全 文 ：双波长融合 ＨＰＬＣ测定六味地黄丸中马钱苷、
丹皮酚的含量
赵洪芝１，２，孟宪生３，４，叶挺祥１，２，刘征辉１，２，程 奕１，２，罗国安３
（１．天津海世达检测技术有限公司，天津 ３００３８１；
２．天津市现代中药质量检验中心，天津 ３００３８１；
３．清华大学 化学系，北京 １０００８４；４．辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 １１００３２）
［摘要］ 目的：建立同时测定六味地黄丸中的马钱苷和丹皮酚的含量的方法。方法：采用高效液相色谱法，
ＡｇｉｌｅｎｔＺｏｒｂａｘＳＢＣ１８色谱柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ），流动相为乙腈水线性梯度洗脱，柱温３０℃，流速１０ｍＬ·
ｍｉｎ－１，检测波长２３６ｎｍ（马钱苷），２７４ｎｍ（丹皮酚）；使用 ｍａｔｌａｂ编程进行谱图融合。结果：马钱苷与丹皮酚的线
性范围分别为００３６２～１０９（ｒ＝０９９９８）；００４５０～１３５μｇ（ｒ＝０９９９８）；平均回收率分别为 ９７３％（ＲＳＤ
１４％）和１０３０％（ＲＳＤ１９％）。结论：该方法为六味地黄丸的质控提供了更简便、合理、可靠的质控方法。
［关键词］ 六味地黄丸；高效液相色谱法；马钱苷；丹皮酚
［中图分类号］Ｒ２８４．１ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）１９２１８２０４
［收稿日期］ ２００８０３１１
［基金项目］ 天津市科技发展计划项目（０５ＳＹＳＹＧＸ２５０００）
［通讯作者］ 孟宪生，Ｔｅｌ：（０１０）６２７７２２６３，Ｆａｘ：（０１０）６２７８１６
８８，Ｅｍａｉｌ：ｍｘｓｖｖｖ＠１２６．ｃｏｍ
六味地黄丸是中医补益剂中滋补肾阴的代表方
剂，在中药中占有很重要的地位。其配方由熟地黄、
山茱萸（制）、牡丹皮、泽泻、山药、茯苓６味药材组
成，具有滋阴补肾的主要功能；用于肾阴亏损，头晕
耳鸣，腰膝酸软，骨蒸潮热，盗汗遗精，消渴等症。
２００５年版《中国药典》［１］规定测定牡丹皮中的丹皮
酚和山茱萸中马钱苷含量作为质量控制标准。但是
在２个不同色谱条件下，使用不同的前处理方法分
别进行测定。本实验利用二极管阵列检测器可多波
长同时检测特点，根据２种成分不同的光谱特性，进
行双波长覆盖融合［２３］，建立同时测定其指标成分马
钱苷、丹皮酚的含量的方法，并对３批市售六味地
黄丸进行了测定。
１ 仪器与试药
Ｗａｔｅｒｓ２６９５高效液相色谱仪，配置自动进样
器、２９９６二极管阵列检测器、柱温箱、Ｅｍｐｏｗｅｒ２色
谱数据工作站。ＭＥＴＴＬＥＲＴＯＬＥＤＯＸＳ２０５电子天
平（１／１０万，瑞士梅特勒托利多公司）。
丹皮酚对照品（中国药品生物制品检定所，批
号１１０７０８２００５０５）；马钱苷对照品（中国药品生物
制品检定所，批号１１１６４０２００５０３）。六味地黄丸购
于市售，天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制
药厂（批号 Ｂ０５８２２０，Ｂ０５８２０７，Ｂ０５８２２７）。乙腈（色
谱纯，美国Ｆｉｓｈｅｒ），超纯水（ｍｉｌｉｐｏｒｅ）；其他试剂为
分析纯。
２ 方法与结果
２．１ 色谱条件 ＡｇｉｌｅｎｔＺｏｒｂａｘＳＢＣ１８色谱柱（４６
ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相 Ａ水，Ｂ乙腈；线性梯
度洗脱程序：０～８ｍｉｎ，１％ ～１２％ Ｂ；８～２１ｍｉｎ，
１２％ Ｂ，２１～４０ｍｉｎ，１２％ ～９０％ Ｂ；４０～５０ｍｉｎ，
９０％ Ｂ；流速 １０ｍＬ·ｍｉｎ－１；检测波长 ２３６，２７４
ｎｍ；进样量１０μＬ。
２．２ 对照品溶液的制备 分别精密称取马钱苷、丹
皮酚对照品９０５，１１２５ｍｇ置于５０ｍＬ量瓶中，用
甲醇稀释至刻度，作为储备液。精密吸取该储备液
２ｍＬ，置１０ｍＬ量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，
即得。
２．３ 供试样品的制备 取本品水蜜丸切碎，取约１
ｇ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 ２５
ｍＬ，密塞，称定质量，超声提取６０ｍｉｎ，放冷，再称定
质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤
液，即得。
２．４ 谱图融合方法 分别从 Ｅｍｐｏｗｅｒ２工作站中
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第３３卷第１９期
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导出２３６ｎｍ和２７４ｎｍ谱图结果的ａｒｗ格式的数据
文件，将其转化为数据矩阵，再使用Ｍａｔｌａｂ７１进行
编程［４］，相同保留时间色谱峰、按最大峰面积覆盖
融合，使其成为一张能够同时反映２个波长的信息
的色谱图。
２．５ 精密度考察 取同一供试品溶液在上述条件
下连续进样６次，分别对２种物质进行定量测定，考
察精密度，结果马钱苷、丹皮酚的峰面积的 ＲＳＤ分
别为０８％，１０％（ｎ＝６）。
２．６ 重复性考察 平行制备６份供试品溶液，在上
述条件下分别对２种物质进行定量测定，考察方法
的重复性，结果马钱苷、丹皮酚的含量的 ＲＳＤ分别
为１９％，２７％（ｎ＝６）。
２．７ 稳定性考察 同一供试品溶液，分别于０，３，
６，９，１６，２４ｈ对２种物质进行定量测定，考察方法的
样品稳定性，结果马钱苷、丹皮酚的峰面积的 ＲＳＤ
分别为１４％，１２％。
２．８ 线性关系考察 分别精密量取对照品储备液
适量，置于１０ｍＬ量瓶中，用甲醇稀释，制得马钱苷
质量浓度分别为 ３６２，７２４，１４４８，２８９６，３６２，
４３４４，５７９２，７２４，１０８６ｍｇ·Ｌ－１；丹皮酚质量浓
度分别为４５０５，９０１，１８０２，３６０４，４５０５，５４０６，
７２０８，９０１，１３５１５ｍｇ·Ｌ－１的系列混合对照品溶
液；取混合对照品溶液按２．１色谱条件进样１０μＬ。
以对照品进样量（μｇ）为横坐标，峰面积值为纵坐
标，求得回归方程。结果马钱苷、丹皮酚的回归方程
分别为 Ｙ＝１７２×１０６Ｘ－１５２×１０３（ｒ＝０９９９８），
Ｙ＝５１１×１０６Ｘ＋２４５×１０４（ｒ＝０９９９８）。马钱苷在
００３６２～１０９μｇ、丹皮酚在００４５０～１３５μｇ线性
关系良好。
２．９ 加样回收试验 精密称取样品约０５ｇ，分别
加入马钱苷（１５０８ｍｇ·Ｌ－１）、丹皮酚对照品
（３６０２ｍｇ·Ｌ－１）混合溶液 ２５ｍＬ，称定质量，再按
照供试品溶液制备操作，制成供回收率用供试品溶
液，按２．１色谱条件分析，测定样品中含量，计算回
收率，结果见表１。
２．１０ 专属性 按处方配制不含牡丹皮与山茱萸的
空白样品，再按供试品溶液制备方法，制得阴性样品
溶液。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性
样品溶液各１０μＬ，注入高效液相色谱仪，测定结果
见图１～３，阴性样品溶液对含量测定无干扰。
２．１１ 不同批号样品的测定 取３批由市场直接购
表１ ２种成分加样回收率
成分
称样量
／ｇ
样品中
含量／ｍｇ
加入量
／ｍｇ
测得量
／ｍｇ
回收率
／％
平均值
／％
ＲＳＤ
／％
马钱苷 ０５０９８０４４６００３７７００８１５０ ９７９ ９７３ １４
０５０２２０４３９３０３７７００８１０８ ９８５
０５０７８０４４４２０３７７００８１０３ ９７１
０５０６１０４４２７０３７７００８００３ ９４９
０５０５４０４４２１０３７７００８０７７ ９７０
０５０７４０４４３８０３７７００８１５６ ９８６
丹皮酚 ０５０９８０８６４２０９００５１７８３５１０２１ １０３０ １９
０５０２２０８５１３０９００５１７４６２ ９９４
０５０７８０８６０８０９００５１７９７９１０４１
０５０６１０８５７９０９００５１７９７２１０４３
０５０５４０８５６７０９００５１７９４０１０４１
０５０７４０８６０１０９００５１７９４７１０３８
１．马钱苷；２．丹皮酚（图２同）
图１ ２３６，２７４ｎｍ双波长融合后的马钱苷、丹皮酚
混合对照品的ＨＰＬＣ图
图２ ２３６，２７４ｎｍ双波长融合后的样品的ＨＰＬＣ图
图３ ２３６ｎｍ，２７４ｎｍ双波长融合后阴性样品的ＨＰＬＣ图
买的六味地黄丸（水蜜丸），按上述方法测定其中的
马钱苷、丹皮酚２种成分结果见表２。
表２ ３批六味地黄丸中各成分质量分数（ｎ＝３）
ｍｇ·ｇ－１
Ｎｏ． 马钱苷 丹皮酚
Ｂ０５８２２０ ０８８２ １６７
Ｂ０５８２０７ ０８７６ １２３
Ｂ０５８２２７ ０７６１ １１７
３ 讨论
比较了甲醇水，乙腈水，甲醇甲酸，乙腈甲酸
等流动相系统，结果表明乙腈水系统基线平稳，以
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梯度洗脱法将待测物与杂质完全分离，并取得较好
峰形和较高的理论塔板数，效果满意。
分别采用５０％甲醇、７０％甲醇、甲醇为提取溶
媒，不同提取溶媒对马钱苷、丹皮酚的峰面积无影
响，最终确定使用甲醇为提取溶媒；并比较了回流与
超声不同提取方法对含量测定的影响，结果表明，回
流和超声提取结果无明显差异，考虑到超声便于操
作，选用超声作为提取方法。
六味地黄丸为水蜜丸、水丸或蜜丸，实验中加硅
藻土研磨分散和增加超声时间等方法，结果显示，加
硅藻土研磨分散易带来定量操作误差，超声法简便，
增加超声时间就可使其分散并提取完全。对超声时
间进行考察，分别超声４５，６０，７５ｍｉｎ，结果表示超声
６０，７５ｍｉｎ均可达到分散和提取完全的目的，最后确
定超声６０ｍｉｎ。
随着高效液相色谱二级管阵列检测器的普及，
对同一样品可以实现多波长同时检测多种成分，对
被检成分分别采用其最大紫外吸收波长绘制各自色
谱图，以最大峰面积覆盖融合，使其成为一张可以同
时反映多个波长下信息的谱图。此方法简便实用，
可成为中药全面质量评价的重要手段。
２００５年版《中国药典》一部中，六味地黄丸中的
马钱苷和丹皮酚的含量测定是分别使用不同的前处
理方法、不同的流动相体系进行测定的，马钱苷的含
量测定采用紫外吸收波长为２３６ｎｍ，丹皮酚为２７４
ｎｍ，本实验简化了前处理过程，针对复杂的成分采
用了梯度洗脱方式，将马钱苷、丹皮酚在同一色谱条
件下分离，并利用二级管阵列检测器的特点，采用双
波长同时检测，绘制ＨＰＬＣ图，将２张色谱图按最大
峰面积覆盖融合，同时测定六味地黄丸样品中的马
钱苷、丹皮酚含量。方法操作简单，精密度、重复性、
回收率均达到定量分析要求。此方法对同一样品
中，不同组分、多波长同时定量，对中药质量评价具
有现实意义。
［参考文献］
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［２］ 聂 磊，胡 震，罗国安，等．中药指纹图谱的融合技术［Ｊ］．分
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ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｌｏｇａｎｉｎａｎｄｐａｅｏｎｏｌｉｎＬｉｕｗｅｉＤｉｈｕａｎｇｐｉｌｓｂｙＨＰＬＣ
ａｍａｌｇａｍａｔｅｄｏｆｄｏｕｂｌｅＵＶｗａｖｅｓ
ＺＨＡＯＨｏｎｇｚｈｉ１，２，ＭＥＮＧＸｉａｎｓｈｅｎｇ３，４，ＹＥＴｉｎｇｘｉａｎｇ１，２，ＬＩＵＺｈｅｎｇｈｕｉ１，２，ＣＨＥＮＧＹｉ１，２，ＬＵＯＧｕｏａｎ３
（１．ＴｉａｎｊｉｎＨｉｇｈｓｔａｎｄａｒｄＱｕａｌｉｔｙＴｅｓｔｉｎｇＬａｂ．，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００８４，Ｃｈｉｎａ；
２．ＴｉａｎｊｉｎＣｅｎｔｅｒｆｏｒＱｕａｌｉｔｙＴｅｓｔｉｎｇｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００８４，Ｃｈｉｎａ；
３．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＴｓｉｎｇｈｕａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８４，Ｃｈｉｎａ；
４．ＬｉａｏｎｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１００３２，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ（ＨＰＬＣ）ａｍａｌｇａｍａｔｅｄｔｏｄｏｕｂｌｅＵＶｗａｖｅｓｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｌｏｇａｎｉｎａｎｄｐａｅｏｎｏｌｉｎＬｉｕｗｅｉＤｉｈｕａｎｇｐｉｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＡＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．Ｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｗａｓ
ｃａｒｉｅｄｏｕｔｏｎａＡｇｉｌｅｎｔＺｏｒｂａｘＳＢＣ１８ｃｏｌｕｍｎ（５μｍ，４６ｍｍ×２５０ｍｍ）．Ｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆｗａｔｅｒ（Ａ）ａｎｄａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（Ｂ）
ｗｉｔｈｌｉｎｅａｒｌｉｎｅａｒｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎ［０８ｍｉｎ，（Ｂ）ｆｒｏｍ１％ ｔｏ１２％；８２１ｍｉｎ，Ｂｋｅｅｐ１２％；２１４０ｍｉｎ，（Ｂ）ｆｒｏｍ１２％ ｔｏ９０％；４０５０
ｍｉｎ，Ｂｋｅｅｐ９０％ｆｏｒ１０ｍｉｎ］．ＴｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｓＰｈｏｔｏｄｉｏｄｅＡｒａｙｗｉｔｈｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｓｗｅｒｅａｔ２３６ｎｍａｎｄ２７４ｎｍ．Ｔｈｅｃｏｌｕｍｎ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｂｅｉｎｇ３０℃ａｎｄｔｈｅｆｌｏｗｒａｔｅｗａｓ１０ｍＬ·ｍｉｎ－１．Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｔｈｅｃｈｒｏｍａｔｅｒｇｒａｐｈｆｒｏｍ２７４ｎｍａｎｄ２３６ｎｍ，ｗｅａｍａｌｇａｍａｔｅｄｔｈｅ
ｔｗｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｓｂｙｍａｔｌａｂｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔｈｅｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｏｆｌｏｇａｎｉｎａｎｄｐａｅｏｎｏｌｗｅｒｅｌｉｎｅａｒｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｓｏｆ００３６２１０９
μｇ（ｒ＝０９９９８）ａｎｄ００４５０１３５μｇ（ｒ＝０９９９８），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｏｆｌｏｇａｎｉｎａｎｄｐａｅｏｎｏｌｗｅｒｅ９７３％ （ＲＳＤ１４
％）ａｎｄ１０３０％ （ＲＳＤ１９％），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｒｅｅｄｉｆｅｒｅｎｔｂａｔｃｈｅｓｏｆＬｉｕｗｅｉＤｉｈｕａｎｇｐｉｌｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｗｉｔｈｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄ．Ｃｏｎｃｌｕ
ｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓｉｓａｍｏｒｅｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ，ｒｅａｓｏｎａｂｌｅａｎｄｃｒｅｄｉｂｌｅｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ＬｉｕｗｅｉＤｉｈｕａｎｇｐｉｌｓ；ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ｌｏｇａｎｉｎ；ｐａｅｏｎｏｌ
［责任编辑 鲍 雷］
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