作用越强
的趋势。所以作者认为，抑制 ＶＣＡＭ１的表达是栀
子、黄芩、黄连、黄柏等清热解毒药物对缺血再灌注
损伤后脑血管的保护机制之一。
［参考文献］
［１］ 袁拯忠，朱陵群，庞 鹤，等．黄连解毒汤有效成分对缺氧／复
氧时脑微血管内皮细胞的保护作用［Ｊ］．中国中药杂志，２００７，
３２（３）：２４９．
［２］ ＺｈａｎｇＷＤ，ＳｍｉｔｈＣａｔｈｅｒｉｎｅ，ＳｈａｐｉｒｏＡｎｔｈｏｎｙ，ｅｔａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｂｉｏａｃｔｉｖｅｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓｉｎｈｕｍａｎｃｅｒｅｂｒｏｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓａｎｄａｓｔｒｏｃｙｔｅｓｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏｓｉｍｕｌａｔｅｄｉｓｃｈｅｍｉａｉｎ
ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．ＪＮｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９，１０１（２）：１４８．
［３］ ＧｉｍｅｎｅｚＭＡ，ＳｉｍＪＥ，ＲｕｓｓｅｌＪＨ．ＴＮＦＲ１ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＶＣＡＭ１
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙａｓｔｒｏｃｙｔｅｓｅｘｐｏｓｅｓｔｈｅＣＮＳｔｏｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅｉｎｆｌａｍｍａ
ｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＮｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ，２００４，１５１（１／２）：１１６．
［４］ ＷｉｌａｍＣ，ＳｃｈｉｎｄｌｅｒＲ，ＦｒｅｉＵ，ｅｔａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｓｉｎｏｘｙｇｅｎｔｅｎｓｉｏｎ
ｓｔｉｍｕｌａｔｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＣＡＭ１ａｎｄＶＣＡＭ１ｏｎｈｕｍａｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
ｃｅｌｓ［Ｊ］．ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌ，１９９９，２７６（６Ｐｔ２）：２０４４．
［５］ ＫｒｕｐｉｎｓｋｉＪ，ＫａｌｕｚａＪ，ＫｕｍａｒＰ，ｅｔａｌ．Ｒｏｌｅｏｆａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎ
ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉｃｓｔｒｏｋｅ［Ｊ］．Ｓｔｒｏｋｅ，１９９４，２５（９）：
１７９４．
ＥｆｅｃｔｏｆＶＣＡＭ１ｏｎｈｙｐｏｘｉａａｎｄｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎｉｎｊｕｒｙｉｎ
ｃｕｌｔｕｒｅｄｒａｔｃｅｒｅｂｒａｌｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓｗｉｔｈｅｆｆｅｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ
ｏｆＨｕａｎｇｌｉａｎＪｉｅｄｕｄｅｃｏｃｔｉｏｎ
ＹＵＡＮＺｈｅｎｇｚｈｏｎｇ１，ＺＨＵＬｉｎｇｑｕｎ２，ＰＡＮＧＨｅ２，ＳＨＡＮＺｅｓｏｎｇ１，ＷＡＮＧＳｈｕｏｒｅｎ２，ＧＡＯＹｏｎｇｈｏｎｇ２，ＮＩＵＦｕｌｉｎｇ２
（１．ＦｉｒｓｔＡｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＷｅｎｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｅｇｅ，Ｗｅｎｚｈｏｕ３２５０００，Ｃｈｉｎａ；
２．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＤｏｎｇｚｈｉｍｅｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ，ＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ
ＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００７００，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ，ｂａｉｃａｌｉｎａｎｄｂｅｒｂｅｒｉｎｅｏｎｈｙｐｏｘｉａａｎｄｒｅｏｘｙｇｅｎ
ａｔｉｏｎｉｎｊｕｒｙｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｒａｔｃｅｒｅｂｒａｌｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ａｍｏｄｅｌｏｆｆｏｕｒｈｏｕｒｓｈｙｐｏｘｉａａｎｄｔｗｅｌｖｅｈｏｕｒｓｒｅｏｘｙｇｅｎ
ａｔｉｏｎｉｎｊｕｒｙｉｎｒａｔｃｅｒｅｂｒａｌｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓｉｎｖｉｔｒｏｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅｉｎｊｕｒｅｄｃｅｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ
（０１２８，００６４，００３２ｍｍｏｌ·Ｌ－１），ｂａｉｃａｌｉｎ（００２８，００１４，０００７ｍｍｏｌ·Ｌ－１）ａｎｄｂｅｒｂｅｒｉｎｅ（００２４，００１２，０００６ｍｍｏｌ·
Ｌ－１），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｍｅｔｈｏｄａｎｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｆｉｍａｇｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｍｅａｎｏｐｔｉ
ｃａｌｄｅｎｓｉｔｙａｎｄｍｅａｎａｒｅａｉｎｏｒｄｅｒｔｏｍａｔｃｈｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＶＣＡＭ１．ＴｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆＲＴＰＣＲｗａｓａｄｏｐｔｅｄｔｏｏｂｓｅｒｖｅａｎｄ
ｍａｔｃｈｔｈｅｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＶＣＡＭ１．Ｒｅｓｕｌｔ：Ａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｍｅａｎｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ，ｔｈｅｍｅａｎａｒｅａａｎｄ
ｔｈｅｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＶＣＡＭ１ｏｆｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜００１，Ｐ＜００１，Ｐ＜００１）．Ａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅ
ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ｂｏｔｈｔｈｅｍｅａｎｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙａｎｄｔｈｅｍｅａｎａｒｅａｏｆａｌｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｒｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅ
ｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｍ（Ｐ＜００１，Ｐ＜００１）．Ａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｍｅａｎｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙｏｆｂａｉｃａｌｉｎ（０００７ｍｍｏｌ·Ｌ－１）ａｎｄ
ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ（００１２，０００６ｍｍｏｌ·Ｌ－１）ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜００５，Ｐ＜００１，Ｐ＜００１），ｂｕｔｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｏｔｈｅｒｇｒｏｕｐｓａｎｄｔｈｅｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ．Ａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｍｅａｎａｒｅａｏｆｂａｉｃａｌｉｎ（０００１４ｍｍｏｌ
·Ｌ－１）ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜００５），ｂｕｔｔｈｅｒｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｏｔｈｅｒｇｒｏｕｐｓａｎｄｔｈｅｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ
ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｌｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐｓｗａｓｎｏｔｏｎｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｂｕｔａｌｓｏｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ
·６１８２·
第３３卷第２３期
２００８年１２月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ ２３
Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２００８
（Ｐ＜００５，Ｐ＜００５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ，ｂａｉｃａｌｉｎａｎｄｂｅｒｂｅｒｉｎｅ，ｗｈｉｃｈａｒｅｅｆｅｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｏｆ
ＨｕａｎｇｌｉａｎＪｉｅｄｕｄｅｃｏｔｉｎｇ，ｃａｎｐｒｏｔｅｃｔｈｙｐｏｘｉａｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎｉｎｊｕｒｉｅｄｒａｔｃｅｒｅｂｒａｌｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓ．Ｏｎｅｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｅｄ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｉｓｔｈａｔｔｈｅｙｃａｎｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＶＣＡＭ１．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｃｅｒｅｂｒａｌｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌ；ｈｙｐｏｘｉａｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ；ｖａｓｃｕｌａｒｃｅｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ１；ｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ；
ｂａｉｃａｌｉｎ；ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ
［责任编辑 古云侠］
［收稿日期］ ２００８０１２０
［基金项目］ 国家重点基础研究发展计划（９７３）项目
（２００３ＣＢ５１７１０５）
［通讯作者］ 杨鸿，Ｔｅｌ：（０１０）６４０１４４１１３３３１，Ｅｍａｉｌ：ｌｅｓ
ｌｉｅ１８０２９＠１６３．ｃｏｍ
解毒通络注射液对 ＭＣＡＯ大鼠脑组织
炎性细胞因子的影响
杨 鸿，赵宜军，王永炎
（中国中医科学院，北京 １００７００）
［摘要］ 目的：研究解毒通络注射液（ＪＤＴＬ）对局灶性脑缺血大鼠脑组织肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）、白细胞介
素１β（ＩＬ１β）、细胞间黏附分子１（ＩＣＡＭ１）以及单核细胞趋化蛋白（ＭＣＰ１）含量的影响，探讨解毒通络注射液减轻
脑缺血性损伤的作用机制。方法：成年雄性ＳＤ大鼠，线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型（ＭＣＡＯ），随机分成假手
术对照组、模型组、解毒通络注射液高、中、低剂量组（８３２，４１６，２０８ｍｇ·ｋｇ－１）和尼莫地平组。应用放射免疫法
（ＲＩＡ）检测脑组织匀浆ＴＮＦα和ＩＬ１β含量，酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）检测脑组织匀浆ＩＣＡＭ１和ＭＣＰ１含量。结
果：脑缺血６，２４ｈ，大鼠脑组织ＴＮＦα，ＩＬ１β，ＩＣＡＭ１以及ＭＣＰ１含量均有不同程度的升高。解毒通络注射液高、
中剂量组可以明显阻抑缺血脑组织上述细胞因子含量的增加。结论：解毒通络注射液对抑制脑缺血后炎症因子和
黏附分子的表达具有良好的作用，能够减轻炎性损伤，阻抑脑缺血损伤级联反应，减轻缺血对神经元的损害。
［关键词］ 解毒通络注射液；脑缺血；炎性细胞因子；黏附分子；单核细胞趋化蛋白
［中图分类号］Ｒ２８５．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）２３２８１７０４
随着缺血性脑卒中机制研究的不断深入，脑缺血
早期的炎症反应及其损伤作用日益受到关注。炎性
细胞因子作为重要的免疫递质，被公认为缺血性脑卒
中发病机制中的关键介质，因而成为缺血性脑卒中研
究中的热点。其中肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）、白细胞
介素１（ＩＬ１β）等细胞因子和单核细胞趋化蛋白
（ＭＣＰ１）、细胞间黏附分子１（ＩＣＡＭ１）等参与了这一
炎症反应过程并起到重要作用，拮抗它们的作用有可
能减轻脑损伤的程度，缓解神经系统症状。
作者的前期实验研究显示，解毒通络注射液不
仅对大鼠局灶性脑缺血有很好的保护作用，能显著
减少脑梗死范围，改善缺血神经症状，同时能显著抑
制大鼠急性炎症反应，具有明显的抗炎作用［１］（在
确定药物临床适应症后，更名为“解毒通络注射
液”）。本实验进一步观察该注射剂对脑缺血损伤
炎性细胞因子等的影响，探讨其治疗局灶性脑缺血
的部分作用机制。
１ 材料
１．１ 动物 ＳＤ大鼠，雄性，体重３００～３２０ｇ，由北
京大学医学部实验动物科学部供给。合格证号
ＳＣＸＫ（京）２００２０００６。
１．２ 药品及试剂 解毒通络注射液，由栀子提取物
与灯盏花素按３∶１配制而成，生药含量１０３９ｇ·
Ｌ－１，由本所制剂研究室提供，批号０５０４１７；尼莫地
平注射液，山东新华制药股份有限公司，批号
０４０２００６；ＴＮＦα放射免疫测定盒，北京美迪科生物
技术有限公司，批号 ０５０５２５；ＩＬ１β放射免疫测定
盒，北京美迪科生物技术有限公司，批号０５０５２５；大
鼠ＩＣＡＭ１定量ＥＬＩＳＡ试剂盒，上海太阳生物技术
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第３３卷第２３期
２００８年１２月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ ２３
Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２００８