全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
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kampomedicine，onrenalstoneformationandosteopontin
expressioninars．turolithiasismodel[J]UrolRes，1909，27
(3)c194—190．
油茶皂苷对缺氧一复氧诱导的内皮细胞损伤及中性粒细胞黏附的影响
黄起壬1，何明1，戴育成2，罗永明3
(1．江西医学院药理教研室，江西南昌 330006；2．江西医学院第二附属医院血液研究所
江西南昌 330006；3．江西中医学院药学系，江西南昌330006)
摘要：目的研究油茶皂苷(sQs)对缺氧一复氧诱导的内皮细胞损伤及中性粒细胞黏附的作用及可能的机制。方
法 建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧一复氧损伤模型，取培养细胞上清液测定LDH活性，分别测定HU
VEC存活率．中性粒细胞黏附率、线粒体丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(s0D)和谷胱甘肽过氧化物酶
(GSH—Px)活性。同法检测中性粒细胞黏附。结果缺氧复氧可导致HUVEC损伤及中性粒细胞黏附的增加，表
现为LDH活性、MDA水平及中性粒细胞黏附率显著升高，而SOD和GSH—Px活性显著下降{sQs呈浓度依赖性
地对抗上述改变。结论SQS对缺氧一复氧诱导的HUVEC损伤有保护作用，其机制可能与其抗脂质过氧化和抑制
白细胞黏附有关。
关键词：油茶皂苷；内皮细胞；中性粒细胞；黏附；缺氧一复氧
中周分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)t2—1831—04
Effectsofsasanquasaponinoninjuryofendothelialcellsinduced
byhypoxia—reoxygenationandneutrophiladhesion
HUANGQi—renl，HEMin91，DAIYuchen92，LUOYong—min93
(1．DepartmentofPharmacology，JiangxiMed calCo lege，Nanehang330005·Chinal2．I stituteofHematology，
theSecondAffiliatedHospitalofJiangxiMedicalCo lege，Nanchang330006，China；3Departmentof
PharmaceuticalScience，JiangxiCollegeofTraditionalChineseMedicine，Nanehang330006，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheffectofsasanquasaponin(SQS)oni juryofendothelialcells
inducedbyhypoxia—reoxygenationandneutropbiladhesion，anditspossiblemechanisms．MethodsHu
manumbilicalveinendotheliaIcells(HUVEC)wereexposedtonormoxiaorhypoxia—reoxygenationlnthe
absenceorpresenceofSQS(10．0，1．0，and0．1#mol／I。)．Lactatedehydrogenase(LDH)activitywasde—
terminedinculturedHUVECsupernatants．HUVECsurvivaIr te，neutrophiladhesionrate，malondialde—
hyde(MDA)1evelsup roxided smutase(SoD)andglutathioneperoxidase(GSH—Px)activitieswerem a—
sured．Neutrophiladhes onwasassayedinadditionalHUVECtreatedasabove．ResultsTheresults
showedthathypoxla—reoxygenationresultedinHUVECinjuryandenhancementofn u rophiladhesion，
withtheincreaseinLDHactivity，MDAlevel，andadhesionrateaswell，conversely，withthedecreasein
activityofSODandGSH—Px{SQSantagonizedthesechangesinaconcentration—dependentmann r．Con—
elusionSQSmayprotectHUVECagainstbypoxia—reoxygenationinjuryanditsmechanismappearestobe
relatedoanti1ipoDeroxldlzationandan i—adhesionofwhitebloodcell．
Keywords：sasa“quasaponin；endothelialcells；neutrophils；adhesion；hypoxia—reoxygenation
缺血再灌注损伤是许多心脑血管疾病共同的
病理过程。已有充分证据表明：中性粒细胞的参与是
缺血再灌注损伤的关键因素，而血管内皮则是缺
血一再灌注损伤的关键部位。1]。研究表明，细胞在缺
血或缺氧的情况下，将出现能量代谢障碍，引起细胞
内钙超载和氧自由基的产生，并产生细胞因子，激活
鉴鍪品留：翌蔷善篙臻科学基金资助项目(。。。。∞。，
作者简介：T黄e起l：壬(0(719916)763)6’0男590’江西Fa省x：南(康07市91人)6’3副61教69授3’博E-七m’a研il,究h方uan向gq为r6心7@血1管63药,c理orn学和分子药理学
万方数据
·1832· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
中性粒细胞，激活的粒细胞可以变形、变僵，沉积在
毛细血管及小血管，从而改变血管的通透性进而损
伤血管内膜的完整性和功能，激活的中性粒细胞还
能黏附到血管和心内膜内皮细胞并迁移到皮下，分
泌各种活性物质进一步损害内皮细胞和心肌细胞。
在缺血一再灌注损伤过程中，中性白细胞与血管内皮
细胞的黏附是关键的一步。
油茶皂苷(sasanquasaponin，SQS)是从油茶
籽中提取的一种有效单体成分，化学结构上属于三
萜烯类，具有与人参皂苷、三七皂苷等相似的化学结
构。相对分子质量为1204．0352。前期研究发现，
SQS对心肌缺血一再灌注损伤具有保护作用，其机
制与抗钙、抗氧自由基及诱导内源性心肌保护物质
的生成有关口“]。近期在小鼠缺血一再灌注损伤实验
中，发现SQS能降低缺血一再灌注损伤所致心律失
常的发生率，其机制是通过调控心肌细胞内氯离子
的平衡来实现的[6]。但其对缺氧复氧诱导内皮细胞
损伤的作用及对中性粒细胞黏附的影响，尚未见报
道。因此，本研究拟建立人脐静脉内皮细胞(HU—
VEC)缺氧一复氧损伤模型，研究SQS对HUVEC
损伤的作用及对中性粒细胞黏附的影响并初步探讨
其作用机制。
1材料
1．1药品与主要试剂：SQS粉剂，从茶籽饼中按
Ueda的方法”1分离提取并纯化，质量分数可达
97．8％。IMDM培养基(Gibco)；胎牛血清(杭州四
季青)；胰蛋白酶(Sigma进口分装)；Ⅱ型胶原酶、
HEPES、EDTA、鼠抗人vWF、MTT、多聚赖氨酸均
为Sigma公司产品，hVEGF为Biosource公司产
品，兔抗鼠IgGl一FITC(SantaCruz)，乳酸脱氢酶
(I。DH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)、丙二醛
(MDA)和超氧化物歧化酶(sOD)测定试剂盒均
为南京建成生物工程研究所产品。
1．2 主要仪器：sw—cJ—TA水平流超净工作台
(吴江市净化设备总厂)，NAPC0二氧化碳培养箱
(美国)，DIAPHOT--TMD型倒置显微镜(Nikon
公司)，BX51型荧光显微镜(Olympus公司)，Sar—
toriusBSll0型电子天平(德国)，Beckman低温低
速离心机(Beckman公司)。
2方法
2．1 HUVEC原代和传代培养：参照Jaffe等方
法o3略加改进。取分娩4h内健康新生儿脐带，磷酸
盐缓冲液(PBS)冲洗，1g／L胶原酶Ⅱ灌注消化，
离心收集。用含200mL／L胎牛血清(FBS)、100
U／m!．青霉素、100mg／I，链霉素、20／-g／l，VEGF、
50mg／L肝素的Iscove改庭培养基(IMDM)，调整
细胞数为2×106／mL，接种于用1g／L多聚赖氨酸
包被的培养瓶中。待细胞80％以上融合时，vWF免
疫荧光化学鉴定。取第3代细胞用于实验。
2．2 HUVEC缺氧一复氧损伤模型的建立：参照
Koyama等方法o]。首先配制模拟缺氧溶液(mmol／
L：NaH2PO{0．9、NaHC036．0、CaC][21．0、MgS04
1．2、HEPES20．0、NaCl98．5、KCl10．0、乳酸钠
40．0，pH6．8，37℃)和模拟复氧溶液(mmol／I。：
NaCl129．5、KCl5．0、NaH2P040．9、NaHC03
20．0、CaCI2 1．0、MgS041．2、HEPES20．0、葡萄糖
5．5，pH7．4，37℃)。取第3代HUVEC，当细胞长
至80％融合时用预先经95％N。和5％CO。混合气
体饱和lh的模拟缺氧溶液置换正常培养液即缺
氧；用预先经95％o。和5％CO。混合气体饱和lh
的模拟复氧溶液置换缺氧液即为复氧。
2．3实验分组：实验共分5组，每组设复孔，重复3
次。分别为对照组：弃去原培养液，换用复氧溶液置
于培养箱(95％O。、5％CO。，37℃)3h，再换上复
氧溶液孵育2h。缺氧一复氧损伤组(模型组)：弃去原
培养液，换预先经95％N。和5％CO：混合气体饱和
过的模拟缺氧溶液，然后置于95％N：和5％COz混
合气体持续通气的缺氧密闭容器中(37℃)3h，再
换上预先经95％O。和CO：混合气体饱和过的模拟
复氧溶液，于95％o。和5％CO。混合气体中复氧孵
育2h。SQS组：在缺氧～复氧前3h和整个缺氧一复
氧期间分别加入终浓度为10．0、1．0、0．1／』mol／L
sQs，其余处理同模型组。
2．4细胞培养上清液中LDH活性测定：实验处理
结束后各组分别收集细胞培养液，500×g离心，取
200止上清液，严格按LDH试剂盒说明书操作检
测其活性。
2．5 MTT法检测HUVEC存活率：将第3代
HUVEC接种于96孔培养板中，接种密度为每孔
2．0×10s个细胞，每孔液体200止。细胞长至80％
融合时按2．3项下方法进行处理。处理后，弃原培养
液，用PBS洗涤各孔3次，加入MTT溶液(5rag／
mL)20pI，，孵育4h，每孔加入150止DMSO，振
荡10min，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上
测定各孔吸光度(A)值。设不加细胞只加孵育液的
空白对照调零，记录结果。
细胞存活率一实验组^值／对照组^值×100％
2．6人外周血中性粒细胞的分离：健康人静脉血
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月· 833·
20mL，肝素抗凝，用Pereoll分离液分离中性粒细
胞(1．080g／mI。)，PBS洗涤两遍后重悬于50mE／
LFBS的IMDM培养基中，调整细胞数为2．5×
106／mE。Giemsa染色中性粒细胞纯度90％以上，
台盼蓝染色细胞活力大于95％。
2．7 中性粒细胞与HUVEC黏附率的测定：Hu—
VEC处理结束后，吸弃各孔液体，PBS洗孔3次，加
入中性粒细胞悬液200pL(5．0×105个)，37℃孵
育30min。吸除未黏附的中性粒细胞，PBS洗3次，
每孔加入100pL0．25％RoseBengal(PBS配制)，
室温孵育5rain。吸除染料，PBS洗3次，加入PBS
乙醇(1；1)，每孔200pL，室温孵育30min，酶标
仪570nm波长测定各孔A值。中性粒细胞所摄取
的RoseBengal染料在PBS一乙醇作用后可释放出
来，因此，每孔A值与所黏附的中性粒细胞数量成
正比，计算各组的细胞黏附率。
黏附率一(HUVEC黏附中性粒细胞A值一HUVECA
值)／／m入总中性粒细胞A值×100％
2．8 HUVEC线粒体蛋白的制备：经2．3项下方法
处理后的HUVEC用PBS洗2次，用细胞刮收集
细胞，PBS洗2次，离心(1500×g，5rain)，收集细
胞沉淀于1．5mLEppendorff管中。加入1．0mL
Pipes—Tritonbuffer(10mmol／LPipes、0．1mol／I，
NaCl、2mmol／LMgCl2、1mmol／LPMSF、10pg／
mLLeupeptin、0．1％Triton，pH7．9)，吹打混匀细
胞，在4℃孵育30min。4℃10000×g离心20
min，弃上清液，即得粗线粒体沉淀，超速离心
(15000×g，30min)一次，得到较纯的线粒体沉淀。
用考马斯亮蓝法进行蛋白定量，储于～70℃备用。
2．9 HUVEC线粒体MDA水平、SOD和GSH-
Px活性测定：取200pI，线粒体悬液严格按试剂盒
上说明分别进行各指标测定。
2．10统计分析：所有数据均以z士s表示，采用统
计软件SPSS11．5进行方差齐性检验、单因素方差
分析(OnewayANOVA)，组间比较用LSD法。
3结果
3．1 sQs对缺氧一复氧诱导HUVEC损伤的影响：
HUVEC缺氧一复氧损伤5h后，培养液中LDH活性
显著升高，与对照组比较，差异非常显著(尸<
0．01)；但HUVEC存活率无明显下降。不同浓度的
SQS(IO．0、1．0、0．1wnol／L)预先孵育HUVEC3
h后，再缺氧一复氧损伤5h，可见sQs呈浓度依赖性
地降低LDH活性，其中10．0／zmol／LSQS作用最
明显；但对HUVEC存活率无明显影响。结果见表1。
裹1 SQS对缺氲一复氧诱导HUVEC损伤的影响
(xis，H一6)
Table1 EffectofSQSoⅡHUVECInjuryinduced
bybypoxla-reoxysenatlon(，士，，月一6)
与对照组比较}¨P
Ap<0．05△△P<0．01。jmodelgroup
3．2 SQS对缺氧一复氧诱导中性粒细胞与HUVEC
黏附的影响：由表2可看出，模型组中性粒细胞与
HUVEC的黏附率明显高于对照组，差异非常显著
(P
22．2％，差异显著(P
衰2 SQS对缺氲一复氧诱导中性粒细胞与HUVEC
黠附的影响(；士s，n一6)
Table2 EffectofSQSonneatrophU站lhesiontoHUVEC
inducedbyhypoxla—reoxygenation“土s，n一6)
与对照组比较：一P<0．01
与模型组比较：6．p<0．05△6P
水平、SOD和GsH—Px模型活性的影响：模型组
MDA水平显著增加，与对照组比较差异非常显著
(P
(P
性。结果见表3。
4讨论
白细胞与内皮细胞(Ec)黏附是多种急、慢性
心脑血管疾病发生、发展的重要环节。大量研究表
明，局部缺血时，除缺血再灌注所致组织直接损伤
外，缺血区还可产生多种细胞因子(如IL—l、TNF一“
万方数据
·1834· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
表3 SQS对缺氧一复氧损伤HUVEC线粒体MDA水平、
SOD和GSH—Px活性的影响(；士F，H一6)
Table3 EffectofSQSonMDAlevel，SODandGSH-Px
activitiesofHUVECinjuriedbyhypoxia—
reoxygenation(J士J，月=6)
与对照组比较：’。P<()·Ol
与模型组比较：6P<0．05z弘p<0．01
+‘P<001目jcontrolgroup
￡P<0—05△△P<0—01v5modelgroup
等)及大量的活性氧(ROS)，进一步刺激血管EC，
导致EC损伤，并诱导EC大量表达细胞黏附分子
(CAMs)，如ICAM1、VCAM—l、E选择素等。白细
胞在一系列分子级联反应的作用下，沿血管内皮滚
动，识别并结合位点，形成病源性细胞，进一步加剧
炎症反应的发生和发展，最终导致多器官功能不全
(MODS)甚至多器官衰竭(MOF)口⋯。
本实验以HuVEC的缺氧复氧应激损伤模型
来模拟组织器官的缺血一再灌注损伤，从细胞水平来
观察sQs对HUVEC缺氧一复氧应激损伤的保护
作用及中性粒细胞黏附的影响，并初步探讨sQs的
可能作用机制。本研究发现：体外培养的HUVEC
在受到缺氧一复氧应激时，LDH活性显著增加，但存
活率无明显影响，这说明在缺氧一复氧时，HUVEC
可出现不同程度的损伤，但还不足以产生明显的凋
亡或死亡的结果，HUVEC此时还处于应激状态。
sQs呈浓度依赖性地对抗缺氧复氧应激所致的
HUVEC损伤，降低I，DH活性，对HUVEC的损伤
有显著的保护作用，但它对HUVEC的增殖无明显
影响。
在中性粒细胞与HUVEC黏附的实验中，发现
缺氧复氧应激可促进中性粒细胞与HUVEC的黏
附，黏附率较对照组明显升高，该变化与HUVEC
的损伤程度呈平行关系，这说明中性粒细胞与EC
的黏附可加重EC的损伤，其机制为中性粒细胞与
EC黏附可激活黄嘌呤脱氢酶(XD)转化为黄嘌呤
氧化酶(xO)，在x0的作用下，产生大量毒性的活
性氧系列(Ros)，使EC膜脂质过氧化，产生大量
的MDA，导致EC的损伤⋯】。而sQs可显著抑制
缺氧一复氧应激所致的白细胞黏附增加，并呈一定的
浓度依赖关系，这可能是SQS对EC产生保护作用
的机制。sQs抑制白细胞黏附的机制可能与细胞间
黏附分子(ICAM一1)转录下调有关”“。
此外，本实验还发现缺氧一复氧应激可引起
HUVEC线粒体MDA大量堆积，SOD和GsH—Px
活性明显降低，以致ROs在线粒体的积聚造成EC
损伤；sQs可显著降低缺氧复氧所致的线粒体
MDA生成，提高或恢复EC线粒体sOD和GSH
Px活力，增强或恢复其清除氧自由基的能力，并呈
现一定的剂量依赖性。这可能是sQs对EC产生保
护作用的又一重要机制，这一结果与前期在大鼠心
肌损伤实验中观察的结果相吻合1“。
综上所述，sQS对缺氧一复氧诱导的HUVEC
损伤具有保护作用，其机制可能与其抗脂质过氧化
作用和抑制白细胞黏附作用有关，但确切作用机制
有待于进一步研究。
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万方数据
油茶皂苷对缺氧-复氧诱导的内皮细胞损伤及中性粒细胞黏附
的影响
作者： 黄起壬， 何明， 戴育成， 罗永明， HUANG Qi-ren， HE Ming， DAI Yu-cheng， LUO
Yong-ming
作者单位： 黄起壬,何明,HUANG Qi-ren,HE Ming(江西医学院,药理教研室,江西,南昌,330006)， 戴育
成,DAI Yu-cheng(江西医学院第二附属医院血液研究所,江西,南昌,330006)， 罗永明,LUO
Yong-ming(江西中医学院,药学系,江西,南昌,330006)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(12)
被引用次数： 9次
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草药2001,32(1)
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4. 彭凌.朱必凤.刘主.PENG Ling.ZHU Bi-feng.LIU Zhu 油茶肉质果和肉质叶提取液降血糖及抗氧化作用的实验研
究[期刊论文]-中国药理学通报2007,23(12)
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6. 彭少君.陈和平.何明.PENG Shao-jun.CHENG He-ping.HE Ming AE3介导的油茶皂甙在心肌细胞缺氧复氧损伤中
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2009(4)
10. 黄起壬.戴育成.陈和平.刘丹.曾国华.何明.罗永明.HUANG Qi-ren.DAI Yu-cheng.CHEN He-ping.LIU Dan.
ZENG Guo-hua.HE Ming.LUO Yong-ming 油茶皂苷对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞ICAM-1表达的抑制作用[期刊论文
]-中国药学杂志2006,41(22)
引证文献(9条)
1.唐玲.陈跃龙.史丽颖.王永奇.冯宝民 油茶籽提取物的体外抗癌活性[期刊论文]-华西药学杂志 2008(6)
2.佟小静.陈重.李夏.李笑然.许琼明.杨世林 油茶根化学成分的研究[期刊论文]-中草药 2011(10)
3.袁林 中药有效成份对缺血再灌注损伤心肌的保护机制[期刊论文]-中医临床研究 2010(19)
4.唐玲.葛迎春.刘平.陈跃龙.冯宝民.王永奇 油茶籽提取物对体外培养不同肿瘤细胞增殖的抑制作用[期刊论文]-
辽宁中医药大学学报 2008(10)
5.唐玲.陈跃龙.师海波.苗艳波.王永奇.冯宝民 油茶杀精子和抗生育作用的实验研究[期刊论文]-中成药 2009(2)
6.唐玲.冯宝民.史丽颖.吴小娟.师海波.苗艳波.王永奇 山茶属植物的抗骨质疏松作用[期刊论文]-中药材
2008(10)
7.王永奇.吴小娟.李红冰.逄越.唐玲.冯宝民 药用山茶属植物的研究[期刊论文]-大连大学学报 2006(4)
8.唐玲.冯宝民.李红冰.陈跃龙.史丽颖.王永奇 油茶皂素的研究进展[期刊论文]-中南药学 2008(3)
9.唐伟卓.赵余庆 油茶皂苷的现代药学及生物活性研究进展[期刊论文]-药物评价研究 2012(1)
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