全 文 ：二次回归正交旋转组合设计优化苦参生物碱渗漉提取条件
秦学功，徐　馨
（黑龙江八一农垦大学 生命科学技术学院，黑龙江 大庆 １６３３１９）
［收稿日期］　２００８０６０５
［基金项目］　省教育厅科学技术研究项目（１１５１１２４７）
［通讯作者］　秦学功，Ｔｅｌ：（０４５９）６８１９２９９，Ｆａｘ：（０４５９）６８１９２
９０，Ｅｍａｉｌ：ｘｇｑｉｎ２００５＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
　　苦参ＳｏｐｈｏｒａｆｌａｖｅｓｃｅｎｓＡｉｔ．系我国传统中药，为
豆科槐属植物的干燥根，主要活性物质为生物
碱［１］。提取生物碱的方法主要有煎煮、浸渍、回流、
渗漉［２］。其中煎煮法能耗高，提取的杂质多，而生
物碱提取率并不高，因为较高温度反使苦参生物碱
的溶解度降低；浸渍为静态提取，故浸出率亦不高；
回流提取通常可获得较高的提取率，但既能耗较高，
又不便于规模化生产，且对本物系因较高温度同样
提取率不高；而渗漉法为常温常压动态提取，其提取
过程相当于多次逆流萃取，能以较少的提取剂获得
较高的提取率，且杂质少，故提取液总碱浓度高，可
为后继的分离过程打下良好基础［３］，因此本实验选
用渗漉法。
二次回归正交旋转组合设计是一种具有正交、
回归、均匀和较高饱和程度的一种试验设计方法，
属更高级的试验设计技术。二次回归正交旋转组
合设计通过较少的实验提供大量的信息。模型建
立之后，可以从许多角度对模型进行模拟分析，以
充分发掘模型所提供的信息。如模拟寻优，从回归
模型中推导、筛选出最佳的措施和策略；因子作用
（效应）分析，即当其他因子为零水平时，分析某１
个或２个因子对试验结果的影响等［４］。它一方面
基本保留了回归正交设计的优点，如试验次数少、
计算简单以及部分地消除了回归系数间的相关性；
另一方面，有助于克服在回归正交设计中二次回归
预测值的方差依赖于试验点在因子空间中位置的
缺点［５］。它克服了正交试验只能给出最佳因素水
平组合，而无法找出整个区域上因素的最佳组合和
试验结果的最优值的缺陷。而对于均匀设计，是处
理多因素多水平试验设计的首选方法，当描述复杂
自然现象和探讨复杂的规律，实验因素和水平在５
个以上时才多用此法。因此本试验选择二次回归
正交旋转组合设计。近年来很多学者将二次回归
正交旋转组合设计应用于生物领域研究，取得了较
好的效果，然而用于天然药物提取实验的报道并
不多。
１　材料
苦参饮片购自哈市三棵树药材市场，经黑龙江
中医药大学都晓伟教授鉴定。
ＦＡ２００４Ｎ型电子精密天平（上海精密科学仪器
有限公司）；１００ｍｍ×１００ｍｍ薄层色谱硅胶 Ｇ板
（青岛海洋化工分厂）；１００ｍｍ×１００ｍｍ色谱缸（上
海信谊仪器厂）；吉尔森 Ｐ型移液器（华运有限公
司）；ＤＧＧ－９０００型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信
实验仪器有限公司）等。
盐酸、醋酸乙酯、无水乙醇、氨水、冰醋酸、次硝
酸铋、碘化钾等均为市售分析纯。苦参碱（批号
１１０８０５－２００３０６）、氧化苦参碱（批号 １１０７８０－
２００３０６）和槐定碱（１１０７８４－２００３０３）对照品均购自
中国药品生物制品检定所。槐果碱（上海融禾医药
科技有限公司，批号０７０１１２）。
２　方法
２．１　对照品的配制
称取氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱、槐定碱各
１００ｍｇ，放入量瓶中，注入蒸馏水摇匀溶解，定容至
１０ｍＬ，制成１ｇ·Ｌ－１的对照品溶液备用。同法制成
浓度为２ｇ·Ｌ－１的对照品溶液备用。
２．２　苦参生物碱含量的测定
取１００ｇ苦参粗粉，以ｐＨ２０的盐酸浸泡１２ｈ
后，装入渗漉柱中，以 ３ｍＬ·ｍｉｎ－１的速度开始渗
漉，白天收集渗漉液，存放于冰箱中；晚上停止渗漉，
渗漉柱中静态浸渍；次日继续渗漉，每天重复，直至
渗漉液中无生物碱检出为止，即当渗漉液浓缩１０００
倍，点板，展开，显色，用薄层色谱扫描仪检测其中各
生物碱含量均为零时为渗漉终点。最后仍然利用薄
层色谱检测法检测此１００ｇ苦参中总生物碱含量：
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取１００ｍｍ×１００ｍｍ薄层色谱硅胶 Ｇ板，距离硅胶
板底端和顶端１ｃｍ处分别用铅笔轻轻划一条线，底
端的线上每隔１ｃｍ点一个原点。以移液枪分别吸
取样品及标准品０５μＬ，分别点在标好的原点上，
吹干后置于展开缸的一槽中，另一槽中以移液管分
别吸取展开剂［６］：醋酸乙酯５ｍＬ，无水乙醇１ｍＬ，
氨水０５ｍＬ，盖上缸盖饱和１０ｍｉｎ后将硅胶板水平
插入有展开剂的一槽中，待展开剂跑至距硅胶板顶
端１ｃｍ处取出硅胶板，吹干后沾渍显色剂，再吹干
后以薄层色谱扫描仪测得各生物碱单碱的含量，累
加每一样品中单碱的含量即为总碱含量。最终测得
本批苦参药材总生物碱的质量分数为０８％，即１００
ｇ苦参粗粉中含有总生物碱０８ｇ。以此为基础计
算实验中各组不同条件下的总生物碱提取率，总碱
提取率／％＝１００ｇ苦参药材总碱提取量／０８。
２．３　单因素实验
渗漉提取，药物有效成分的提取率受到粉碎粒
度、浸润时间、渗漉液与药材的倍量关系、浸提液的
ｐＨ、温度和渗漉流速等诸多因素的影响。对于温
度，本实验在室温下进行；对于浸润时间，浸润１２ｈ
后提取率的提升程度趋于平滞，故控制浸润时间为
１２ｈ。因此本实验将对其中的粉碎粒度、渗漉液与
药材的倍量关系、浸提液的 ｐＨ和渗漉流速进行四
因素五水平试验，来寻求最佳提取工艺条件。
２．３．１　粉碎粒度对提取率的影响实验　粉碎可加
速药材中有效成分的浸出，但并不是越细越好。粉
碎过细不仅吸附有效成分的副作用增加、加大渗漉
流体阻力，还导致细胞内的大量不溶物质及较多的
树脂、黏液质等浸出，使渗漉液浑浊，且过滤困
难［７］。故选择 ２０００年版《中国药典》规定的细粉
（１００～８０目）、中粉（８０～６５目）、粗粉（６５～２４
目）、最粗粉（２４～１０目）４种粒度，并外加超粗粉
（１０～５目），共５种粒度的苦参粉做对比实验。
每种粒度苦参粉各取３００ｇ，３等分分装于３个
５００ｍＬ烧杯中，均加入蒸馏水各５００ｍＬ，室温下同
条件浸取１２ｈ，各瓶取浸出液１ｍＬ检测总生物碱浓
度，组内计算平均浓度后计算提取率。
２．３．２　酸浓度对提取率的影响实验　浸提过程中
浸提剂的ｐＨ与浸提效果密切相关。调低浸提剂的
ｐＨ，当生物碱以生物碱盐的形式存在时，其溶解度
增大。但ｐＨ过低既可能导致植物惰性组织的酸解
变形，使渗漉流体阻力增大、杂质增加，又将加重规
模化生产金属设备的腐蚀。故多以稀酸水提取生物
碱。本实验选取１０，２０，３０，４０，５０五水平进行
考察。
用１ｍｏｌ·Ｌ－１的ＨＣｌ调节蒸馏水ｐＨ依次约为
１０，２０，３０，４０，５０，每种 ｐＨ盐酸水溶液各取１
５００ｍＬ，３等分分装３个５００ｍＬ烧杯中，均加入粗
粒度的苦参粉各１００ｇ，同时常温浸取１２ｈ，各烧杯
取浸出液１ｍＬ检测总生物碱浓度，组内计算平均浓
度后计算提取率。
２．３．３　渗漉速度对浸取率的影响实验　中药渗漉提
取分为慢渗和快渗，慢渗时滤液流出速度为１～３ｍＬ
·ｍｉｎ－１，快渗时滤液流出速度为３～５ｍＬ·ｍｉｎ－１。
本实验欲全面、仔细考察渗漉速度对提取率的影响，
故选取１，２，３，４，５ｍＬ·ｍｉｎ－１五水平进行实验。
取１５份粗粉各１００ｇ分装于５００ｍＬ烧杯中，
以ｐＨ３０的盐酸水溶液浸润１２ｈ，３份为１组，各
组分别以１，２，３，４，５ｍＬ·ｍｉｎ－１的流速进行渗漉
提取，均收集４倍柱体积的渗漉液，分别取样进行薄
层色谱分析，组内计算平均浓度后计算提取率。
２．３．４　料液比对浸取率的影响实验　通常，提取溶
剂用量越多则生物碱提取越完全，药物原料利用率
越高。但提取时间越长、提取液的生物碱浓度越低，
后续处理量越大。反之相反。一般６倍料液比生物
碱的提取即较完全。为了更全面的对提取溶剂量与
药材倍量比的分析，本实验选取２，３，４，５，６倍料液
比五水平进行实验。
取１５份粗粉各１００ｇ分装于５００ｍＬ烧杯中，
以ｐＨ３０的盐酸水溶液浸润１２ｈ，３份为１组，各
组分别收集２，３，４，５，６倍柱体积的渗漉液，分别取
样进行薄层色谱分析，组内计算平均浓度后计算提
取率。
２．４　二次回归正交旋转组合实验设计　依据单因
素试验的结果分析确定各因素水平范围，采用四元
五次回归正交旋转组合实验设计，参试因子的水平
设置及编码见表１。影响模型的建立是根据系统分
析的观点采用四因子（１／２实施）二次正交旋转回归
组合设计表（表６）。每一参试因子的水平编码为－
２，－１，０，１，２。目标函数为生物总碱提取率。整个
实验设３６个组合，依各组条件操作，测得各组渗漉
液总碱浓度，计算出相应的提取率。采用统计软件
ＳＡＳ９０进行统计分析，从而确定最佳组合。
３　结果与讨论
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表１　因子水平编码表
因素
水平
编码
Ｘ１
料液比／倍
Ｘ２
／ｐＨ
Ｘ３
粒度／目
Ｘ４
流速／ｍＬ·ｍｉｎ－１
下星号臂 －２ ２ １ ５～１０ １
下水平 －１ ３ ２ １０～２４ ２
零水平 ０ ４ ３ ２４～６５ ３
上水平 ＋１ ５ ４ ６５～８０ ４
上星号臂 ＋２ ６ ５ ８０～１００ ５
３．１　单因素实验结果
３．１．１　不同粒度下生物碱浸取率　结果见表 ２。
由实验结果可以看出，粒度越小，浸出生物碱量越
大。虽细粉浸渍提取率最高，但渗漉操作困难。由
于粉末之间的空隙太小，溶剂流动阻力增加，易造成
堵塞。且中粉较粗粉提取率增加不多，故采用粗粉。
表２　不同粒度下生物碱浸取率
粒度／目 Ｃ／ｇ·Ｌ－１ 提取率／％
５～１０ ０．５３ ３３．１３
１０～２４ ０．７８ ４８．７５
２４～６５ ０．８２ ５１．２５
６５～８０ ０．８４ ５２．５
８０～１００ ０．９ ５６．２５
３．１．２　不同 ｐＨ下的生物碱浸取率 结果见表 ３。
从实验结果上看，有ｐＨ越低，浸出率越高之势。但
ｐＨ太低时，将对产业化设备腐蚀严重，且ｐＨ１０较
之ｐＨ３０的浸出率增加不多。故浸润液选用 ｐＨ
３０的ＨＣｌ溶液。
表３　不同ｐＨ下的生物碱浸取率
ｐＨ Ｃ／ｇ·Ｌ－１ 提取率／％
１０ ０．９７ ６０．６３
２０ ０．９６ ６０００
３０ ０．９４ ５８．７５
４０ ０．９ ５６．２５
５０ ０．８５ ５３．１３
３．１．３　不同渗漉速度的生物碱浸取率　结果见表
４。表中可看出当截取４倍料液比的渗漉液时，渗漉
速度越慢，提取越完全，提取率越高。反之，渗漉速
度越快，提取越不完全，提取率越低。中药提取工艺
期待在尽量短的时间内提取出尽可能多的目标物，
显然在本组单因素实验中渗漉流速选取 ３ｍＬ·
ｍｉｎ－１最能满足此条件。
３．１．４　不同料液比的生物碱提取率　结果见表５。
表中可看出５倍，６倍较之４倍料液比的生物碱提
取率无增加或增加甚少未检出；４倍料液比相对于２
倍，３倍提取率提高明显，且比５倍，６倍更节省提取
时间和溶剂用量。
表４　不同渗漉速度的生物碱浸取率
流速／ｍＬ·ｍｉｎ－１ Ｃ／ｇ·Ｌ－１ 提取率／％
５ ０．２７ ８１
４ ０．２８ ８４
３ ０．３ ９０
２ ０．３ ９０
１ ０．３ ９０
表５　不同料液比的生物碱提取率
料液比／倍 Ｃ／ｇ·Ｌ－１ 提取率／％
２ ０．５５ ８２．５
３ ０．３９ ８７．７５
４ ０．３ ９０
５ ０．２４ ９０
６ ０．２ ９０
３．１．５　小结　对于影响苦参生物碱提取率的主要
因素经单因素实验，得出各因素的最优参数为：粗
粉，ｐＨ３０稀ＨＣｌ水溶液渗漉，渗漉速度取３ｍＬ·
ｍｉｎ－１，渗漉液与药材体积比为４倍。
３．２　二次旋转正交实验结果与统计分析
按照２．４的设计进行实验的结果见表６。回归
方差分析见表７。
３．２．１　数学模型　经 ＳＡＳ软件分析，得回归方程
Ｙ１＝９０８３３３３＋３０４１６６７Ｘ１ －１０４１６６７Ｘ２ ＋
３５４１６６７Ｘ３ －１０４１６６７Ｘ４ －０９２７０８３Ｘ１Ｘ１ －
０３１２５Ｘ１Ｘ２ －０３１２５Ｘ１Ｘ３ －００６２５Ｘ１Ｘ４ －
０５５２０８３Ｘ２Ｘ２ ＋０１８７５Ｘ２Ｘ３ －００６２５Ｘ２Ｘ４ －
１１７７０８３Ｘ３Ｘ３－００６２５Ｘ３Ｘ４－１５５２０８３Ｘ４Ｘ４。
３．２．２　模型显著性检验　Ｆ回归 ＜００１，显著，
Ｆ失拟 ＞００５，相关系数为０９６６９，说明模型极显著，
模型拟合度好，方程回归系数显著性表明：料液比、
浸提液 ｐＨ、粉碎粒度、渗漉流速均是影响苦参生物
碱渗漉提取率的极显著因素。
３．２．３　交互效应分析　通过对同归方程的分析可
知，料液比与 ｐＨ、粉碎粒度以及渗漉流速之间存在
拮抗作用；ｐＨ与渗漉流速之间也存在拮抗作用，而
与粉碎粒度之间有协同作用；粉碎粒度与渗漉流速
之间也有协同作用。
３．２．４　最佳提取方案　经模型优化的最佳条件编
码值为 Ｘ１ ＝１６５０３６，Ｘ２ ＝ －１１８５６９，Ｘ３ ＝
１２００７１，Ｘ４＝－０３６９１０，即料液比取５３５倍量，
ｐＨ取１８１，苦参粉碎粒度取６８～８４目，渗漉流速
取３３７ｍＬ·ｍｉｎ－１，通过验证实验得出苦参总生物
碱提取率为９４％，预测值９４２７９３１％，实验误差小
于５％，说明模型可靠。
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表６　二次回归旋转组合设计表和提取率
处理
Ｘ１
料液比
Ｘ２
ｐＨ
Ｘ３
粒度
Ｘ４
流速
提取率
／％
处理
Ｘ１
料液比
Ｘ２
ｐＨ
Ｘ３
粒度
Ｘ４
流速
提取率
／％
１ －１ －１ －１ －１ ７８ １９ ０ －２ ０ ０ ９１
２ －１ －１ －１ １ ７７ ２０ ０ ２ ０ ０ ８３
３ －１ －１ １ －１ ８７ ２１ ０ ０ －２ ０ ７８
４ －１ －１ １ １ ８４ ２２ ０ ０ ２ ０ ９１
５ －１ １ －１ －１ ７８ ２３ ０ ０ ０ －２ ８５
６ －１ １ －１ １ ７６ ２４ ０ ０ ０ ２ ８１
７ －１ １ １ －１ ８６ ２５ ０ ０ ０ ０ ８８
８ －１ １ １ １ ８４ ２６ ０ ０ ０ ０ ９０
９ １ －１ －１ －１ ８７ ２７ ０ ０ ０ ０ ８８
１０ １ －１ －１ １ ８４ ２８ ０ ０ ０ ０ ８９
１１ １ －１ １ －１ ９２ ２９ ０ ０ ０ ０ ８９
１２ １ －１ １ １ ９１ ３０ ０ ０ ０ ０ ８８
１３ １ １ －１ －１ ８４ ３１ ０ ０ ０ ０ ８８
１４ １ １ －１ １ ８２ ３２ ０ ０ ０ ０ ８９
１５ １ １ １ －１ ９２ ３３ ０ ０ ０ ０ ８８
１６ １ １ １ １ ８９ ３４ ０ ０ ０ ０ ９０
１７ －２ ０ ０ ０ ８０ ３５ ０ ０ ０ ０ ９０
１８ ２ ０ ０ ０ ９１ ３６ ０ ０ ０ ０ ８９
表７　回归旋转组合设计实验方差分析表
来源 平方和
自由
度
均差 Ｆ Ｐ
Ｘ１ ２２２０４１７ １ ２２２０４１７ １８４６６８３ ００００１
Ｘ２ ２６０４１６７ １ ２６０４１６７ ２１６５８４２ ００００１３６
Ｘ３ ３０１０４１７ １ ３０１０４１７ ２５０３７１３ ００００１
Ｘ４ ２６０４１６７ １ ２６０４１６７ ２１６５８４２ ００００１３６
Ｍｏｄｅｌ ７３７７２２２ １４ ５２６９４４４ ４３８２５０８ ００００１
失拟 １７５８３３３ １０ １７５８３３３ ２５２２８２６００７２４０７
［参考文献］
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化［Ｊ］．中草药，２００２，７（３３）：５１３．
［７］　 孙文基，张登科，党治稳．天然药物成分提取分离与制备
［Ｍ］．北京：中国医药科技出版社，１９９４：２５３．
［责任编辑　鲍　雷］
《中国药学杂志》２００９年征订启事
《中国药学杂志》是我国药学界创刊最早、发行量较大、反映我国药学各学科进展和动态的最具权威性和影响的综合性学
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Ｃｈｉｎａｉｎｆｏ网，“全国中文核心期刊”。
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